PLoS ONE: den prognostiske betydning af apoptose-relaterede biologiske markører i kinesisk Gastric kræftpatienter

Abstrakt

Baggrund og Formål

Den
prognose varierede blandt patienter med samme scene, derfor var der behov for nye prognostiske og prædiktive faktorer. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere forholdet af apoptose-relaterede biologiske markører, såsom p53, bcl-2, Bax og c-myc, og klinisk-patologiske træk og deres prognostiske værdi.

Metoder

Fra 1996 til 2007 var 4426 patienter gennemgået helbredende D2 gastrektomi for mavekræft på Fudan University i Shanghai cancer center. Blandt 501 patienter, ekspressionsniveauerne af p53, bcl-2, Bax og c-myc blev undersøgt ved immunhistokemi. Den prognostiske værdi af biologiske markører og sammenhængen mellem biologiske markører og andre klinisk-patologiske faktorer blev undersøgt.

Resultater

Der var 339 mænd og 162 kvinder med en gennemsnitsalder på 57. procentdele af positiv ekspression af p53, bcl-2, Bax og c-myc var 65%, 22%, 43% og 58%, hhv. Der var en stærk korrelation mellem p53, bax, og c-myc-ekspression ( P
= 0,00). Der var signifikant sammenhæng mellem bcl-2, og bax udtryk ( P
< 0,05). p53-ekspression korreleret med histologisk bedømmelse ( P
= 0,01); bcl-2 udtryk med patologisk stadium ( P
= 0,00); Bax udtryk med mandlige ( P
= 0,02), histologisk bedømmelse ( P
= 0,01), BORRMANN type ( P
= 0,01), tumor placering ( P
= 0,00), lymfeknude metastaser ( P
= 0,03), og patologisk stadium ( P
= 0,03); c-myc udtryk med BORRMANN type ( P
= 0,00). bcl-2-ekspression var relateret med god overlevelse i univariat analyse ( P
= 0,01). Multivariate analyse viste, at bcl-2-ekspression og patologisk stadium blev defineret som uafhængige prognostiske faktorer. Der var signifikante forskelle i de samlede 5-årige overlevelsesrater efter bcl-2-ekspression eller ikke i fase IIB ( P
= 0,03).

Konklusion

udtryk for bcl-2 var en uafhængig prognostisk faktor for patienter med gastrisk cancer; det kunne være en kandidat til mavekræft iscenesættelse systemet

Henvisning:. Liu X, Cai H, Huang H, Long Z, Shi Y, Wang Y (2011) den prognostiske betydning af apoptose-relaterede biologiske markører i Kinesisk Gastric kræftpatienter. PLoS ONE 6 (12): e29670. doi: 10,1371 /journal.pone.0029670

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: Juni 29, 2011; Accepteret: December 2, 2011; Udgivet: December 28, 2011

Copyright: © 2011 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selvom forekomsten af ​​mavekræft er blevet væsentligt faldende. i flere årtier, var det stadig den fjerde mest almindelige cancer og den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald [1], [2]. Det var meget vigtigt at forudsige præcist risikoen for dårlig prognose for at maksimere den terapeutiske virkning og for at minimere de skadelige virkninger ved behandling af kræftpatienter. Blandt de prognostiske faktorer nu til rådighed for mavekræft, den mest præcise og vigtige prognostiske faktor var UICC TNM stadie. Som følge af variabiliteten af ​​prognosen i samme fase af gastrisk cancer, var det umuligt præcist at forudsige prognosen gennem de konventionelle mellemstationer procedurer. Derfor var det nødvendigt at søge efter andre specifikke faktorer til at identificere undergrupper af patienter med mere aggressive forløb af sygdommen. For nylig har nogle studier vist, at andre patologiske faktorer, såsom antallet af positive lymfeknuder, tilstedeværelsen af ​​ekstrakapsulær lymfeknudeinvolvering, og tumorstørrelse havde yderligere prognostisk værdi [3] - [5]. I betragtning af, at nogle biologiske markører, såsom onkogener, tumor-suppressor gener, celle-cyklus regulatorer og DNA reparation gener, var relateret til tumor tilblivelse, vækst, invasion og metastase, mange forskere var dedikeret til at søge efter de nye prognostiske faktorer med disse molekylære markører. På trods af det faktum, at et par af undersøgelser har evalueret den prognostiske betydning af de markører, såsom p53, bcl-2, Bax og c-myc i gastrisk cancer, var resultaterne kontroversielle [6] - [11]. Desuden blev disse tidligere undersøgelser udført for at forske i yderligere prognostiske værdi af markørerne til 6. UICC TNM stadie, var det vigtigt at belyse forholdet mellem disse beslutningstagere og det 7. UICC TNM stadie. Til sidst var der ingen studier, der evaluerer udtryk for disse molekylære prognostisk betydning i mavecancerpatienter i Kina. Derfor evalueret vi ekspressionen af ​​biologiske markører, såsom p53, bcl-2, Bax og c-myc i denne undersøgelse.

p53-proteiner var produkterne af tumorsuppressorgener, der handlede ved modulering af celleproliferation via kontrol af G1 arrest checkpoint i cellecyklussen [12], [13]. bcl-2 og Bax tilhørte bcl-2-familien, og sidstnævnte var en af ​​de mest relevante klasser af apoptose regulatoriske molekyler. Bcl-2-familien blev klassificeret i to underfamilier: anti-apoptose-proteiner (bcl-2, bcl-XL, Bcl-w, BFL-1, prale-1, og MCL-1) og pro-apoptose-proteiner (Bax, bak , bcl-Xs, dårlig, bud, og HRK) [14]. Det er blevet vist, at Bax at bcl-2 kan påvirke den relative følsomhed eller resistens af celler på apoptotiske simuli [15]. c-myc-protein var en slags transkriptionsfaktor. En tidligere undersøgelse viste c-myc ekspression blev forbundet med celleproliferation [16].

I denne undersøgelse vurderede vi ekspressionen af ​​biologiske markører, såsom p53, bcl-2, Bax og c-myc, korreleret deres udtryk for klinisk-patologiske egenskaber og evalueret deres prognostiske værdi.

Materialer og metoder

patienter

i løbet af januar 1996 og december 2007 4426 patienter med histologisk bekræftet primær gastrisk adenocarcinom undergik helbredende D2 gastrektomi ved Institut for mavekræft og bløddelssarkom i Fudan University Shanghai Cancer center. Ud af disse patienter blev 501 sager udvalgt, da deres prøver blev farvet immunhistokemisk efter operation med rutinemæssig histologisk undersøgelse. Data blev hentet fra patienternes operative og patologiske rapporter, og opfølgende data blev opnået via telefon, brev, og den ambulante kliniske database. Denne undersøgelse omfattede 339 mænd og 162 kvinder i alderen fra 22 til 82 år, gennemsnitsalder var 57 år. Staging blev udført ifølge den UICC TNM staging Klassificering for Carcinoma af maven (syvende udgave, 2010). En opfølgning af alle patienter blev udført i henhold til vores standard-protokol (hver tredje måned i mindst 2 år, hvert halve år for de næste 3 år, og efter 5 år hver 12. måned for livet). Check-up poster, der indgår fysisk undersøgelse, tumor-markør undersøgelse, ultralyd, bryst radiografi, CT-scanning, og endoskopisk undersøgelse. Den mediane follow-up tid var 44,6 måneder på tidspunktet for analysen. Den skriftlige informerede samtykke var blevet indhentet fra alle patienter, og denne undersøgelse blev godkendt af Etisk Komité Shanghai Cancer Center of Fudan University. Undersøgelsen var retrospektiv.

Immunohistokemisk farvning

p53, bcl-2, Bax og c-myc blev påvist ved immunohistokemisk metode. Alle primære antistoffer og monoklonale muse-antistoffer blev anskaffet fra Dako (Hamborg. Tyskland). Immunhistokemisk farvning blev udført ved (ELPS) metode forbedre mærket polymersystem, med 10% formalin-fikserede, paraffinindlejrede materialer. Serielle 5 um paraffinsnit blev deparaffinised med xylen og hydreret med ehanol /deioniseret vand. Snit blev derefter inkuberet med methanol /0,3% H _{2O 2 i 10 minutter og blokeret med uspecifik farvning blokerende reagens. Efter inkubation natten over ved 4 ° C med anti-p53, bcl-2, Bax og c-myc-antistof (fortyndet 1:100, 1:100, 1:100, 1:100 henholdsvis), sektioner blev behandlet ifølge standard immunoperoxidase metoder under anvendelse af et streptavidin biotin peroxidise kompleks kit (LSAB + kit /HRP; Dako). Den peroxidise Reaktionen blev derefter fremkaldt med diaminobenzidin (Dako). Negative kontrolsnit blev underkastet den samme fremgangsmåde, bortset fra at det første antistof blev erstattet af PBS. Ingen positiv farvning blev observeret i kontrollerne. Placeringen af ​​farvning var overvejende celle cytoplasma for bax og c-myc, cytoplasma og cytomembrane for bcl-2, kerne for p53.}

immunhistokemisk farvning scoring

Alle skiverne blev evalueret af to patologer uden kendskab til kliniske resultater. Procentdelen af ​​immunoreaktivt celler og farvningsintensiteter blev evalueret i hver prøve. Procentdelen af ​​immunoreaktive celler blev gradueret på en skala fra 0 til 4: scores nogen farvning som 0, 1-10% af celler farvet scorede som 1, 11-50% som 2, 51-80% som 3, og 81- 100% som 4. farvningsintensiteter blev gradueret fra 0 til 3: 0 er defineret som negativ, 1 som svag, 2 som modereret, og 3 så stærk, hhv. De rå data blev konverteret til den immunhistokemiske score (IHS) ved at multiplicere mængden og intensitet scoringer. En IHS score på 9-12 blev betragtet som stærk immunoreaktivitet (+++), 5-8 som moderat (++), 1-4 svag (+), og 0 som negativ (-). På den sidste ende tilfældene havde en score på mindre end 1 blev betragtet som negative, og ≥1 blev betragtet som positiv.

Statistisk analyse

Sammenhængen mellem klinisk-patologiske faktorer og biologiske markører blev evalueret ved Chi-square test. Fem-års overlevelse blev beregnet ved Kaplan-Meier-metoden, og forskelle mellem overlevelseskurverne blev undersøgt med log-rank test. Alle væsentlige variabler observeret i univariat analyse blev medtaget i den multivariate overlevelse analyse ved hjælp Cox proportional hazard model. Det accepterede signifikansniveau var P
< 0,05. Statistiske analyser og grafik blev udført ved hjælp af SPSS 13.0 statistisk pakke (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultater

klinisk-patologisk karakteristika

Der var 339 mænd og 162 kvinder (2.09: 1) med en gennemsnitsalder på 57 år. Der var 57 (11,4%) tidlige gastrisk kræft og 444 (88,6%) avancerede gastrisk kræft. Ifølge histologisk type, blev observeret veldifferentierede tumorer i 9 (1,8%) patienter, moderat differentierede i 164 (32,7%) patienter, og dårligt differentierede tumorer i de resterende 328 (65,5%) patienter. Ifølge BORRMANN typen, 57 (10,4%) var type 0, 36 (7,2%) type I, 15 (3,0%) type II, 371 (74,0%) type III, 22 (4,4%) type IV. Af 501 patienter, 159 (31,7%) havde tumorer placeret i den øverste tredjedel, 72 (14,4%) havde tumorer i den midterste tredjedel, 244 (48,7%) havde tumorer i den nederste tredjedel af maven, og 26 (5,2%) havde tumorer besatte to tredjedele eller mere af maven. Lymfeknudemetastase blev observeret i 356 patienter, metastaser sats var 71,1%. Fordelingen af ​​patologisk etape var som følger: 35 (7,0%) patienter tilhørte iscenesætte IA, 52 (10,4%) IB, 60 (12,0%) IIA, 83 (16,5%) IIB, 88 (17,6%) IIIA, 83 ( 16,5%) IIIB, og 100 (20,0%) IIIC.

p53 udtryk

p53-ekspression var positiv i 64,9% af alle mavekræft væv. p53 farvning blev observeret i kernen af ​​carcinomceller (figur 1). p53-ekspression var forbundet med Bax og c-myc (tabel 1). Well-opdelte histologi korreleret med p53 udtryk. Der var ingen korrelation med køn, alder, BORRMANN type, tumor location, lymfeknudemetastase, og patologisk stadium (tabel 2).

bcl-2-ekspression

bcl-2-ekspression var positiv i 22,2% af alle mavekræft væv. bcl-2-farvning blev observeret i cytoplasmaet og cytomembrane af carcinomaceller (figur 1). bcl-2-ekspression var forbundet med Bax (tabel 1). Der var korrelation med patologisk stadium, men ingen sammenhæng med køn, alder, histologisk type, BORRMANN type, tumor placering, lymfeknude metastaser, og (tabel 2).

bax udtryk

bax udtryk var positiv i 42,9% af alle mavekræft væv. Bax farvning blev observeret i cytoplasmaet i carcinomceller (figur 1). Bax ekspression blev associeret med p53, bcl-2 og c-myc (tabel 1). Kvindelige køn, moderat-opdelte, BORRMANN II, øvre tredjedel placering, og lymfeknude metastaser korreleret med bax udtryk. Som den patologiske stadium steg ekspressionen af ​​Bax blev hyppigere. Der var ingen sammenhæng med alderen (tabel 2).

c-myc udtryk

c-myc udtryk var positiv i 58,1% af alle mavekræft væv. c-myc farvning blev observeret i cytoplasmaet i carcinomceller (figur 1). c-myc ekspression blev associeret med p53, og Bax (tabel 1). BORRMANN III korreleret med c-myc-ekspression. Der var ingen korrelation med køn, alder, histologisk type, tumor location, lymfeknudemetastase, og patologisk stadium (tabel 2). Desuden blev rå data om klinisk-patologiske funktioner og immunoreaktivitet evalueringer for 501 tilfælde af mavekræft viste som en supplerende tabel i et Excel-format (tabel S1).

univariat analyse

over-all fem årig overlevelsesrate var 53,7% for alle 501 patienter. Fem-årige overlevelsesrate var 64,9% og 50,5% i bcl-2 positive og bcl-2-negative patienter henholdsvis og denne forskel var statistisk signifikant (fig. 2). Bortset fra bcl-2-ekspression, de betydelige prognostiske faktorer inkluderet: tumorstedet, BORRMANN type, status af lymfeknuder, og patologisk stadium. Tabel 3 viste resultater ved univariat analyse for prognostiske faktorer.

Multivariat analyse

Multivariate overlevelse analyse, herunder alle væsentlige prognostiske faktorer, der er nævnt i univariat analyse blev udført for at bestemme de uafhængige prognostiske faktorer for mavekræft . Multivariat analyse ved hjælp Cox proportional hazard model viste, at bcl-2 ekspression og patologisk stadium var uafhængige prognostiske faktorer (tabel 4).

Sammenligning af overlevelse efter biologiske markører på samme stadie

Ifølge 7th UICC TNM, mavekræft var opdelt i 7 faser: fase IA, scene IB, scene IIA, IIB, IIIA, IIIB, IIIC. Basere på den bcl-2-ekspression blev hver fase delt i bcl-2 positive og bcl-2-negativ gruppe. Der var signifikante forskelle på over-all fem-års overlevelse mellem bcl-2 positive og bcl-2 negative gruppe i henhold til fase IIB ( P
= 0,003). Derudover fandt vi, at der var betydelige forskelle på over-all fem-års overlevelse mellem bcl-2 positive og bcl-2 negative gruppe efter BORRMANN III ( P
= 0,002); ingen signifikante forskelle i henhold til trin II og fase III (figur 3).

Diskussion

Identifikationen af ​​prognostiske faktorer i mavekræft var afgørende for at forudsige patienternes overlevelse og bestemme optimale terapeutiske strategier. Mange undersøgelser har indikeret, at dybden af ​​invasion og lymfeknudemetastase var de vigtigste prognostiske faktorer i gastrisk cancer [17], [18]. Som følge af variabiliteten af ​​prognosen inden samme patologiske stadium af mavecancer, har der været en masse undersøgelser for specifikke biologiske markører til at identificere patienter med dårligere prognose [19] - [21]. I mellemtiden blev ekspressionen af ​​p53, bcl-2, Bax og c-myc kendt for at være relateret til tumorogenesis. Derfor er målet med denne undersøgelse var at undersøge, om disse biologiske markører kan anvendes som yderligere prognostiske faktorer til traditionel TNM stadie i gastrisk cancer. I denne undersøgelse blev ekspressionen af ​​disse proteiner undersøgt i 501 tilfælde af resektion primære humane gastriske cancere.

immunhistokemiske ekspressionshastigheder af p53, bcl-2, Bax og c-myc var 64,9%, 22,2% , 42,9%, 58,1%, henholdsvis, og disse resultater var i overensstemmelse med ekspression satser af andre undersøgelser rapporteret som 17-84,1%, fra 12,7 til 67%, fra 42,4 til 58,0%, 23,5 til 72,9%, henholdsvis [9], [12 ], [22] - [26]. p53 spillede en vigtig rolle i apoptose. Det ændrede hyppigst i human cancer. Vildtype p53-protein induceret vækststandsning ved G1 /S fase af cellecyklussen som respons på DNA-skade, hvilket således forhindrer proliferation af celler. Dæmpet-p53 mistet funktion, og tilladt celler med beskadiget DNA til at formere. I denne undersøgelse blev en omvendt korrelation mellem p53 og histologisk type, der findes, som påviste, at deregulering af p53 kan resultere i ukontrolleret proliferation i gastrisk cancer. Det var konsistent med en tidligere undersøgelse [22]. Det var kontroverser som for den prognostiske værdi af p53, har nogle undersøgelser rapporteret, at p53 var forbundet med dårlig prognose [27], [28], mens andre rapporterede, at p53 ikke har nogen indflydelse på prognose [29], [30]. Vores forskning viste, at p53 ikke var relateret til prognosen af ​​gastrisk cancer. Bax fungerede som en accelerator af apoptose på celle liv. En tidligere undersøgelse foreslog, at forholdet mellem Bax til bcl-2 spillet en afgørende rolle i reguleringen af ​​tilbøjelighed til apoptose [31]. I den foreliggende undersøgelse blev ekspressionen af ​​Bax forbundet med den af ​​bcl-2 og bax overekspression korrelerede signifikant med nogle klinisk-patologiske funktioner såsom køn, histologisk type, BORRMANN type, tumor location, og lymfeknudemetastase. Vi fandt, at patienter med positiv ekspression af Bax var tilbøjelige til at præsentere lymfeknudemetastase, og bax var ikke en uafhængig prognostisk faktor. Dette resultat var forskelligt fra et tidligere forskning. Anagnostopoulos et al. [24] rapporterede, at negative bax ekspression i gastrisk var forbundet med lymfeknudemetastaser og dårlig klinisk prognose. Årsagerne til de modstridende resultater var ikke klar. Det var muligt at gen forskelle mellem vestlige mennesker og østlige mennesker har bidraget til dette. Den proto-onkogen c-myc var en mester regulator af celledeling og transformation gennem både transkriptionelle og nontranscriptional midler, og ofte blev dereguleret i humane maligniteter. Ninomiya et al. [26] rapporterede, at overskydende reaktivitet til c-myc produkt forekom hyppigere i invasive kræftformer end i lokaliserede kræftformer, og c-myc produktion udtryk i kræftvæv korreleret godt med peritoneal udbredelse, og patienter med c-myc positivt udtryk havde dårligere prognose end dem med c-myc negative udtryk. I nærværende undersøgelse har vi ikke finde nogen sammenhæng mellem c-myc udtryk og invasive adfærd og andre end BORRMANN typen prognose. Vi fandt, at c-myc-ekspression blev mere forbundet med BORRMANN III.

bcl-2-genet blev først beskrevet som et onkogen i follikulært lymfom. Det var godt kendt for at hæmme apoptose [32], men nogle undersøgelser har rapporteret, at overekspression af bcl-2 undertrykte celleproliferation og var forbundet med mindre aggressiv biologisk opførsel [33], [34]. bcl-2 er blevet rapporteret i en række humane epiteliale maligne tumorer, herunder gastrisk carcinoma. Men den nøjagtige rolle og kliniske betydning af bcl-2 forblev, ikke belyst. Tidligere undersøgelser har vist, at ekspressionen af ​​bcl-2 blev forbundet med bedre prognose i ikke-småcellet lungecancer og mavecancer [35], [36]. Pietenpol et al. [37] rapporterede, at overekspression af bcl-2 inhiberede væksten af ​​adskillige faste tumorcellelinier. Saegusa et al. [33] viste, at hovedparten af ​​bcl-2 + cancerceller var i en Non-proliferativ tilstand, og den gennemsnitlige ekspression af Ki-67 mærkningsindeks og apoptotisk mærkningsindeks i Bcl-2 + foci var væsentligt lavere end den, bcl-2- foci. Aizawa et al. [36] viste, at ekspression af bcl-2 i fremskreden mavekræft var forbundet med en lavere apoptotisk indeks og en bedre prognose. Alle disse undersøgelser antydet, at bcl-2 ikke kun inhiberede apoptose, men også undertrykt cellulær proliferativ aktivitet. I nærværende undersøgelse, vi kendetegnet for første gang ekspressionen af ​​bcl-2-proteiner i kinesiske mavecancerpatienter. Vores data viser, at bcl-2 var signifikant korreleret med bedre overlevelse.

Identifikationen af ​​prognostiske faktorer i mavekræft var afgørende for at forudsige patienternes overlevelse og bestemme optimale terapeutiske strategier. Det var velkendt, at dybden af ​​invasion og tilstedeværelse eller fravær af lymfeknudemetastase var de vigtigste prognostiske faktorer i gastrisk cancer. Det var imidlertid umuligt præcist at forudsige prognosen gennem de konventionelle mellemstationer procedurer som følge af variabiliteten af ​​prognosen i samme fase af mavekræft. Liu et al. [5] fandt, at der var betydelige forskelle mellem de større størrelse tumor gruppe og den lille størrelse tumor gruppe efter trin IIIB og IV. Derfor var det nødvendigt at søge efter de andre specifikke faktorer til at identificere undergrupper af patienter med mere aggressive sygdomsforløb især i 7. udgaver af UICC TNM. Ifølge den 7. UICC TNM klassifikation blev hver fase af mavekræft yderligere opdelt i bcl-2 positive og bcl-2-negativ gruppe. Vores data viste, at ekspressionen af ​​bcl-2 i høj grad påvirket prognose i trin IIB. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​bcl-2 kunne give yderligere prognostisk information i patienter med mavekræft.

Nogle begrænsninger af denne undersøgelse bør anerkendes. For det første blev status for Helicobacter pylori ikke beskrevet. Som en afgørende carcinogen af ​​gastrisk cancer, kunne Helicobacter pylori være knyttet til visse andre parametre, såsom bcl-2. For det andet blev forholdet mellem tumor tilbagefald og bcl-2 ikke undersøgt.

Som konklusion kan ekspressionen af ​​bcl-2 tjener som en nyttig indikator til forudsigelse af prognose af patienter med gastrisk cancer. Derfor kan det være en kandidat til iscenesættelsen som supplement til traditionelle faktorer.

Støtte oplysninger
tabel S1.
Rå data om klinisk-patologiske funktioner og immunoreaktivitet evalueringer for 501 tilfælde af mavekræft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029670.s001
(XLS)

• PLoS ONE: Stathmin1 Afspiller Onkogen Rolle og er mål for MicroRNA-223 i gastrisk Cancer
• PLoS ONE: Gene Expression Signature Analyse Identificerer Vorinostat som kandidat terapi for gastrisk Cancer