Plos ONE: Zmanjšano Core-Fucosylation Prispeva k malignosti želodčnega raka

Povzetek

Cilj študije je opredeliti N-glikan spremembe profiliranja, povezanih z rakom želodca in raziskati vpliv temeljnega fucosylation o bioloških vedenj človekovih želodca rakavih celic. Skupno 244 predmetov, vključno z rakom želodca, razjede želodca in zdravega nadzora so bili zaposleni. N-glikan profiliranje od serumu in skupnih beljakovin v želodcu tkiva smo analizirali z DNK-sekvencer pomaga-fluorofor pomaga kapilarno elektroforezo. Številčnost celotnih-core fucosylated ostankov in izražanje encimov, vključenih v osnovno-fucosylation smo analizirali z lektin odtis, kvantitativno reverzne transkripcije-verižno reakcijo s polimerazo, Western Blot, Imunohistokemijsko in lektin-histokemična barvanjem. Rekombinantni plazmidov BDP-fukoze prevoznika in alfa-1,6-fucosyltransferase (Fut8) so bili zgrajeni in transfektirali v želodcu raka celičnih linijah BGC-823 in SGC-7901. CCK-8 in celjenje ran test smo uporabili za oceno funkcionalne vpliv core-fucosylation modulacije na celično proliferacijo in migracijo. N-glikan profili značilnost serumu so bile ugotovljene pri raku želodca. V primerjavi z zdravo nadzor, ki trianntenary strukturo izobilju, vrha 9 (NA3Fb), je pri raku želodca znatno povečal, medtem ko se je zmanjšala skupna številčnost-core fucosylated ostankov (sumfuc). -Core fucosylated strukture, peak6 (NA2F) in peak7 (NA2FB) so umrli v želodčnih tumorskih tkivih, v primerjavi s tistimi v sosednjih ne-tumorskih tkivih. Dosledno, leča culinaris aglutininom (LCA) -binding proteinov v serumu raka želodca občutno zmanjšala, in raven beljakovin Fut8 je v želodčnih tumorskih tkivih bistveno zmanjšala v primerjavi s tistim v sosednjih ne-tumorskih tkivih. Uravnavanjem BDP-Tr in Fut8 lahko inhibira proliferacijo, vendar ni imel velik vpliv na migracije BGC-823 in SGC-7901 celic. Core-fucosylation je navzdol ureja rakom želodca. Uravnavanjem temeljnega fucosylation lahko inhibira proliferacijo človeških želodčnih rakavih celic

Navedba. Zhao Y-P, Xu X-Y, Fang M, Wang H, Si Q, Yi C-H, et al. (2014) zmanjšana Core-Fucosylation Prispeva k malignosti želodčnega raka. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10,1371 /journal.pone.0094536

Urednik: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 19 avgust 2013; Sprejeto: 17. marec 2014; Objavljeno: 14. april 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Študija je bila podprta z National Natural Science Foundation Kitajske (št 81201697, 81101639 in št 81271925); Znanost in tehnologijo komisija občine Shanghai (št 10ZR1439100 in št 11JC1416400) .The financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.: avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok raka povezanih smrti na svetu [1]. - [3], zlasti razširjena v številnih azijskih državah, predvsem na Kitajskem [4]. Protein glikozilacijsko je eden izmed najpogostejših posttranslacijske modifikacije, ki proteine ​​[5]. Glikanov lahko vezan na proteine, bodisi preko amidne skupine (N-vezan glikozilacijo) ali hidroksilno skupino (O-vezana glikozilacijo), ki se pojavljajo skozi različne biosintetske poti in potencialno imajo neodvisne funkcije [6]. N-vezana glikozilacija igra temeljne vloge v številnih bioloških procesih, kot celično adhezijo, celični migraciji, in signalno transdukcijo [7]. Nenormalno ekspresijo-N vezana glikoproteinov so opazili pri različnih boleznih [8] - [10]. Ob poglobljeno karakterizacijo N-vezanih glikoproteinov in povezano bolezenskih sprememb glikozilacijskih, je bilo razvitih več metodologij. V naši prejšnji študiji smo identificirali nekaj N-glikan označevalcev v heptatocellular karcinom (HCC) in raka na debelem črevesu s pomočjo temelji elektroforeza kapilarno imenovano DNK-sekvencer pomaga-fluorofor pomaga kapilarna elektroforeza (DSA-FACE) [11]. Poleg tega je bilo poročali, da je α-1, 6-fucosyltransferase (Fut8) aktivnost in izražanje v številnih človeških rakih povečala, kar kaže na vlogo tega encima pri razvoju in napredovanja tumorja, kot HCC [12], kolorektalnega raka [ ,,,0],13] 'nemajhen' celičen pljučni rak [14] in jajčnikov serozni adenokarcinom [15]. Spremenjen core-fucosylation je eden od najpomembnejših nenormalno glikiranega spremembe, opredeljenega v malignih bolezni. Fut8 katalizira transfer fukoze s gvanozin difosfat (GDP) -fucose do najgloblje GlcNAc hibrida in kompleksnih-N vezana oligosaharide z a-1,6-vezi, zaradi česar-core fucosylated glikoproteinov [16] - [17] in spreminjanje biološke funkcije, ki so posledica glikoproteinov [18]. Čeprav so številne študije poročajo o pridružitvi med spremenjenega temeljnega fucosylation in drugih agresivnih tumorjev, da nam je znano, je vpliv temeljnega fucosylation za rakom želodca, še ni znan. V tej študiji smo analizirali N-glikan profiliranje z DSA oči v obeh vzorcev seruma z rakom želodca, razjede želodca, zdravih in tkiv proteinov iz tumorjev in sosednjih niso tumorjev. Nato razširi funkcionalno raziskave na ugotovljenih posebnih glycosylations.

Materiali in metode

Etika Izjava

Protokol študije je odobril odbor kitajskega etiko človeške vire na sekundo Military Medical University. Vsi udeleženci študija pod pogojem, da pisno privolitev.

Študija prebivalstva

Skupno 105 bolnikov z rakom želodca (n = 80) in želodcu (n = 25) je bilo vključenih od decembra 2007 do oktobra 2010 v bolnišnici Changzheng drugega vojaškega Medical University (Shanghai, Kitajska). Vsi primeri z rakom želodca vpisan so histopathologically potrjujejo 2 patologi in primerov z razjedo želodca zaposlila so potrdili gastroskop. Bolniki z rakom želodca, ki so prejeli preoperativno kemoterapijo, in so imeli druge bolezni, vključno z okužbami so bili izključeni iz študije. Vzorce seruma so bili pridobljeni pred kirurške resekcije. Pri kontrolni skupini je bilo 139 starost ujema, zdravih prostovoljcih, vpisanih iz skupine posameznikov, raka brez, ki so obiskali isto bolnišnico redni fizični pregled in kdo prostovoljno, da se pridružijo raziskave v istem obdobju. zdravega posameznika opredeljen kot nekdo, ki je presodilo, brez bolezni (vključno brez zgodovine raka) v zdravstvenem check-up. Naslednje klinične značilnosti predmetov so bili pridobljeni v času polne krvi. Povzetek podatkov iz teh predmetov je podan v tabeli 1. napredovanje vseh bolnikov z rakom želodca je bila razvrščena po Unije za mednarodni nadzor raka (UICC) Merila TNM počivališča za rakom želodca, 13 bolnikov (16,25%) je imel fazi I, 24 bolnikov (30,00%) je stopnja II, 30 bolnikov (37,5%) je imelo stopnjo III, in 13 bolnikov (16,25%) je imelo fazi IV. Povprečna starost vseh bolnikov je bila 54,35 ± 6,69 skupaj 60 moških in 20 žensk. Serum zberemo z uporabo standardnega protokola iz polne krvi, obdelamo s centrifugiranjem pri 10000 g 20 minut in shranimo pri -80 ° C.

N-glikan profiliranje od serumskih proteinov

serum proteina N-glikan analize so bile izvedene kot je bilo predhodno [11] opisano. Na kratko smo N-glikanov prisotne na proteine ​​v 2 ul seruma sprosti s peptida N-glikozidazo-F (PNGaseF) (New England Biolabs, Boston, Mass) in nato označeni z 8-aminonaphtalene-1, 3, 6- trisulphonic kislina (APTS) (Invitrogen, Crlsbad, CA) .Sialic kislino smo odstranili z Arthrobacter ureafaciens sialidase (Roche Bioscience, Palo Alto, CA), in predelani vzorci so bili analizirani z DSA oči tehnologijo pomočjo ABI3500 genskih osnovi elektroforeza kapilarna Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija). 9 najbolj intenzivnimi vrhovi, ki so bile ugotovljene pri vseh vzorcih (skupaj, ti vrhovi predstavljali > 90% celotnih serumskih N-glikanov) smo analizirali s GeneMapper programske opreme (Applied Biosystems). Vsaka struktura N-glikan je številčno opisal normalizacijo vrhunec vsoti višine vseh vrhov.

Vzorce tkiva

Vsa tkiva so bili uporabljeni v skladu s Pravilnikom o sveta institucionalni pregled drugi Military Medical University. Vzorce tkiva so bili pridobljeni from10 80 bolnikov z rakom želodca. Vzorce tkiva vključeni 2 rezine, s tumorsko tkivo in sosednje niso tumorsko tkivo. Seznanjene vzorce tkiva (približno 0,5 x 0,5 x 0,5 cm ^{3, razmnoževati za vsak vzorec), izbrani so bili bodisi takoj zamrznili pri -80 ° C RNA in proteinov ekstrakcijo ali določen v 10% zastalega formalinu do 24 ur in nato predelana v parafin vgrajeni bloka in hraniti pri sobni temperaturi istocasnem barvanjem.}

N-glikan profiliranje iz tkivnih beljakovin in strukturne analize z uporabo exoglycosidase prebavo

Proteini so bili pridobljeni iz približno 25 mg zamrznjenih vzorcev tkiva . Vzorce tkiva so bila prekinjena in pestled v lize pufru, ki vsebuje zaviralci proteaz koktajl (Roche Diagnostics, Meylan, Francija). Unlysed dele smo odstranili s centrifugiranjem (12000 g 10 minut pri 4 ° C) dvakrat. Koncentracijo raztopljenih proteinov je bila določena z BCA kompleta (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) in vzorce proteinske smo hranili pri -80 ° C do uporabe. Skupno 40 mikrogramov tkiva proteinov smo uporabili za določitev profilov N-glikan uporabo rednega N-glikan metodo profiliranje enako kot da izvedemo v serumu opisan zgoraj. Za identifikacijo core-a-1, 6-fucosylated N-glikan strukture, ustrezno število APTS-označeni N-glikanov so prebavljivih z obema Arthrobacter ureafaciens sialidase in goveje ledvične α-1, 6-fucosidase (Prozyme, San Leandro, CA , ZDA). DSA-FACE tehnologija je bila uporabljena za analizo prebavo izdelke in GeneMapper programska oprema je bila uporabljena za analizo višine vrhov.

ekstrakcijo RNA in kvantitativni PCR v realnem času

Skupaj RNA so bili pridobljeni iz zamrznjene tkiva in celice, ki uporabljajo skupni pribor ekstrakcije RNA v skladu z navodili proizvajalca (Axygen bioznanosti, Hangzhou, Kitajska). Čistost in koncentracija RNA smo določili s spektrofotometrom (Eppendorf, Hamburg, Nemčija), ter nato shranimo pri -80 ° C do uporabe. CDNA smo sintetizirali s pomočjo ReverTra Ace-α-RT-PCR kit (Toyobo Co., Osaka, Japonska) v skladu z navodili proizvajalca. Temeljni premazi so namenjeni uporabi programa Primer Express (Applied Biosystems; sekvence so prikazane v Tabeli S1). Kvantitativni PCR v realnem času smo izvedli s pomočjo SYBR® Green realnem času PCR Master Mix komplet (Toyobo Co., Osaka, Japonska) in je bil analiziran na Applied Biosystems 7300 realnem času PCR sistem (ABI, Foster City, CA, ZDA) . Vse teste smo izvedli neodvisno v treh izvodih. PCR kolesarjenje sestavljalo denaturacija pri 95 ° C za 5 minut, čemur sledi 40 ciklov pri 95 ° C 15 sekund in pri 59 ° C ali 55 ° C 15 sekund in odkrivanje 45 sekund pri 72 ° C. Relativna količina Fut8 ali gvanozin difosfat (GDP) -fucose transporter (GDP-Tr) transkriptov v vsakem vzorcu je normalizirano za gospodinjstvo gen P-aktin in gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) z odštevanjem cikel. Raven izražanja genov smo določili z uporabo metode Delta-Delta CT. Absolutne vrednosti izraz prepisovali, ki presegajo 40 ciklov, so bile obravnavane v nadaljevanju zaznavnih količin. Topijo krivulje preveri za vsako reakcijo, da se zagotovi, da je bil en sam izdelek poveča.

Western blot in lektin madež

Proteini so bili pridobljeni iz zamrznjenega tkiva z zgoraj opisanim postopkom, in skupaj 50 ug proteine ​​smo ločili z elektroforezo na 10% natrijev dodecil sulfat-poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE). Gele smo obarvali s Coomassie modrim G250 ali proteini v gelu smo prenesli na nitrocelulozno membrano () za odkrivanje Fut8 ali odstotek-core fucosylated proteinov. Za serumskih vzorcih smo uporabili skupno 85 primerov zaradi raka želodca (n = 80), želodčne razjede (n = 25) in zdrave nadzor (n = 30) za SDS-PAGE in lektin-blot. Membrane smo preko noči blokirali pri 4 ° C s 5% nemastnega mleka proteina ali 5% goveji serumski albumin v tris-pufrom [140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (TBS)] in nato inkubiramo 2 uri pri sobni temperaturi, pri 1:100 razredčena Fut8 protitelesa proti človeškim (15C6, anti-človeški Fut8, Fujirebio Corp., Japonska) ali 5 mikrogramov /ml biotiniliranega leče culinaris aglutininom A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija) v TBS, ki vsebujejo 0,05% Tween-20 (TBST pufer) in nato inkubiramo z 1:10,000 razredčenju-fluorescence označenega sekundarnih protiteles (LI-COR bioznanosti, Lincoln, NE) ali IRDye 800CW-streptavidina (LI-COR Biosciences) 1 uro pri sobni temperaturi . Membrane so bili razviti s Odyssey IR Imaging System. Anti-beta aktin (1:2000) je bila uporabljena za notranjo referenčno protiteles za zahodni odtis. Prečiščena albumin je bila uporabljena kot negativna kontrola za lektin madeža in skupnih beljakovin, obarvanem z Coomassie modro je bila uporabljena za izračun deleža-core fucosylated beljakovin.

Imunohistokemijsko (IHC) obarvanje in lektin-histokemična obarvanje

osebki fiksni tkiva vgrajeni v parafin, smo narezali na 4-mm-bolnih rezine za imunohistokemičnim barvanjem za Fut8 in lektin-histokemična barvanjem za LCA. Po opravljenem deparaffinization, rehidracijo, endogene peroksidaze blokiranje, in pridobivanje antigena (10 mM Tris /1 mM EDTA, pH 9,0, avtoklava obdelamo), smo vzorce inkubiramo z mišjega monoklonskega protitelesa proti človeški Fut8 (1:100) ali biotiniliranega LCA (1 :500) preko noči pri 4 ° C, nato pa s hrenovo peroksidazo konjugiranih sekundarnega protitelesa ali Fluorescein oznako streptavidinom pri 37 ° C za 30 minut. Jedra so jih nasprotno z hematoksilinom ali Draq5. Negativna kontrola je bila sestavljena iz enako zdravljenih histološke oddelkih z miško IgG za zamenjavo miške Fut8.

Celične linije in kulture

človekovih želodca rakave celične linije, BGC-823 in SGC-7901, so bile kupljene iz Shanghai Institute of Cell Biology, kitajske akademije znanosti in kultivirani pri 37 ° C pod 5% CO _{2 v RPMI 1640 mediju in DMEM mediju (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), v tem zaporedju, z 10% FBS, 1% glutamina in 1% antibiotik rešitev.}

Gradnja BDP-Tr in Fut8 rekombinantnega plazmidov in transfekciji želodca rakavih celic

pEGFP-N1-BDP-Tr in pEGFP-N1 -Fut8, plazmid vektor kodira človeško BDP-Tr ali Fut8 je nastalo z vstavitvijo BDP-Tr ali Fut8 cDNA v pEGFP-N1 vektorja (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, ZDA), ki vsebuje promotor CMV in SV40 zgodnji promotor, kot tudi neomicin /kanamicin odpornost gen za Tn5. Vektor hrbtenica vsebuje tudi SV40 izvor replikacije v sesalskih celicah. Kloniranje mesto multipla (MCS) je poleg neposrednega zgodnjega promotorja CMV. GDP-Tr ali Fut8 gen humanega smo klonirali iz mRNA ekstrahiramo z TRIzola reagentom (Invitrogen, Carlsbad, ZDA) iz človeškega jetrnega tkiva z izvajanjem RT-PCR ob uporabi primerjev (tabela S2), v katerem Xho I. in KpnI restrikcijskih mest so bili vključeni, prebavo z Xho I ali KpnI in ligiranjem v pEGFP-N1. PEGFP-N1-BDP-Tr ali pEGFP-N1-Fut8 transficiramo v Escherichia coli DH5α za ojačanje in DNA sekvenciranje je bila uporabljena za zagotavljanje zvestobe. Plazmidno DNA smo pripravili ob uporabi Qiagen DNA mini kit (Qiagen, Hilden, Nemčija) po navodilih proizvajalca. Plazmide smo transfektirali v človeških želodčnega raka celičnih linij, BGC-823 in SGC-7901 na 80% sotočju in 5 x 10 ^{5 celic na dobro v šestih tudi ploščo z uporabo Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, ZDA ) v skladu z navodili proizvajalca. Transficirane celice, ki izražene ciljni gen, so bile potrjene s kvantitativno RT-PCR.}

Cell širjenje test

teste proliferacije celic smo izvedli z Cell štetje Kit-8 (CCK-8, Dojin, Japonska) v skladu z navodili proizvajalca. Rast celic smo kontrolirali vsakih 24 ur nad 5 dni, in za vsako časovno točko smo izvedli v dvojniku. Absorbanco smo izmerili za vsako dobro pri valovni dolžini 450 nm.

celjenje ran test

Za celjenje ran testu človeške želodčne rakave celične linije, BGC-823 in SGC-7901 ( 1 x 10 ^{5 celicah /35 x 11 mm jedi) smo posejali in inkubirana za 24 ur pri 37 ° C in nato transficirane z rekombinantnim plazmidov. Po doseganju sotočje smo celični plasti v vsaki plošči opraskan pomočjo plastične vrh pipete. Migracija celic na robu začetka smo analizirali pri 0, 24 in 48 ur, so bile slike in analizirali z Leica fluorescenčnim mikroskopom poveže in analiza slik programsko opremo (test komet IV sistem za analizo slike, PI, UK).}

Redno Tumor Maker Detection

kliničnih in biokemičnih podatkov bolnikov, so povzeti v tabeli 1. Rutinsko biokemični testi so bile izmerjene z uporabo standardnih metod in pokrite reagente (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokio, Japonska) . ravni Tumorski marker, vključno z antigenom ogljikovih hidratov 19-9 (CA19-9), carcino-zarodkov antigen (CEA), Cytokeratin 19 (CK19), CA125 in CA724, so bile določene na Roche E170 modularno z ujemanjem reagenti.

Statistična analiza

Vsi kvantitativne smo izrazili kot sredstvo ± standardni odkloni, če ni navedeno drugače. kvantitativne spremenljivke so bile v primerjavi s testi Student t, analize variance (ANOVA), ali neparametrični testi. Pearson koeficientov korelacije (Spearman koeficienti korelacije smo izračunali za ordinalnih kategorične spremenljivke) in z njimi povezane verjetnosti ( p
) so bili uporabljeni za oceno korelacije med parametri. Vsi so poročali p
vrednosti so bile 2-repa, in p
vrednosti < 0,05, so bile obravnavane statistično značilne. Statistične analize so bile opravljene s programom SPSS 16.0 za statistične programske opreme Windows (SPSS Inc.).

Rezultati

Različni serumu N-glikan profiliranje vzorci rakom želodca, razjede želodca in zdravih kontrolah

Uporaba DSA v oči, smo pregledali N-glikan profilov v dezialiliran serumih bolnikov z rakom želodca (n = 80), razjede želodca (n = 25), in starost ujema zdravih posameznikov (n = 139). Mi količinsko in statistično primerjali te vrhove med 3 različne skupine. Najmanj 9 N-glikan strukture (vrhovi) so bile ugotovljene pri vseh vzorcih (slika 1A). Strukturna analiza teh N-glikanov je že objavila Callewaert [11]. Povprečna relativna številčnost teh N-glikana objektov, je opisana v tabeli 2. obilo struktur v vrhove 2, 3, 5, 6, 7, 8 in 9 pokazala statistično pomembne razlike med rakom želodca, razjede želodca in zdravo nadzor skupine, ki kažejo, da različni N-glikan vzorci pojavil v različnih patofiziološke pogojih. V primerjavi z zdravim kontrolno skupino, peak5 (bigalacto biantenarnega glikanom, NA2) in peak9 (razvejane a-1,3-fucosylated triantenarijsko glikan, NA3Fb) so bili povišani (P < 0,001) (slika 1B); ker core- fucosylated vrhov, kot so peak2 (agalacto core-a-1,6-fucosylated bisecting biantenarnega glikan, NGA2FB), peak3 (single agalacto osrednje-α-1,6-fucosylated biantenarnega glikan, NG1A2F), peak6 (bigalacto jedra -α-1,6-fucosylated biantenarnega glikana, NA2F) in peak7 (bigalacto core-a-1,6-fucosylated bisecting biantenarnega glikan so NA2FB) v želodčni skupine raka zmanjšala (P < 0,001). Podobno številčnost glikanov strukture jedri fucosylated imenovanih sumfuc (označuje skupno število pomožnih fucosylated struktur, vključno z vrhom 1, 2, 3, 4, 6 in 7), je v raka želodca znatno zmanjšala (P < 0,001) (Slika 1C ). Želodca skupina rak je nadalje razvrščajo v 4 podskupine glede na TNM uprizoritev UICC za rakom želodca. Struktura številčnost in sumfuc ni bistveno spremenila med 4 različnimi podskupinami; Vendar pa se je sumfuc postopoma zmanjšal z napredovanje po stopnjah raka želodca (tabela 3).

Korelacija med N-glikanov in redne tumorskih markerjev

Do sedaj, CEA je še vedno pogosto uporablja za pregledovanje in spremljanje raka želodca. Analizirali smo korelacije med posamezno N-glikozilacijska marker z CA19-9, CEA, CK19, CA125 in CA724. Analiza Pearson korelacija je pokazala, da je bil CEA pozitivno povezana z peak1 (r = 0,19; P < 0,01), in peak9 (r = 0,28; P < 0,01), medtem ko negativno z peak6 (r = -0,18; P < 0,01) in peak8 (r = -0,23; P < 0,01). (Tabela 4)

Primerjava sumfuc med rakom želodca in drugih prebavilih raka

Pred tem smo proučevali N-glikan profiliranje karcinomom jetrnih celic (HCC) [19] in kolorektalnega raka (CRC) [20]. Številčnost sumfuc pokazala statistično pomembne razlike med rakom želodca (41,32 ± 6,39), HCC (50,99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) in zdravega nadzora (47,67 ± 5,08) skupine (P < 0,001, Tabela 5), ​​kar pomeni, da različna raven temeljnega fucosylation pojavil v raka z različnih izvorov tkiv. Med 4 skupine, je bila stopnja temeljnega fucosylation v HCC najvišja, medtem ko je bila stopnja fucosylation raka želodca najnižja in je celo nižja kot pri zdravih nadzor.

N-glikan profiliranje vzorci želodčni tumor in ne-tumorskih tkiv

N-glikan profili so bili pregledani v dezialiliran beljakovin iz želodca tumorja in ni tumorskih tkivih. Vsi trije najpogostejši bigalacto biantenarnega glikanov pokazala v serumu, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) in preak7 (NA2FB) so bile ugotovljene tudi v tkivnih proteinov (slika 2A). Peak6 in Peak7 so potrdili, da je jedro-fucosylated strukture dervied od peak5 ko se zdravijo z core-a-1, 6-fucosidase prebavo (slika 2A). Višine teh treh vrhov smo analizirali s GeneMapper programske opreme. Razmerje peak6 do peak5 bila nižja v tumorskih tkivih kot v sosednjih non-tumorskih tkiv (0,83 ± 0,18 vs. 1,05 ± 0,42, slika 2B), kot tudi razmerje med peak7 do peak5 (0,13 ± 0,06 vs. 0,16 ± 0,04, slika 2C). Vendar pa ni bilo statistično značilne razlike (P > 0,05). Med tumorja in ni tumorskih tkivih

Zmanjšanje ravni celotnega temeljnega fucosylation opredeljene tako v serumih in tkiva zaradi raka želodca

Ker LCA lahko posebej prepoznati glikoproteini z α-1,6-fucosylated vezanega N-acetil-D-glukozamin-asparagin (GlcNAc-Asp) v jedru trimannosyl, smo raziskovali skupno jedro fucosylated beljakovine iz serumov in tkiva pri raku želodca uporabo LCA za potrditev ugotovitve v DSA-FACE. V serumu, je bila stopnja osrednjih ostankov LCA veže fukoze nižje na raka želodca, kot da je v želodca in zdravih kontrol (slika 3A). Skupaj temeljni fukoze številčnost trendno nižja v želodčnih tumorjev v primerjavi da je v parnih sosednjih tkiv (slika 3B) prav. Da bi ugotovili, ali je sprememba celotnega temeljnega fucosylation v želodcu tumorsko tkivo pomembne spremembe v glikozilacijo biosintezne poti, je kvantitativni RT-PCR uporabljajo za analizo obilo sesalcev Fut8 in BDP-Tr v želodčnih tumorjev in sosednjih tkiv. Rezultati so pokazali, da so bili med tumorjev in sosednjih tkiv (slika 3C in 3D) niso opazili pomembne razlike v Fut8 in BDP-Tr mRNA izražanja. Relativna številčnost Fut8 beljakovin je bila prikazana s pomočjo Western Blot (surovi podatki so prikazani na sliki S1). Fut8 v sosednjih tkivih je znatno višja kot v tumorskih tkivih (P &0.05) (slika 3E). Imunohistokemija pokazala, da je Fut8 močno pozitivno izražena na luminalne mejah želodčnih celic niso tumorskih (slika 4B), vendar je šibko pozitivno izražena v tumorskih celicah (slika 4A). Izraz LCA veže-core fucosylated glikoproteinov je bila večja pri ne-tumorskih želodčnih celic, kot da je v tumorskih celicah (slika 4C, 4D). Torej, je bila ugotovljena stopnja celotnega temeljnega fucosylation zmanjšala tako v serumih in tkivih zaradi raka želodca.

Vpliv Fut8 in BDP-Tr na proliferacijo in migracijo v človeških želodčnega raka celičnih linijah

človeške želodčne rakave celične linije, BGC-823 in GSS-7901 smo uporabili in vitro študija. Ker BGC-823 je izrazil nižjo stopnjo BDP-Tr medtem SGC-7901 izrazil nižjo stopnjo Fut8 v našem pilotnem raziskovanju, je pEGFP-N1-GDP-Tr transfektirali v BGC-823 za prekomerno ekspresijo BDP-Tr in pEGFP-N1- Fut8 je transfektirali v SGC-7901 za čezmerno izraženim Fut8. Rekombinantni izrazi so bili uspešno doseženo kaže reporterski gen GFP izražanja (Slika S2). Da bi preučili morebitno udeležbo BDP-Tr in Fut8 pri tumorja orožja in migracije, so BGC-823 in SGC-7901 celice raziskovali po transfekciji uporabo CCK-8 in celjenje ran migracije testom oz. Rezultati so pokazali, da Povecanje BDP-Tr zmanjšala BGC-823 širjenju na 2-5 dni po transfekciji in uravnavanjem Fut8 zmanjšala SGC-7901 širjenju na 2 dni po transfekciji (slika 5A in 5B). Ti rezultati so pokazali, da se lahko visoka ekspresija BDP-Tr in Fut8 zaviranje proliferacije človeških rakavih celic želodca. Celjenje ran testa je pokazala, da imajo BDP-Tr in Fut8 nima pomembnega vpliva na migracije v BGC-823 in SGC-7901 na 48 ur po zdravljenju (slika 5C in 5D).

Pogovor

glikozilacija je eden izmed najpogostejših post-translacijskih modifikacij pojavili pri približno 70% vseh znanih proteinov. Spremembe v glikozilacije igrajo pomembno vlogo pri številnih različnih bioloških pojavov, kot so mobilni metastaze tumorja, znotrajcelične komunikacije in vnetja [21] - [23]. Vse več študij kaže, da so spremembe v glikozilacije in ravni glikoziltransferaze dejavnosti, ki izhajajo iz maligno transformacijo pomembne za človekove malignih bolezni [24] - [25]. DSA-FACE je preprosta in učinkovita tehnika za merjenje N-glikan spremembe v serumu. Smo že uporablja to tehnologijo za pomoč pri diagnosticiranju HCC in CRC [19] - [20]. V sedanji raziskavi smo ga uporabili za analizo značilno-N povezana profiliranje vzorec na raka želodca. Rezultati so pokazali, da je bilo precej različni N-glikan profiliranje vzorce med rakom želodca, razjede želodca in zdravih kontrol. Med temi različnimi vzorci profiliranje, je bilo ugotovljeno, peak9 in sumfuc je treba spremeniti v nasprotni vzorec raka želodca v primerjavi s tistimi v kontrolni skupini. Kot je razvidno iz predhodnih raziskav, je peak9 povezana z razvojem vrst rakavih bolezni, smo še enkrat potrdili, da je triantenarijsko N-glikan strukturo številčnost na raka želodca bistveno povečal in ta sprememba je bila pokazala, da se v korelaciji s CEA, ki je najpogosteje Rabljeni CRC dvojno podajo in je zelo heterogena glikoprotein, ki vsebuje 60% ogljikovih hidratov [26]. V posameznih N-glikozilacijska analizo strukture izobilju, smo ugotovili, da je bil sumfuc raka želodca znatno zmanjšal v primerjavi s kontrolno skupino. Za dodatno potrditev te ugotovitve, smo izvedli lektinsko blot tako serumih in tkivih. Z uporabo HCC seruma kot pozitivno kontrolo smo opazili zmanjšano fucosylation N-glikanov na celokupnih proteinov v serumu zaradi raka želodca. Podoben trend se je pokazala v želodcu tumorskih tkivih. Te ugotovitve so skladne z našimi prejšnjimi poročili o otrokovih pravicah [20]. Vendar pa so rezultati v nasprotju s prejšnjimi poročili o rakavih obolenj z drugimi izvora tkiv. Povečanje fucosylated oligosaharidov pod patoloških stanj so poročali drugi in naša skupina [19]. Fucosylated AFP (AFP-L3) je bil uporabljen kot HCC označevalec v klinični praksi [25]. V contradictories o ravni temeljnega fucosylation pojavil v različnih rakavih obolenj zaradi različne vloge iz različnih tkiv igre bi lahko, na primer Jetra so glaven organ odgovoren za proizvajanje glikoproteinov poleg proizvajajo imunoglobulina B-limfociti [27] - [28].

Fucosylation katalizira fucosyltransferases, gvanozin 5'-difosfat (GDP) -fucose sintetični encimi in GDP-fukoze transporter (e). GDP-fukoze je skupna donator substrat vsem fucosyltransferases. Potem ko je bil GDP-fukoze sintetiziran v citosolu, se transportira z aparaturo Golgi skozi BDP-Tr služi kot substrat za fucosyltransferases [17], [29]. Zato BDP-Tr je ključni dejavnik za GDP-fukoze sintetizirani poti. Fut8 je edini fucosyltransferase vključeni v osnovno-fucosylation [29]. Zaznali smo zmanjšali Fut8 beljakovin izražanja v tumorskem tkivu, ki podpira naše ugotovitve v serumu. Vendar pa je bil Fut8 mRNA izraz ni bistvene razlike v želodčnih tumorjev in sosednjih tkiv. Glikozilacijsko je zelo odbojno sprememb v okolju celice. Epigenetske spremembe genoma, so trajno prenaša na hčerinske celice brez zahteve po genskih zaporedij sprememb. [30] Da bi razčistili, ali bi zmanjšala osnovni fucosylation igra pomembno vlogo pri karcinogenosti raka želodca, smo razširili raziskavo v vrsticah želodčnih celic in vitro. Ugotovili smo, da bi se regulirano BDP-Tr in Fut8 izraz v človeške želodčne rakavih celic vodi do nizke orožja. Ampak mi ni uspelo najti nobenega vpliva temeljnega fucosylation na celični migraciji. Ti rezultati pomagajo pojasniti morebitnega mehanizma, zakaj, zmanjšani za osnovno fucosylation pojavil rak želodca in to navzdol urejeno core-fucosylation korelaciji z nekaterimi malignim biološko obnašanje želodca rakavih celic.

V zadnjih letih, obstaja več ugotovitve razkrivajo, da so spremembe v glikozilacije igrajo pomembno vlogo pri napredovanju bolezni, poleg raka jeter in avtoimunskih bolezni. Znatne spremembe v glikozilacijo na izločajo glikoproteinov vključeval zmanjšanje jedra fucosylation, povečano razvejane in povečano sialilacije in modifikacije epigenetskega tehnika ima velik vpliv na glikanskih struktur, ki jih celic v jajčnikih napredovanje raka [30]. Ravni-core fucosylated biantenarnega glikanov in α-2,3-povezane sialne kisline so pri raku prostate znatno povečala. [31] se je povečala za 40% v jedro fucosylation v glavni sializirane biantenarnega glikanov v trebušne slinavke serumu raka, ki bi kazal na podskupino tumor povezan glycoforms [32].

Pred kratkim so poročali funkcijo temeljnega fucosylation, da je povezana s funkcijo EGFR [33]. Vezavo EGF na njegov receptor zahteva jedro fucosylation N-glikanov v EGFR.

• Plos Genetics: zarodne Mutacije MAP3K6 so povezani z družinsko želodca Cancer
• Plos ONE: Odkritje tumorski markerji za Rak želodca s Proteomics