PLoS ONE: sumažėjęs Core Fucosylation Prisideda prie piktybinių skrandžio Cancer

Anotacija

Tyrimo tikslas yra nustatyti N glikaną profiliavimo pokyčius, susijusius su skrandžio vėžiu ir ištirti Core fucosylation poveikį biologinės elgesys žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. A 244 dalykų, įskaitant skrandžio vėžiui, skrandžio opa ir sveikų viso buvo įdarbinti. N-glikaną profiliavimas iš kraujo serumo ir visų baltymų skrandžio audinių buvo analizuojami DNR sequencer servo Fluoroforas servo kapiliarų elektroforezės. Iš viso Core fucosylated likučių gausa ir fermentų, dalyvaujančių Core fucosylation išraiška buvo analizuojami su lėktino dėmė, kiekybiniu atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininę reakciją, Vakarų dėmė, Imunohistocheminiais dažymo ir lėktino-histocheminiam dažymo. Rekombinantinės plazmidės BVP-fukozė transporteriu ir alfa-1,6-fucosyltransferase (Fut8) buvo pastatytas ir perkeltų į skrandžio vėžio ląstelių linijų BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901. CCK-8 ir žaizdų gijimą tyrimas buvo naudojamas įvertinti funkcinį poveikį pagrindinio fucosylation moduliavimo apie ląstelių proliferaciją ir migraciją. Būdinga serumo N-glikaną profiliai buvo rasti skrandžio vėžio. Palyginti su sveikos kontrolė, trianntenary struktūra gausa, piko 9 (NA3Fb), buvo žymiai padidėjęs skrandžio vėžio, o sumažėjo bendras gausumas Core fucosylated likučių (sumfuc). Core fucosylated konstrukcijos, peak6 (NA2F) ir peak7 (NA2FB) buvo mirusiojo skrandžio navikų audiniuose, kai, palyginti su gretimų ne navikų audiniuose. Nuosekliai, objektyvas culinaris antikūniai (LCA) -binding baltymai buvo ženkliai sumažėjo serumo skrandžio vėžio, ir baltymų lygis Fut8 buvo žymiai sumažėjo skrandžio navikų audiniuose, palyginti su gretimų ne navikų audiniuose. Ląstelę BVP-TR ir Fut8 gali slopinti platinimu, tačiau neturėjo didelės įtakos migracijos BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių. Core fucosylation žemyn reguliuoja skrandžio vėžio. Ląstelę Core fucosylation gali slopinti proliferaciją žmogaus skrandžio vėžio ląstelių

nurodomoji dalis:. Zhao Y P Xu X Y Fang M Wang O Jūs Klausimas Yi, C-H, et al., (2014) Sumažėjęs Core Fucosylation Prisideda prie piktybinių skrandžio vėžio. PLoS ONE 9 (4): e94536. Doi: 10,1371 /journal.pone.0094536

redaktorius Salvatore V. Pizzo, Duke universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo rugpjūčio 19, 2013 m Priimtas kovo 17 2014 m Paskelbta: Balandžio 14, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Zhao et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. The tyrimą parėmė Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 81201697, 81101639 ir Nr 81271925); Mokslo ir technologijų komisija Šanchajaus savivaldybės (Nr 10ZR1439100 ir Nr 11JC1416400) .Sriegines finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.: autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

skrandžio vėžys (GC) yra ketvirtoji dažniausia vėžio ir antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [1]. - [3], ypač paplitusi daugelyje Azijos šalių, ypač Kinija [4]. Baltymų glikozilinimo yra vienas iš labiausiai paplitusių posttranslational atliktus pakeitimus baltymų [5]. Glikanų gali būti pritvirtinta prie baltymų arba per amido grupės (N-glikozilinimo) arba hidroksilo grupe (O-glikozilinimo), kuris atsiranda per skirtingus biosintezės kelius ir potencialiai nepriklausomai, funkcijas [6]. N-glikozilinimo vaidina pagrindinius vaidmenis daugelyje biologinių procesų, pavyzdžiui, ląstelių sukibimą, ląstelių migracijos ir signalo perdavime [7]. Nenormalus išraiška N-susijusi gliukoproteinais buvo pastebėta, kad įvairių ligų [8] - [10]. Po nuodugnaus apibūdinimo N susijusių glikoproteinų ir ligų susijusių glikozilinimo pokyčių, keletas metodikos buvo sukurtos. Mūsų ankstesniame tyrime, mes nustatėme tam tikrus N glikaną žymenis heptatocellular karcinoma (HCC) ir storosios žarnos vėžio naudojant kapiliarinę remiantis elektroforezė vadinamas DNR sekos nustatymo, padeda Fluoroforas servo kapiliarų elektroforezė (PSI akį) [11]. Be to, ji buvo pranešė, kad α-1, 6-fucosyltransferase (Fut8) veikla ir išraiška yra išaugo keliose žmogaus vėžio, tai rodo, tam tikrą vaidmenį šio fermento auglio vystymąsi ir progresavimo, pavyzdžiui, HCC [12], gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio [ ,,,0],13], nemaža ląstelių plaučių vėžys [14] ir kiaušidžių Serozs adenokarcinoma [15]. Pakitęs pagrindinio fucosylation yra vienas iš svarbiausių nenormalus glikozilinto modifikacijos, nurodyta piktybinių navikų. Fut8 katalizuoja fukozė perkėlimas iš guanozinas difosfato (BVP) -fucose į giliausią GlcNAc hibridinių ir sudėtingų N-susijusi oligosacharidų per alfa-1,6-jungtį, todėl pagrindinio fucosylated glikoproteinų [16] - [17] ir pakeisti biologinę funkciją, dėl glikoproteinų [18]. Nors daugelis tyrimų duomenimis tarp pakitusiu Core fucosylation ir kitų agresyvių navikų asociaciją, mūsų žiniomis, iš pagrindinio fucosylation skrandžio vėžio įtaka lieka nežinoma. Šiame tyrime mes analizuojami N glikaną profiliavimo su PSI akį į abi serumo mėginius iš skrandžio vėžiui, skrandžio opa, sveikų ir audinių baltymams, iš navikų ir gretimų ne navikų. Tada pratęsti funkcinę tyrimus nuo nustatytų konkrečių glycosylations.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

Tyrimo protokolas buvo patvirtintas Kinijos etikos komiteto Žmogiškųjų išteklių antroje Karo medicinos universitetas. Visi tyrimo dalyviai jeigu parašyta informuoto sutikimo.

Studijų gyventojų

Iš viso 105 pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu (n = 80) ir skrandžio opa (N = 25), buvo įtraukti nuo 2007 gruodžio ir spalio 2010 metu Changzheng ligoninės Antrojo karo medicinos universiteto (Šanchajus, Kinija). Visais atvejais, kai skrandžio vėžio mokosi buvo histopathologically patvirtino 2 patologai ir atvejais su skrandžio opa įdarbintų patvirtino gastroscope. Pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu, kuriems buvo priešoperacinė chemoterapija, ir kurie turėjo kitų ligų, įskaitant infekcijas, nebuvo įtraukti į tyrimą. Serumo mėginiai buvo gautas iki chirurginės rezekcijos. Dėl kontroline grupe, 139 Amžius atitiko, sveikiems savanoriams buvo įtraukti nuo vėžio nemokamai asmenų baseinas lankęsis tą pačią ligoninę reguliariai fizinę apžiūrą, ir kurie savanoriai prisijungti prie tyrimus tuo pačiu laikotarpiu. Mes nustatėme sveiką individą kaip kažkas, kas buvo laikoma be ligų (įskaitant be vėžio istorijos), esant sveikatos pasitikrinti. Tokie klinikiniai charakteristikos subjektų, buvo gauta iš viso kraujo surinkimo metu. Duomenų, iš šių dalykų santrauka pateikiama 1 lentelėje visų pacientų, sergančių skrandžio vėžiu progresavimo buvo klasifikuojami pagal Tarptautinės vėžio kontrolės (UICC) TNM sustojimo kriterijus skrandžio vėžio, 13 pacientų (16,25%) turėjo etape Sąjungos Aš, 24 pacientai (30,00%) buvo II etapas, 30 pacientų (37,5%) turėjo III etapas, ir 13 pacientų (16,25%) buvo IV stadijos. Vidutinis amžius visiems pacientams buvo 54,35 ± 6,69, įskaitant 60 vyrų ir 20 moterų. Serumo buvo surinkti tiriant standartinis protokolas iš kraujo, apdorojamos 10.000 g centrifuguojant 20 minučių, ir saugomi -80 ° C temperatūroje.

serumo baltymų N-glikaną, analizė buvo vykdomi, kaip aprašyta anksčiau [11]. Trumpai N-glikanų egzistuojantys šio straipsnio 2 įxL serumo baltymų buvo išleistas su peptidų N-glycosidase-F (PNGaseF) (New England Biolabs, Boston, Mass) ir tada pažymėtas 8-aminonaphtalene-1, 3, 6- trisulphonic rūgštis (APTS) (Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija) .Sialic rūgštis buvo pašalintas Arthrobacter ureafaciens sialidase (Roche biologijos, Palo Alto, Kalifornija) ir perdirbti mėginiai buvo analizuojami su PSI akį technologija naudojant kapiliarinę elektroforezės-paremtą ABI3500 genetinių analizatorius (Applied Biosystems Foster Miestas, Kalifornija). 9 intensyviausi viršūnės, kurios buvo aptiktos visuose mėginiuose (kartu šios viršūnės sudarė > 90% visų serumo N-glikanus) buvo analizuojami naudojant GeneMapper programinė įranga (taikomoji BIOSYSTEMS). Kiekvienas N-glikaną struktūra buvo aprašyta Skaitmeninio normalizuojant savo ūgį prie visų smailių suma.

Audinių mėginiai

Visi audiniai buvo naudojami laikantis institucinės ekspertizės valdyba nuostatų Antrojo Karo medicinos universitetas. Audinių mėginiai buvo paimti from10 80 pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu. Audinių mėginiai įtraukti 2 skiltelės, naviko audinį ir greta ne naviko audinį. Poriniai audinio mėginiai (maždaug 0,5 × 0,5 × 0,5 cm, ^{3, dubliuoti kiekvieno mėginio) buvo iš karto užšaldyti iki -80 ° C RNR ir baltymų gavybos arba fiksuotas 10% buferiniame formalino iki 24 valandų ir tada parinkti perdirbti į parafino įterptųjų bloko ir laikyti kambario temperatūroje histocheminiu dažymo.}

N-glikaną profiliavimas iš audinių baltymų ir struktūrinės analizės naudojant exoglycosidase virškinimą

baltymai buvo paimti iš maždaug 25 mg šaldytų audinio egzempliorių , Audinių mėginiai buvo sustabdytas ir pestled į lizės buferiniame tirpale, kurio sudėtyje yra proteazės inhibitoriais kokteilis (Roche Diagnostics, Meylan, Prancūzija). Unlysed dalys buvo pašalinti centrifuguojant (12000 g 10 minučių, esant 4 ° C temperatūroje) du kartus. Iš tirpinamos baltymų koncentracija buvo nustatoma naudojant BCA rinkinį (Pierce Biotechnologija /Thermo Fisher Scientific ", Rockford, IL), o baltymų mėginiai buvo laikomi -80 ° C iki naudojimo. A 40 mikrogramų audinių baltymų, kad bendras nustatyti buvo panaudoti N-glikaną, profilius naudojant reguliariai N-glikaną, profiliavimo iš tos pačios kaip, kad atliekamas aukščiau aprašytą serume. Norėdami nustatyti pagrindinio alfa-1, 6-fucosylated N glikaną struktūras, atitinkamą skaičių Apts žymėto N-glikanus buvo suardomas tiek Arthrobacter ureafaciens sialidase ir galvijų inkstų α-1, 6 fukosidazei (Prozyme San Leandro, CA , JAV). PSI akį technologija buvo naudojama analizuoti virškinimo produktus ir GeneMapper programinė įranga buvo naudojama analizuoti smailių aukštį.

RNR gavybos ir kiekybinė realaus laiko PGR

Iš viso RNR buvo paimti iš sušaldyti audiniai ir ląstelės, naudojant bendrą RNR išskyrimo rinkinį pagal gamintojo nurodymus (Axygen gyvosios gamtos mokslai, Hangdžou, Kinija). Grynumo ir koncentracija RNR, buvo nustatomas pagal spektrofotometru (Eppendorfo, Hamburg, Vokietija), ir tada prie -80 ° C temperatūroje, kol naudojimo. KDNR buvo susintetintas naudojant ReverTra Ace-α-AT-PGR rinkinys (Toyobo Co, Osaka, Japonija), pagal gamintojo nurodymus. Gruntai buvo sukurta naudojant Gruntas Express programą (Applied BIOSYSTEMS; sekos rodomi S1 lentelėje). Kiekybinis realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant SYBR® Žalioji Realaus laiko PGR magistras Mix komplektas (Toyobo Co., Osaka, Japonija) ir buvo analizuojami Applied Biosystems 7300 realiojo laiko PGR sistema (ABI Foster Miestas, CA, JAV) , Visi tyrimai atliekami buvo vykdoma nepriklausomai tris kartus. PGR dviračiu sudarė denatūruojant 95 ° C temperatūroje 5 minutes, po to 40 ciklų, esant 95 ° C temperatūroje 15 sekundžių ir 59 ° C arba 55 ° C temperatūroje 15 sekundžių, ir aptikimo 45 sekundžių 72 ° C temperatūroje. Santykinis dydis Fut8 ar guanozinas difosfatas (BVP) -fucose transporteris (BVP-TR) nuorašai kiekviename mėginyje buvo normalizuotas į namų ruošos genų beta-aktino ir gliceraldehid-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) atimant ciklą. Genų ekspresijos lygis buvo nustatomas naudojant "Delta Delta Ct metodą. Absoliučios stenograma išraiškos vertes nei 40 ciklų buvo nagrinėjama toliau aptikti lygiais. MELT kreivės buvo tikrinama kiekvieno reakcija garantuoti, kad vienas produktas buvo papildyta.

Vakarų dėmė ir Lectin dėmė

Baltymai buvo paimti iš šaldytų audinių, pirmiau aprašytą procedūrą, o 50 iš viso mikrogramo baltymai buvo atskirtos elektroforezės 10% natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio (SDS-PAGE). Geliai buvo tamsintas su coomassie mėlyna G250 arba gelio baltymai buvo perkeltas į nitroceliuliozinio membranos () už Fut8 aptikimo arba Core fucosylated baltymų procentas. Serumo mėginių, 85 atvejais iš skrandžio vėžio (n = 80), skrandžio opa (n = 25) ir sveiko kontrolinę (n = 30) iš viso buvo naudojamas už SDS-PAGE ir lektino susilpninimas ir. Membranos buvo užblokuotas per naktį 4 ° C temperatūroje, turintis 5% Nonfat pieno baltymų arba 5% galvijų serumo albumino Tris-buferio druskų tirpalu [140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, (TBS)] ir tada inkubuojami 2 valandą kambario temperatūroje su 1:100 atskiesti anti-žmogaus Fut8 antikūnas (15C6, anti-žmogaus Fut8, Fujirebio Corp, Japonija) arba 5 mikrogramų Biotinilinta objektyvas /ml culinaris antikūniai A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija) į TBS, kurių sudėtyje yra 0,05% Tween-20 (TBST buferis), ir tada inkubuojamos su 1:10,000 praskiedus fluoresouojančio antrinių antikūnų (LI-COR biomokslai, Linkolnas, nE) arba IRDye 800CW-streptavidino (LI-COR biomokslai) 1 valandą kambario temperatūroje , Membranos buvo sukurta su Odyssey IR Imaging System. Anti-beta aktino (1:2000) buvo naudojama vidaus atskaitos antikūnų Vakarų-dėmė. Išgrynintas albuminas buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė lėktino dėmė ir bendro baltymo tamsintas su coomassie mėlyna buvo naudojamas apskaičiuoti core-fucosylated baltymų procentą.

Imunohistocheminis (IHC) dažymo ir lėktino-histocheminiam dažymo

fiksuoti audinio mėginiai įterptųjų parafinu buvo supjaustyti 4 mm sergančių griežinėliais imunohistochemiškai dažymą už Fut8 ir lėktino-histocheminiam dažymo GCA. Atlikus deparaffinization Rehidratacija, endogeninio peroksidazės blokavimą ir antigeno priìmimas (10 mM Tris /1 mM EDTA, pH 9.0, autoklave elgiamasi), bandiniai buvo inkubuojamos su pele monokloniniai antikūnai prieš žmogaus Fut8 (1:100) arba biotinilintu LCA (1 :500) per naktį 4 ° C, ir tada su krienų peroksidazės-konjuguoto antrinio antikūno arba fluoresceiną streptavidinu esant 37 ° C temperatūroje 30 min. Branduoliai buvo counterstained hematoksilinu ar Draq5. Neigiama kontrolė buvo sudarytas iš identiškai gydytų histologinių sekcijų su pelės IgG pakeisti pelės Fut8.

Mobilaus ryšio linijos ir kultūra

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901, buvo nupirkta iš Šanchajaus ląstelės biologijos institutas, Kinijos mokslų akademijos ir kultūringas 37 ° C temperatūroje 5% CO _{2 RPMI 1640 vidutinio ir DMEM terpe (INVITROGEN Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija), atitinkamai 10% FBS, 1% glutamino ir 1% antibiotiko tirpalo.}

Statybinės BVP-TR ir Fut8 plazmides ir transfekciją skrandžio vėžio ląstelių

pEGFP-N1-BVP-TR ir pEGFP-N1 -Fut8, plazmidės vektorius kodavimas žmogaus BVP-TR arba Fut8, buvo sukurtas įterpti BVP-TR arba Fut8 kDNR į tam pEGFP-N1 vektoriaus (Klontex Laboratories, Inc., Mountain View, CA, JAV), kuriame yra CMV rengėjo ir SV40 anksti promotorius, taip pat neomicino /kanamicino atsparumas genas TN5. Vektoriaus pagrindas sudėtyje taip pat yra SV40 replikacijos žinduolių ląstelėse. Daugkartinis klonavimas svetainė (MG), yra šalia nedelsiant pradžioje propaguotojo CMV. Žmogaus BVP-TR arba Fut8 genas buvo klonuotas iš mRNR ekstrahuotas TRIzol reagento (Invitrogen, Carlsbad, JAV) iš žmogaus kepenų audinio atliekant RT-PGR naudojant pradmenis (lentelė s2), kurioje Xho I arba KPN I restrikcijos svetainės buvo įtraukti, virškinti su Xho I arba KPN I ir liguojant į pEGFP-N1. PEGFP-N1-BVP-TR arba pEGFP-N1-Fut8 buvo pernešta į Escherichia coli DH5α už amplifikacijos ir DNR sekos buvo naudojamas siekiant užtikrinti ištikimybę. Plazmidės DNR buvo parengta naudojant Qiagen DNR mini rinkinys (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas. Plazmidės buvo pernešta į žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų, BGC-823 ir SGC-7901 80% santakoje ir 5 × 10 ^{5 ląstelės per gerai Šešių šulinėlių plokštelės naudojant Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Jungtinės Amerikos Valstijos ) pagal gamintojo instrukcijas. Transfekuoti ląstelių, kurios išreikštos tikslinio geno patvirtino kiekybinio RT-PGR.}

ląstelių proliferacija tyrimas

ląstelių proliferaciją tyrimai buvo atliekami su Mobilusis skaičiavimas komplektas-8 (CCK-8, Dojin, Japonija) pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelių augimas buvo stebimas kas 24 h per 5 dienas, ir kiekviename laiko taške buvo atliktas du kartus. Absorbcija buvo matuojamas kiekvieno gerai esant 450 nm bangos ilgiui.

Žaizdų gijimo tyrimas

Dėl žaizdų gijimą testą, žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ( 1 × 10 ^{5 ląstelių /35 × 11 mm patiekalai) buvo pasėjamos ir inkubuojami 24 valandas 37 ° C temperatūroje ir tada transfekuotos su rekombinantinių plazmidžių. Pasiekus santaką, korinis sluoksnis kiekvienos plokštelės buvo subraižyti, naudojant plastikinį pipetės galiuką. Užtikrinta, kad ląstelės migracija ties nulio krašto buvo analizuojami 0, 24 ir 48 valandų,, vaizdai buvo perimta ir analizuojami Leica fluorescencijos mikroskopu ir suderinti vaizdo analizės programinė įranga (Kometa Analizės IV Vaizdo analizės sistema, PI, Jungtinė Karalystė).}

Įprastiniai naviko gamintojas aptikimas

Klinikiniai ir biocheminiai duomenys pacientams yra apibendrinti 1 lentelėje Eiliniai biocheminiai bandymai buvo matuojamas naudojant standartinius metodus ir suderinti reagentai ( "Hitachi 7600 analizatorius (" Hitachi ", Tokijas, Japonija) . naviko žymenų lygis, įskaitant angliavandenių antigeno 19-9 (CA19-9), kancerogenezės-embriono antigeno (CEA), citokeratino 19 (CK19), CA125 ir CA724, buvo nustatytas ant "Roche E170 modulinės su suderintų reagentus.

Statistinė analizė

buvo išreikštas Visi kiekybiniai kintamieji, kaip tai ± standartiniai nuokrypiai, jeigu nenurodyta kitaip. kiekybiniai kintamieji buvo palyginti su Stjudent'ot bandymų, analizių dispersinė (ANOVA), ar neparametrinės bandymus. Pearsono koreliacijos koeficientus (Ietininkas koeficientai koreliacija buvo apskaičiuojamas skaitvardžiai kategorinių kintamųjų) ir jų tikimybę ( p
) buvo naudojamas įvertinti koreliacijas tarp parametrų. Visi pateikti p
vertės buvo 2-tailed, ir P
vertės < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas. Statistinė duomenų analizė atlikta SPSS 16.0 for Windows statistikos programinė įranga (SPSS Inc.).

Rezultatai

Įvairūs serumo N-glikaną profiliavimas modeliai skrandžio vėžiui, skrandžio opa ir sveikų

Naudojant DSA akį, mes išnagrinėjome N glikaną profilius desialylated serume pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu (n = 80), skrandžio opa (n = 25), ir amžius atitiko sveikų asmenų (n = 139). Mes kiekybiškai ir statistiškai palyginti šiuos pikus tarp 3 skirtingų grupių. Ne mažiau kaip 9 N glikaną statiniai (Peaks) buvo nustatyta visuose mėginiuose (1A pav.) Struktūrinis analizė šių N-glikanus buvo paskelbtas anksčiau Callewaert [11]. Vidutinis santykinis gausumas iš šių N-glikaną struktūrų buvo aprašyta 2 lentelėje struktūrų gausa smailių 2, 3, 5, 6, 7, 8 ir 9, pastebėtą statistiškai reikšmingų skirtumų tarp skrandžio vėžio, skrandžio opa, ir sveiką kontrolę grupės, nurodant, kad skirtingi N-glikaną modeliai pasirodė įvairių patofiziologinių sąlygomis. Palyginti su sveikų kontrolinės grupės, peak5 (bigalacto dviantenio glikanu, NA2) ir peak9 (išsišakojimo alfa-1,3-fucosylated triantennary glikaną, NA3Fb) buvo padidėjusi (P < 0,001) (1B pav); o core- fucosylated viršūnių, pavyzdžiui, peak2 (agalacto core-alfa-1,6-fucosylated pusiaukampinę dviantenio glikaną, NGA2FB), peak3 (vieno agalacto Core α-1,6-fucosylated dviantenio glikaną, NG1A2F) peak6 (bigalacto branduolys -α-1,6-fucosylated dviantenio glikaną,, NA2F) ir peak7 (bigalacto branduolių alfa-1,6-fucosylated pusiaukampinę dviantenio glikaną, NA2FB) buvo sumažėjo skrandžio vėžio grupės (P < 0,001). Be to, iš pagrindinių-fucosylated struktūros glikanų pavadintas sumfuc gausa (rodo viso pagrindinio-fucosylated struktūras, įskaitant smailės 1, 2, 3, 4, 6, ir 7) buvo žymiai sumažėjo skrandžio vėžio (P < 0,001) (1c pav ). Skrandžio vėžys grupė toliau skirstoma į 4 pogrupių pagal TNM sustojimo UICC skrandžio vėžio. Struktūra gausa ir sumfuc reikšmingai nepakito tarp 4 skirtingų pogrupių; Tačiau sumfuc buvo palaipsniui mažėjo progresinius etapuose skrandžio vėžiu (3 lentelė).

Koreliacija tarp N-glikanus ir įprastiems naviko žymenų

Jei datos CEA vis dar plačiai naudojamas dėl atrankos ir stebėsena skrandžio vėžio. Mes analizavo tarp individualios N glikanu persekiotoją su CA19-9, CEA, CK19, CA125 ir CA724 koreliacijas. Pearsono koreliacija analizė parodė, kad CEA buvo susijęs teigiamai su peak1 (r = 0,19; P < 0,01), ir peak9 (r = 0,28; P < 0,01), kadangi neigiamai su peak6 (R = -0,18; P < 0,01) ir peak8 (r = -0,23; p < 0,01). (4 lentelė)

palyginimas sumfuc tarp skrandžio vėžio ir kitų virškinimo sistemos vėžiu

Anksčiau mes ištyrėme N-glikaną profiliavimas kepenų ląstelių karcinoma (HCC) [19] ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys (CRC) [20]. Iš sumfuc gausa parodė statistiškai reikšmingų skirtumų tarp skrandžio vėžio (41,32 ± 6.39), HCC (50,99 ± 8.39), Vaiko teisių konvencijos (45,33 ± 5,96) ir sveikų (47.67 ± 5.08) grupių (p < 0,001, 5 lentelė), nurodant kad kitoks lygis core fucosylation pasirodė vėžio su skirtingais audinių kilmę. Tarp 4 grupes, iš pagrindinio fucosylation į HCC lygis buvo didžiausias, o fucosylation lygis skrandžio vėžio buvo mažiausias, ir buvo net mažesnis nei sveikų.

N-glikaną profiliavimas modeliai skrandžio naviko ir ne navikų audiniuose

N-glikaną profiliai buvo nagrinėjami desialylated baltymų skrandžio naviko ir ne navikų audiniuose. Trijų gausiausias bigalacto dviantenio glikanus parodė serume, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) ir preak7 (NA2FB) buvo nustatyta taip pat audinių baltymų (2A pav.) Peak6 ir Peak7 buvo patvirtinta, kad pagrindinės-fucosylated struktūros dervied iš peak5 po gydomi core-alfa-1, 6 fukosidazei virškinimą (2a pav.) Šių trijų smailių buvo analizuojami naudojant GeneMapper programinę įrangą. Iš peak6 į peak5 santykis buvo mažesnis navikų audiniuose, nei kad gretimose ne-navikų audiniuose (0,83 ± 0,18 vs 1,05 ± 0,42, 2B pav), taip pat kaip peak7 santykis su peak5 (0,13 ± 0,06 vs 0,16 ± 0,04, 2C pav.) Tačiau nebuvo statistiškai reikšmingi skirtumai (p > 0,05). Tarp naviko ir ne navikų audiniuose

Sumažėjęs bendro pagrindinio fucosylation nustatytas tiek serumai ir audinius nuo skrandžio vėžio

Nuo LCA gali specialiai pripažinti glikoproteinai su α-1,6-fucosylated susietos N-acetil-D-gliukozamino-asparagino (GlcNAc-Asp) į trimannosyl šerdis, mes ištirti bendro pagrindinio fucosylated baltymus iš serumai ir audinius skrandžio vėžio naudojant LCA patvirtinti į PSI akį išvadą. Serume, iš LCA-privalomas pagrindinių fukozė likučių lygis buvo mažesnis skrandžio vėžio nei ta, skrandžio opa ir sveikų (3a pav.) Iš viso šerdis fukozė gausa taip pat tendencijos faktorių yra mažesnis skrandžio auglių, palyginti su į suporuotas gretimuose audiniuose (3b pav.) Norint nustatyti, ar visos pagrindinės fucosylation skrandžio naviko audinio pakeitimas yra svarbi keičiant glikozilinimo biosintezė keliu, kiekybinė PGR buvo naudojamas analizuoti žinduolių Fut8 ir BVP-tr gausa skrandžio navikų ir gretimuose audiniuose. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad nė vienas reikšmingas skirtumas Fut8 ir BVP-tr iRNR išraiškos buvo pastebėtas tarp navikų ir gretimų audinių (3c ir 3d pav). Santykinis gausumas Fut8 baltymų iliustravo naudojant Vakarų dėmė (RAW duomenys buvo parodyta S1 paveiksle). Fut8 gretimose audinių buvo žymiai didesnis nei, kad ne tik navikų audiniuose (P < 0,05) (3E pav). Imunohistocheminis atskleidė, kad Fut8 buvo stipriai teigiamai išreikšti esant luminal sienų ne vėžinių skrandžio ląstelių (4b paveikslas), tačiau silpnai teigiamai išreikštas vėžinių ląstelių (4a pav.) Iš LCA-privalomas pagrindinio fucosylated glikoproteinų išraiška buvo didesnis ne vėžinių skrandžio ląstelių negu vėžinių ląstelių (4c paveikslas, 4D). Taigi, buvo nustatyta iš viso pagrindinio fucosylation lygis sumažėjo tiek serumas ir audinius nuo skrandžio vėžio.

poveikis Fut8 ir BVP-TR nuo platinimo ir migracijos žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 buvo naudojamas in vitro tyrimas. Nuo BGC-823 išreikšti mažesnį BVP-tr o SGC-7901 išreikšti žemesnio lygio Fut8 mūsų bandomojo tyrimo, pEGFP-N1-BVP-TR buvo pernešta į BGC-823 už ekspresija BVP-TR ir pEGFP-n1 Fut8 buvo perkeltų į SGC-7901 už ekspresija Fut8. Rekombinaciniai išsireiškimai buvo sėkmingai pasiektas parodė reporteris genų GFP išraiškos (S2 pav.) Siekiant išnagrinėti galimą dalyvavimą BVP-TR ir Fut8 auglio platinimu ir migracijos, BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelės buvo tiriami po transfekciją naudojant CCK-8 ir žaizdų gijimo migracijos tyrimą atitinkamai. Rezultatai parodė, kad ląstelę BVP-tr sumažėjo BGC-823 platinimu bent 2-5 dienas po transfekciją ir ląstelę Fut8 sumažėjo SGC-7901 platinimu bent 2 dienas po transfekciją (5a pav ir 5b). Šie rezultatai rodo, kad aukštos raiškos BVP-TR ir Fut8 gali slopinti žmogaus skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją. Žaizdų gijimą tyrimą paaiškėjo, kad BVP-TR ir Fut8 neturės reikšmingos įtakos migracijos BGC-823 ir SGC-7901 48 val po gydymo (5c ir 5D pav.)

Diskusijos

glikozilinant yra vienas iš labiausiai paplitusių potransliacinis pakeitimų atsirado apie 70% visų žinomų baltymų. Pasikeitimai glikozilinant vaidinti svarbų vaidmenį įvairialypėje nustatytas biologinių reiškinių, tokių kaip naviko ląstelių metastazės, ląstelėje bendravimo ir uždegimas [21] - [23]. Vis daugiau ir daugiau tyrimų rodo, kad glikozilinant pakitimai ir glycosyltransferases veiklą, gautų iš piktybinę transformaciją lygiai yra susiję su žmogaus piktybinių navikų [24] - [25]. PSI akį yra paprastas ir efektyvus technologijų matavimo N-glikaną pokyčius serume. Mes anksčiau naudojo šią technologiją padėti HCC ir VTK diagnozę [19] - [20]. Atsižvelgiant į dabartinę tyrime mes jį naudojo analizuoti būdingą N-susijusi profiliavimo modelis skrandžio vėžio. Rezultatai parodė, kad ten buvo daug skirtingų N-glikaną profiliavimas modeliai tarp skrandžio vėžio, skrandžio opa ir sveikų. Tarp šių skirtingų profiliavimo modelius, buvo rasta peak9 ir sumfuc būti pakeista į priešingą modelio skrandžio vėžiu, palyginti su kontrolinės grupės. Kaip matyti iš ankstesnių tyrimų, peak9 buvo susijęs su veislių piktybinių navikų, mes vėl patvirtino, kad triantennary N-glikaną, struktūra gausa žymiai padidėjo skrandžio vėžio ir šis pakeitimas dar nebuvo nustatyta gali būti susijusios su CEA, kuri yra dažniausiai Naudota VTK žymeklį ir yra labai nevienalytė glikoproteinas, kuris yra 60% angliavandenių [26]. Individualia N glikanu struktūra gausa analizės, mes nustatėme, kad sumfuc buvo žymiai sumažėjo skrandžio vėžiu, palyginti su kontroline grupe. Dėl papildomos patvirtinti šią išvadą, mes atliekame lektinų dėmę tiek serumas ir audiniuose. Naudojant HCC serumą kaip teigiama kontrolė, mes nustatėme, sumažėjo fucosylation N-glikanus Viso baltymų serume skrandžio vėžio. Panaši tendencija buvo atskleista skrandžio navikų audiniuose. Šie duomenys sutampa su mūsų ankstesnėse ataskaitose apie Vaiko teisių konvencijos [20]. Tačiau rezultatai prieštarauja ankstesnių ataskaitų apie vėžio su kitais audinių kilmę. Į fucosylated oligosacharidų padidėja iki patologiniams buvo pranešta kitiems ir mūsų grupėje [19]. Fucosylated AFP (AFP-L3) buvo naudojamas kaip HCC persekiotoją klinikinėje praktikoje [25]. Iš pagrindinio fucosylation lygių contradictories pasirodė įvairių vėžio gali būti dėl įvairių vaidmenų įvairiuose audiniuose, pvz Kepenys yra pagrindinis organas yra atsakingas už glikoproteinai be imunoglobulino gaminančių B-limfocitų [27] - [28].

Fucosylation katalizuoja fucosyltransferases, guanozinas 5'-difosfatas (BVP) -fucose sintetiniai fermentai ir BVP-fukozė transporteris (-ai). BVP-fukozė yra bendras donoras substratas visiems fucosyltransferases. Po BVP-fukozė buvo sintetinamas citozolyje, jis gabenamas į Goldžio kompleksas per BVP-tr tarnauti kaip substratas fucosyltransferases [17], [29]. Todėl BVP-TR yra pagrindinis veiksnys BVP-fukozė susintetinti keliu. Fut8 yra tik fucosyltransferase dalyvauja pagrindinio fucosylation [29]. Mes nustatėme, sumažėjo Fut8 baltymų ekspresiją naviko audinio, kuris palaiko mūsų išvadas serumu. Tačiau Fut8 iRNR raiška buvo statistiškai reikšmingai nesiskyrė skrandžio navikų ir gretimuose audiniuose. Glikozilinant labai atspindi pokyčius ląstelėje pakitimus. Epigenetiniai modifikacijos genomo yra stabiliai perduodami dukterinėms ląstelėms be genetinių sekų pokyčių poreikį. [30] Norėdami išsiaiškinti, ar sumažėjo pagrindinių fucosylation vaidina svarbų vaidmenį kancerogenezėje skrandžio vėžio, mes pratęsė skrandžio ląstelių linijų tyrimas in vitro. Mes nustatėme, kad iki reguliuojama BVP-TR ir Fut8 išraiška žmogaus skrandžio vėžio ląstelių gali sukelti mažo platinimu. Bet mums nepavyko rasti jokių Core fucosylation poveikį ląstelių migraciją. Šie rezultatai padeda paaiškinti galimą mechanizmą, kodėl sumažėjo Core fucosylation atsirado skrandžio vėžio ir šiuo žemyn reguliuojama pagrindinio fucosylation koreliavo su kai piktybinės biologinės elgsenos skrandžio vėžio ląsteles.

pastaraisiais metais, yra keletas išvados atskleidžia, kad glikozilinant pokyčiai vaidina svarbų vaidmenį progresavimo ligų be kepenų vėžio ir autoimuninių ligų. Dideli pokyčiai į išskiriami glikoproteinų glikozilinant įtraukta į pagrindinę fucosylation mažinimą, padidėjo šakojasi ir padidėjo sialylation ir modifikacijų epigenetinio mašinų turėti didelį poveikį glikaną struktūrų susidarančių ląstelių metu kiaušidžių vėžio progresavimą [30]. Iš pagrindinio fucosylated dviantenio glikanus ir α-2,3-susietų Seilių rūgščių koncentracija buvo žymiai padidėjo prostatos vėžiu. [31] Ten buvo 40% padidėjimas pagrindinę fucosylation pagrindinėse sialylated dviantenio glikanus į kasos vėžio kraujo serume, kuris būtų rodo nuo su naviku susijusio glycoforms [32] pogrupyje.

Neseniai, buvo gautas iš pagrindinio fucosylation funkcija, sietinus su EGFR [33] funkcija. Iš EGF jo receptorių reikalauja core fucosylation N-glikanus EGFR.

• PLoS Genetics: gemalo mutacijos MAP3K6 yra susiję su familiarioji skrandžio vėžio
• PLoS ONE: Discovery naviko žymenų skrandžio vėžio proteomiką