PLOS ONE: Minskade kärn fukosylering bidrar till malignitet hos Gastric Cancer

Abstrakt

Syftet med studien är att identifiera N-glykan profilering förändringar i samband med magcancer och undersöka effekterna av kärn fukosylering om biologisk beteenden av mänskliga gastric cancerceller. Totalt 244 patienter, inklusive magcancer, magsår och frisk kontrollgrupp rekryterades. N-glykan profilering från serum och totala proteiner i mag vävnader analyserades genom DNA-sekvensassisterad fluorofor assisterad kapillärelektrofores. Överflödet av den totala kärn fukosylerade rester och uttrycket av enzymer involverade i kärn fukosylering analyserades med lektin blot, kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion, western blöt, immunhistokemisk färgning och lektin-histokemisk färgning. De rekombinanta plasmiderna BNP-fukos transportör och α-1,6-fukosyltransferas (Fut8) konstruerades och transfekterades in i gastric cancercellinjer BGC-823 och SGC-7901. CCK-8 och sårläknings analys har använts för att bedöma den funktionella effekten av kärn fukosylering modulering på celltillväxt och migration. Karakteristiska serum N-glykan profiler hittades i magcancer. Jämfört med den friska kontroll, en trianntenary struktur överflöd, topp 9 (NA3Fb), ökade kraftigt i magcancer, medan den totala förekomsten av kärn fukosylerade rester (sumfuc) minskades. Kärn fukosylerade strukturer peak6 (NA2F) och peak7 (NA2FB) har avlidit i gastriska tumörvävnad jämfört med det i närliggande icke-tumörvävnader. Genomgående, culinaris lins agglutinin (LCA) -bindande proteiner minskade signifikant i serum av magcancer, och proteinnivå Fut8 minskade signifikant i mag tumörvävnad jämfört med i angränsande icke-tumörvävnader. Uppreglering av BNP-Tr och Fut8 kan hämma proliferation, men hade ingen signifikant inverkan på migration av BGC-823 och SGC-7901 celler. Core-fukosylering är nedregleras i magcancer. Uppreglering av kärn fukosylering kunde inhibera proliferation av humana gastriska cancerceller

Citation. Zhao Y-P, Xu X-Y, Fang M, Wang H, Du Q, Yi C-H, et al. (2014) Minskad kärn fukosylering bidrar till malignitet hos magcancer. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10.1371 /journal.pone.0094536

Redaktör: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

emottagen: 19 augusti 2013; Accepteras: 17 mars 2014. Publicerad: 14 april 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Studien stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (nr 81.201.697, 81.101.639 och nr 81.271.925); Vetenskap och teknik kommissionen i Shanghai kommun (nr 10ZR1439100 och nr 11JC1416400) .De finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

konkurrerande intressen.: författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

magcancer (GC) är den fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen [1]. - [3], särskilt utbredd i många asiatiska länder, särskilt Kina [4]. Proteinglykosylering är en av de vanligaste posttranslationella ändringar som gjorts till proteiner [5]. Glykaner kan fästas vid proteiner antingen via en amidgrupp (N-länkad glykosylering) eller en hydroxylgrupp (O-kopplad glykosylering), som uppträder genom olika biosyntetiska vägar och potentiellt ha oberoende funktioner [6]. N-kopplad glykosylering spelar grundläggande roller i många biologiska processer såsom celladhesion, cellmigration, och signaltransduktion [7]. Onormal expression av N-kopplade glykoproteiner har observerats i olika sjukdomar [8] - [10]. Vid ingående karakterisering av N-kopplade glykoproteiner och sjukdomsassocierade glykosylering förändringar, har flera metoder utvecklats. I vår tidigare studie har vi identifierat vissa N-glycan markörer i heptatocellular karcinom (HCC) och koloncancer med hjälp av en kapillär baserad elektrofores kallas DNA-sekvenserare assisterad fluorofor assisterad kapillärelektrofores (DSA-FACE) [11]. Dessutom har det rapporterats att α-1, 6-fukosyltransferas (Fut8) aktivitet och expression ökas i flera humana cancrar, vilket tyder på en roll för detta enzym i tumörutveckling och progression, såsom HCC [12], kolorektal cancer [ ,,,0],13], icke-småcellig lungcancer [14] och äggstocks serös adenocarcinom [15]. Förändrad kärn fukosylering är en av de viktigaste onormala glykosylerade ändring identifierats i maligniteter. Fut8 katalyserar överföringen av fukos från guanosin difosfat (GDP) -fucose till den innersta GIcNAc enligt hybrid- och komplexa N-länkade oligosackarider via en α-1,6-bindning, vilket resulterar i kärn-fukosylerade glykoproteiner [16] - [17] och förändra biologiska funktionen hos resulterande glykoproteiner [18]. Även om många studier har rapporterat samband mellan förändrad kärn fukosylering och andra aggressiva tumörer, så vitt vi vet, påverkan av kärn fukosylering på magcancer fortfarande okänd. I denna studie analyserade vi N-glykan profilering med DSA-ansikte i både serumprover från magcancer, magsår, friska kontroller och vävnadsproteiner från tumörer och angränsande icke-tumörer. Sedan förlänga den funktionella forskning på de identifierade specifika glykosyleringar.

Material och metoder

Etik Statement

Studieprotokollet godkändes av den kinesiska etikkommitté Human Resources på andra militära Medical University. Alla studiedeltagare förutsatt skriftligt informerat samtycke.

Studiepopulation

Totalt 105 patienter med magcancer (n = 80) och magsår (n = 25) rekryterades mellan december 2007 och oktober 2010 vid Chang sjukhus av andra militära Medical University (Shanghai, Kina). Alla fall med magcancer inskrivna var histopatologiskt bekräftad av 2 patologer och fall med magsår rekryteras bekräftades genom gastro. Patienter med magsäckscancer som fick preoperativ kemoterapi, och som hade andra sjukdomar inklusive infektioner uteslöts från studien. Serumprover togs före kirurgiska resektioner. För en kontrollgrupp, var 139 åldersmatchade, friska frivilliga rekryterades från en pool av cancerfria individer som besökte samma sjukhus för en regelbunden fysisk undersökning och som frivilligt att ansluta sig till forskning under samma period. Vi definierade en frisk individ som någon som ansågs fria från sjukdomar (inklusive ingen historia av cancer) vid hälsokontroll. Följande kliniska egenskaper hos försökspersoner erhölls vid tiden för hela bloduppsamling. En sammanfattning av data från dessa ämnen ges i Tabell 1. Utvecklingen av alla patienter med magcancer klassificerades enligt UICC (UICC) TNM staging kriterier för magcancer, 13 patienter (16,25%) hade skede I 24 patienter (30,00%) hade etapp II, 30 patienter (37,5%) hade stadium III, och 13 patienter (16,25%) hade steg IV. Medelåldern för alla patienter var 54,35 ± 6,69 inklusive 60 hanar och 20 honor. Serum samlades upp med användning av ett standardprotokoll från helblod, behandlas genom centrifugering vid 10.000 g under 20 minuter och förvarades vid -80 ° C.

N-glykan profilering från serumproteiner

serumprotein N-glykan analyser utfördes såsom beskrivits tidigare [11]. I korthet var de N-glykaner är närvarande på proteiner i 2 | il av serum frigörs med peptid N-glykosidas-F (PNGasF) (New England Biolabs, Boston, Mass) och märktes sedan med 8-aminonaphtalene-1, 3, 6- trisulfonsyra (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, Calif) .Sialic syra avlägsnades med Arthrobacter ureafaciens sialidas (Roche Bioscience, Palo Alto, Calif), och de behandlade proverna analyserades med DSA-FACE-teknik med användning av ett kapillärelektrofores-baserat ABI3500 Genetisk analysator (Applied Biosystems, Foster City, Calif). De 9 mest intensiva toppar som upptäcktes i alla prover (tillsammans, dessa toppar stod för > 90% av den totala serum N-glykaner) analyserades med GeneMapper programvara (Applied Biosystems). Varje struktur av N-glykan beskrevs numeriskt genom att normalisera sin höjd med summan av höjderna av alla toppar.

Vävnadsprov

Alla vävnader användes i enlighet med de institutionella Review Board föreskrifterna andra militära Medical University. Vävnadsprover erhölls from10 av 80 patienter med magcancer. Vävnadsprover ingår 2 segment, en tumörvävnad och en intilliggande icke-tumörvävnad. Parade vävnadsprover (ca 0,5 x 0,5 x 0,5 cm ^{3, dupliceras för varje prov) väljs antingen frystes omedelbart vid -80 ° C för RNA och protein extraktion eller fixerades i 10% buffrad formalin för upp till 24 timmar och sedan bearbetas till en paraffininbäddad block och förvarades vid rumstemperatur under histokemisk färgning.}

N-glykan profilering från vävnadsproteiner och strukturanalys med användning exoglycosidase digestion

proteiner extraherades från approximativt 25 mg frysta vävnadsprover . Vävnadsprover suspenderades och pestled i lysbuffert innehållande proteashämmare cocktail (Roche Diagnostics, Meylan, Frankrike). Olyserade delar avlägsnades genom centrifugering (12.000 g under 10 minuter vid 4 ° C) två gånger. Koncentrationen av solubiliserade proteiner bestämdes med användning av BCA-kit (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), och de proteinprover vid -80 ° C fram till användning lagras. Totalt 40 ug vävnadsproteiner användes för att fastställa N-glykan profiler med hjälp regelbunden N-glykan profileringsmetoden densamma som den som utförs i serum som beskrivits ovan. Att identifiera kärna-α-1, 6-fukosylerade N-glykanstrukturer, ett lämpligt antal APTS-inmärkta N-glykaner digererades med både Arthrobacter ureafaciens sialidas och bovin njure α-1, 6-fukosidas (Prozyme, San Leandro, Kalifornien , USA). DSA-FACE teknik användes för att analysera de uppslutningsproduktema och GeneMapper mjukvara användes för att analysera höjden av topparna.

RNA-extraktion och kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA extraherades från frusen vävnader och celler, med hjälp av total RNA-extraktion kit enligt tillverkarens anvisningar (Axygen Biosciences, Hangzhou, Kina). Renheten och koncentrationen av RNA bestämdes genom spektrofotometer (Eppendorf, Hamburg, Tyskland), och förvarades sedan vid -80 ° C fram till användning. CDNA syntetiserades med användning ReverTra Ace-α-RT-PCR-kit (Toyobo Co., Osaka, Japan) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Primrar utformades med användning av Primer Express-program (Applied Biosystems; sekvenserna visas i tabell S1). Kvantitativ realtids-PCR utfördes med användning av SYBR® gröna Real-time PCR Master Mix-kit (Toyobo Co., Osaka, Japan) och analyserades på Applied Biosystems 7300 realtids-PCR-system (ABI, Foster City, CA, USA) . Alla analyser utfördes oberoende av varandra i tre exemplar. PCR-cykling bestod av denaturering vid 95 ° C under 5 minuter, följt av 40 cykler vid 95 ° C under 15 sekunder och vid 59 ° C eller 55 ° C under 15 sekunder, och detektion under 45 sekunder vid 72 ° C. Den relativa mängden av Fut8 eller Guanosindifosfat (BNP) -fucose transportör (BNP-Tr) transkript i varje prov normaliserades till den housekeepinggen β-aktin och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) genom att subtrahera den cykeln. Nivåerna av genuttryck bestämdes med användning av Delta-Delta-Ct-metoden. Absoluta transkript uttryck värden bortom 40 cykler ansågs under detekterbara nivåer. Smältkurvor kontrollerades för varje reaktion för att garantera att en enda produkt amplifierades.

Western blöt och lektin-blot

Proteiner extraherades från frusna vävnader med det förfarande som beskrivits ovan, och totalt 50 ig proteiner separerades genom elektrofores i 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel (SDS-PAGE). Geler färgades med Coomassie blue G250 eller proteinerna i gelén överfördes till ett nitrocellulosamembran () för detektering av Fut8 eller procentandelen av kärn-fukosylerade proteiner. För serumprover, har totalt 85 fall från magcancer (n = 80), magsår (n = 25) och frisk kontroll (n = 30) som används för SDS-PAGE och lektin-blot. Membranen blockerades över natten vid 4 ° C med 5% fettfri mjölk-protein eller 5% bovint serumalbumin i Tris-buffrad saltlösning [140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (TBS)] och inkuberades sedan under 2 h vid rumstemperatur med 1:100 utspätt anti-human Fut8 antikropp (15C6, anti-human Fut8, Fujirebio Corp., Japan) eller 5 | j, g /ml av biotinylerad Lens culinaris agglutinin A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, Calif) i TBS innehållande 0,05% Tween-20 (TBST-buffert), och inkuberades därefter med en 1:10,000 utspädning av fluorescensmärkta sekundära antikroppar (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE), eller IRDye 800CW-streptavidin (LI-COR Biosciences) under en timme vid rumstemperatur . Membranen utvecklades med Odyssey IR Imaging System. Anti-beta aktin (1:2000) användes för intern referens antikropp för western-blot. Renat albumin användes som negativ kontroll för lektin-blot och totalt protein färgades med Coomassie-blått användes för att beräkna den procentuella andelen av kärna-fukosylerad protein.

Immunhistokemisk (IHC) infärgning och lektin-histokemisk färgning

De fasta vävnadsprover inbäddade i paraffin skars i 4 mm-sjuka skivor för immunhistokemisk färgning för Fut8 och lektin-histokemisk färgning för LCA. Efter att ha genomgått avparaffinering, rehydrering, endogen peroxidas blockering, och antigenåtervinning (10 mM Tris /1 mM EDTA, pH 9,0, autoklav-behandlad), var proverna inkuberades med en monoklonal musantikropp mot humant Fut8 (1:100) eller biotinylerad LCA (1 :500) över natten vid 4 ° C, och därefter med pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundär antikropp eller Fluorescein märkt streptavidin vid 37 ° C under 30 min. Kärnor motfärgades med hematoxylin eller DRAQ5. Negativ kontroll bestod av identiskt behandlade histologiska sektioner med mus IgG för att ersätta musen Fut8.

Cellinjer och odlings

humana magcancer-cellinjer, BGC-823 och SGC-7901, köptes från Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences och odlades vid 37 ° C under 5% CO _{2 i RPMI 1640-medium och DMEM-medium (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), respektive, med 10% FBS, 1% glutamin och 1% antibiotikalösning.}

Konstruktion av BNP-Tr och Fut8 rekombinanta plasmider och transfektion av gastric cancerceller

pEGFP-N1 BNP-Tr och pEGFP-N1 -Fut8, plasmidvektorn kodar för humant BNP-Tr eller Fut8, genererades genom att sätta in BNP-Tr eller Fut8 cDNA i en pEGFP-N1-vektor (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), som innehåller en CMV-promotor och SV40 tidig promotor, liksom neomycin /kanamycin-resistenta genen av Tn5. Vektorryggraden innehåller också en SV40-ursprunget för replikation i däggdjursceller. Det multipla kloningsstället (MCS) är bredvid den omedelbara tidiga promotorn av CMV. Den humana BNP-Tr eller Fut8-genen klonades från mRNA extraherades med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) från human levervävnad genom att utföra RT-PCR med användning av primrar (tabell S2) i vilket den Xhol eller Kpn I-restriktionsställen ingick, smälta med Xhol eller Kpnl och ligering in i pEGFP-N1. Den pEGFP-N1 BNP-Tr eller pEGFP-N1-Fut8 transfekterades in Escherichia coli DH5a för förstärkning och DNA-sekvensering användes för att säkerställa trohet. Plasmid-DNA framställdes med användning av Qiagen DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. Plasmider transfekterades in i humana magcancer-cellinjer, BGC-823 och SGC-7901 vid 80% konfluens och 5 x 10 ^{5 celler per brunn i en sex-brunnar med hjälp av Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA ) i enlighet med tillverkarens instruktioner. De transfekterade cellerna som uttryckte målgenen bekräftades genom kvantitativ RT-PCR.}

cellprolifereringsanalys

Cellproliferationsanalyser utfördes med Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojin, Japan) enligt tillverkarens instruktioner. Celltillväxt övervakades var 24: e h under 5 dagar, och för varje tidpunkt utfördes i duplikat. Absorbansen mättes för varje brunn vid en våglängd av 450 nm.

sårläkningsanalys

För sårläknings analysen mänskliga gastric cancercellinjer, BGC-823 och SGC-7901 ( 1 × 10 ^{5 celler /35 × 11 mm skålar) såddes och inkuberades under 24 timmar vid 37 ° C och därefter transfekterade med rekombinanta plasmider. Efter att ha uppnått konfluens, var det cellulära skiktet i varje platta repad med hjälp av en plast pipettspetsen. Migrationen av celler vid kanten av repan analyserades på 0, 24 och 48 timmar, var bilder tagna och analyserade av Leica fluorescensmikroskop och matchas bildanalysprogram (Comet analys IV bildanalyssystem, PI, UK).}

Rutin Tumör Maker Detection

Kliniska och biokemiska data från patienterna sammanfattas i tabell 1. Rutin biokemiska tester mättes med användning av standardmetoder och matchade reagens (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan) . tumörmarkör nivåer, inklusive kolhydratantigen 19-9 (CA19-9), cancerogenitet-embryo antigen (CEA), Cytokeratin 19 (CK19), CA125 och CA724, bestämdes på en Roche E170 modul med matchade reagens.

Statistisk analys

Alla kvantitativa variabler uttrycktes som medelvärden ± standardavvikelser inte annat anges. kvantitativa variabler jämfördes med Student t test, variansanalyser (ANOVA), eller icke-parametriska tester. Pearson koefficienterna för korrelation (Spearman koefficienterna för korrelations beräknades för ordningstal kategoriska variabler) och deras sannolikheter ( p
) användes för att utvärdera korrelationer mellan parametrar. Alla rapporterade p
värdena var två-tailed och p
värden < 0,05 ansågs statistiskt signifikant. Statistiska analyser utfördes med SPSS 16.0 för Windows statistikprogram (SPSS).

Resultat

Olika serum N-glykan profilmönster i magcancer, magsår och friska kontroller

Använda DSA-FACE, undersökte vi de N-glykan profiler i desialylerat sera från patienter med magcancer (n = 80), magsår (n = 25), och åldersmatchade friska individer (n = 139). Vi kvantifieras och statistiskt jämfört dessa toppar bland 3 olika grupper. Minst 9 N-glykanstrukturer (toppar) identifierades i alla prover (Figur 1A). Den strukturella analysen av dessa N-glykaner har tidigare publicerats av Callewaert [11]. Den genomsnittliga relativa förekomsten av dessa N-glykanstrukturer beskrevs i Tabell 2. överflöd av strukturer i topparna 2, 3, 5, 6, 7, 8 och 9 visade statistiskt signifikanta skillnader mellan magcancer, magsår och frisk kontroll grupper, vilket tyder på att olika N-glykan mönster dök upp i olika patofysiologiska förhållanden. Jämfört med den friska kontrollgruppen, peak5 (bigalacto biantennary glykan, NA2) och peak9 (förgrening α-1,3-fukosylerade triantennär glykan, NA3Fb) var förhöjda (P < 0,001) (Figur 1B); medan core- fukosylerade toppar, såsom peak2 (agalacto kärna-α-1,6-fukosylerad tudelar biantennary glykan, NGA2FB), peak3 (enkel agalacto core-α-1,6-fukosylerad biantennary glykan, NG1A2F), peak6 (bigalacto kärna -α-1,6-fukosylerade biantennary glykan, NA2F) och peak7 (bigalacto kärn α-1,6-fukosylerade skär biantennary glykan var NA2FB) minskade i magcancer gruppen (P < 0,001). På samma sätt, det överflöd av kärn fukosylerad struktur glykaner heter sumfuc (indikerar totala kärn fukosylerade strukturer, inklusive topp 1, 2, 3, 4, 6, och 7) minskade signifikant i magcancer (P < 0,001) (Figur 1C ). Den magcancer gruppen vidare delas in i 4 undergrupper enligt TNM Staging av UICC för magcancer. Strukturen överflöd och sumfuc förändrades inte signifikant mellan de 4 olika undergrupper; var dock sumfuc minskade gradvis med progression stadier av magcancer (tabell 3).

Samband mellan N-glykaner och rutintumörmarkörer

Hittills CEA fortfarande används i stor utsträckning för screening och övervakning av magcancer. Vi analyserade korrelationerna mellan enskilda N-glykan markör med CA19-9, CEA, CK19, CA125 och CA724. Pearson korrelationsanalys indikerade att CEA förknippades positivt med peak1 (r = 0,19; P < 0,01), och peak9 (r = 0,28; P < 0,01), medan negativt med peak6 (r = -0,18; P < 0,01) och peak8 (r = -0,23; P < 0,01). (tabell 4) katalog

Jämförelse av sumfuc mellan magcancer och andra matsmältningssystemet cancer

Tidigare har vi studerat N-glykan profilering av hepatocellulär cancer (HCC) [19] och kolorektal cancer (CRC) [20]. Överflödet av sumfuc avslöjade statistiskt signifikanta skillnader mellan magcancer (41,32 ± 6,39), HCC (50,99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) och friska kontroll (47,67 ± 5,08) grupper (P < 0,001, tabell 5), vilket indikerar att olika grad av kärn fukosylering dök upp i cancer med olika vävnads ursprung. Bland de 4 grupperna, så var nivån av kärn fukosylering i HCC den högsta, medan fukosylering nivån i magcancer var den lägsta, och var ännu lägre än hos friska kontroll.

N-glykan profilmönster i gastric tumör och icke-tumörvävnader

N-glykan profiler undersöktes i desialylaterat protein från gastric tumör och icke-tumörvävnad. Den tre mest förekommande bigalacto biantennary glykaner visade i serum, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) och preak7 (NA2FB) identifierades också i vävnadsproteiner (Figur 2A). Peak6 och Peak7 bekräftades vara kärn fukosylerade strukturer dervied från peak5 efter behandlats med kärn α-1, 6-fukosidas matsmältning (Figur 2A). Höjderna av dessa tre toppar analyserades med användning GeneMapper programvara. Förhållandet mellan peak6 till peak5 var lägre i tumörvävnader än i intilliggande icke-tumörvävnader (0,83 ± 0,18 vs. 1,05 ± 0,42, figur 2B), såväl som förhållandet mellan peak7 till peak5 (0,13 ± 0,06 vs. 0,16 ± 0.04, figur 2C). Men det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader (P > 0,05). Mellan tumör och icke-tumörvävnad

minskade nivåer av totalt kärn fukosylering identifierats i både serum och vävnader från magcancer

Eftersom LCA specifikt kan känna igen glykoproteiner med α-1,6-fukosylerade bunden N-acetyl-D-glukosamin-asparagin (GlcNAc-Asp) i trimannosyl kärna, undersökte vi de totala kärna fukosylerade proteiner från serum och vävnader i magcancer med hjälp av LCA att validera konstaterandet i DSA-FACE. I serum, graden av LCA-bindande kärn fukosrester var lägre i magcancer än i magsår och friska kontroller (Figur 3A). Total kärna fukos överflöd trendas också att vara lägre i gastriska tumörer jämfört med i parade angränsande vävnader (Figur 3B). För att avgöra om den förändring av den totala kärn fukosylering i gastric tumörvävnad är relevant för förändringar av glykosylering biosyntesvägen, var kvantitativ RT-PCR användes för att analysera förekomsten av däggdjur Fut8 och BNP-Tr i gastriska tumörer och angränsande vävnader. Resultaten visade att ingen signifikant skillnad av Fut8 och GDP-Tr-mRNA-expression observerades mellan tumörer och angränsande vävnader (Figur 3C och 3D). Den relativa förekomsten av Fut8 protein illustrerades med användning av western blöt (rådata visades i figur S1). Den Fut8 i angränsande vävnader var signifikant högre än i tumörvävnader (P < 0,05) (figur 3E). Immunohistokemi visade att Fut8 starkt positivt uttrycktes vid den luminala gränser icke-tumörgastriska celler (figur 4B), men det svagt positivt uttrycks i tumörceller (Figur 4A). Uttrycket av LCA-bindande kärn fukosylerade glykoproteiner var högre hos icke-tumör gastric celler än i tumörceller (Figur 4C, 4D). Så var den högsta halt av kärn fukosylering identifierat minskade både sera och vävnader från magcancer.

Effekt av Fut8 och BNP-Tr proliferation och migration i humana gastriska cancercellinjer

humana gastriska cancercellinjer, BGC-823 och SGC-7901 användes in vitro-studie. Eftersom BGC-823 uttryckt lägre BNP-Tr medan SGC-7901 uttryckte lägre Fut8 i vår pilot forskning, var pEGFP-N1 BNP-Tr transfekterades i BGC-823 för överuttrycker BNP-Tr och pEGFP-N1- Fut8 var transfekterades in i SGC-7901 för överuttrycker Fut8. Rekombinanta uttryck framgångsrikt uppnått framgår av reportergenen GFP uttryck (Figur S2). För att undersöka den möjliga deltagande av BNP-Tr och Fut8 i tumörtillväxt och migration, var BGC-823 och SGC-7901 celler undersöktes efter transfektion med hjälp av CCK-8 och sårläkningsmigrationsanalys respektive. Resultaten visade att uppreglering av BNP-Tr minskade BGC-823 proliferation vid 2-5 dagar efter transfektion och uppreglering av Fut8 minskade SGC-7901 proliferation vid 2 dagar efter transfektion (figur 5A och 5B). Dessa resultat indikerade att högt uttryck av BNP-Tr och Fut8 kunde undertrycka proliferationen av humana gastriska cancerceller. Sårläknings analys visade att BNP-Tr och Fut8 har ingen betydande inverkan på migration i BGC-823 och SGC-7901 vid 48 h efter behandling (Figur 5C och 5D).

Diskussion

Glykosylering är en av de vanligaste posttranslationella modifieringar dök upp i ca 70% av alla kända proteiner. Förändringar i glykosylering spelar en roll i en mångfald av biologiska fenomen såsom tumörcellmetastaser, intracellulär kommunikation och inflammation [21] - [23]. Fler och fler studier visar att förändringar i glykosylering och nivåerna av glykosyltransferaser aktiviteter som härrör från malign transformation är relevanta för mänskliga maligniteter [24] - [25]. DSA-FACE är en enkel och effektiv teknik för mätning av N-glykan förändringar i serum. Vi använde tidigare denna teknik för att hjälpa till vid diagnostisering av HCC och CRC [19] - [20]. I den aktuella studien, vi använde det för att analysera karakteristiska N-kopplad profilering mönster i magcancer. Resultaten visade att det fanns betydligt olika N-glykan profilering mönster bland magcancer, magsår och friska kontroller. Bland dessa olika profilering mönster, var peak9 och sumfuc fann ändras i ett motsatt mönster i magcancer jämfört med dem i kontrollgruppen. Som framgår av tidigare forskning, var peak9 samband med utvecklingen av sorter av maligniteter, bekräftade vi återigen att triantennär N-glykan struktur överflöd ökat markant i magcancer och denna förändring hade uppenbarats för korreleras med CEA, som är en vanligast begagnade CRC markör och är en mycket heterogen glykoprotein som innehåller 60% kolhydrater [26]. I enskilda N-glykan struktur överflöd analys konstaterade vi att sumfuc minskade signifikant i magsäckscancer jämfört med kontroller. För ytterligare validera denna upptäckt genomförde vi lektin blot i både serum och vävnader. Genom att använda HCC serum som en positiv kontroll, observerade minskade vi fukosylering av N-glykaner på totala proteiner i sera från magcancer. En liknande trend avslöjades i gastriska tumörvävnader. Dessa resultat överensstämmer med våra tidigare rapporter om CRC [20]. Resultaten är dock i motsats till tidigare rapporter om cancer med andra vävnads ursprung. Ökningarna i fukosylerade oligosackarider enligt patologiska tillstånd har rapporterats av andra och vår grupp [19]. Den fukosylerade AFP (AFP-L3) har använts som HCC markör i klinisk praxis [25]. De contradictories av Core-fukosylering nivåer dök upp i olika cancerformer kan bero på de olika roller som olika vävnader, t.ex. Levern är det största organ som ansvarar för att producera glykoproteiner förutom immunglobulin-producerande B-lymfocyter [27] - [28].

fukosylering katalyseras av fucosyltransferases, guanosin 5'-difosfat (BNP) -fucose syntetiska enzymer och BNP-fukos transportör (s). BNP-fukos är en gemensam donatorsubstrat för alla fucosyltransferases. Efter GDP-fukos har syntetiserats i cytosolen, är det transporteras till Golgi-apparaten genom GDP-Tr för att tjäna som ett substrat för fucosyltransferases [17], [29]. Därför är BNP-Tr en nyckelfaktor för BNP-fukos syntetiserade vägen. Fut8 är den enda fukosyltransferas inblandade i kärn fukosylering [29]. Vi upptäckte minskade Fut8 proteinuttryck i tumörvävnad, som stödde våra resultat i sera. Men Fut8 mRNA-uttryck var ingen signifikant skillnad i gastriska tumörer och angränsande vävnader. Glykosylering är högreflekterande av förändringar i miljön av en cell. Epigenetiska modifieringar av genomet stabilt överförs till dotterceller utan krav på genetiska sekvensförändringar. [30] För att klargöra huruvida den minskade kärn fukosylering spelar en viktig roll i karcinogenes av magcancer, utökade vi studien i mag cellinjer in vitro. Vi fann att uppreglerade BNP-Tr och Fut8 uttryck i humana gastriska cancerceller kan leda till låg spridning. Men vi kunde inte hitta någon inverkan av kärn fukosylering på cellmigration. Dessa resultat bidra till att förklara den potentiella mekanismen varför minskad kärn fukosylering dök upp i magcancer och denna nedregleras kärn fukosylering korrelerad med några elakartade biologiska beteende gastric cancerceller.

På senare år finns det flera rön avslöjar att förändringar av glykosylering spelar en viktig roll i utvecklingen av sjukdomar förutom levercancer och autoimmuna sjukdomar. De betydande förändringar i glykosylering av utsöndrade glykoproteiner ingår en minskning av kärn fukosylering, ökad förgrening och ökad sialylering, och modifieringar av epigenetiska maskiner har en djupgående inverkan på glykanstrukturer genereras av celler under äggstockscancer progression [30]. Nivåerna av kärn fukosylerade biantennary glykaner och α-2,3-länkade sialinsyror ökade signifikant i prostatacancer. [31] Det var en ökning med 40% i kärn fukosylering vid den nationella sialylerade biantennary glykaner i bukspottkörtelcancer serum, vilket skulle tyda på en delmängd av tumörassocierade glykoformer [32].

Nyligen funktion av kärn fukosylering rapporterades vara förknippade med funktionen hos EGFR [33]. Bindningen av EGF till dess receptor kräver kärn fukosylering av N-glykaner av EGFR.

• PLOS Genetics: nedärvda mutationer i MAP3K6 är associerade med Familial Gastric Cancer
• PLOS ONE: Upptäckt av tumörmarkörer för ventrikelcancer genom Proteomics