PLoS ONE: De prognostische betekenis van apoptose-gerelateerde biologische merkers in het Chinees MaagKanker Patients

De abstracte

Achtergrond en Doelstelling

De
prognose varieerde tussen de patiënten met de hetzelfde stadium, dus was er een behoefte aan nieuwe prognostische en voorspellende factoren. Het doel van deze studie was om de relatie van apoptose-gerelateerde biologische merkers zoals p53, bcl-2, bax, en c-myc en clinicopathologische eigenschappen en de prognostische waarde beoordelen.

Methods

van 1996 tot 2007 hadden 4426 patiënten curatief D2 gastrectomie voor maagkanker ondergaan aan de Fudan Universiteit in Shanghai Cancer Center. Onder 501 patiënten, de expressieniveaus van p53, bcl-2, bax, en c-myc werden onderzocht door immunohistochemie. De prognostische waarde van biologische markers en de correlatie tussen biologische markers en andere klinische en pathologische factoren onderzocht.

Resultaten

Er waren 339 mannen en 162 vrouwen met een gemiddelde leeftijd van 57. De percentages positieve expressie van p53, bcl-2, bax, en c-myc waren 65%, 22%, 43% en 58%, respectievelijk. Er was een sterke correlatie tussen p53, bax, en c-myc-expressie ( P
= 0,00). Er was significant verband tussen bcl-2, bax en expressie ( P
< 0,05). p53 expressie gecorreleerd met de histologische graad ( P
= 0,01); BCL-2 expressie met pathologisch stadium ( P
= 0,00); bax expressie met mannelijke ( P
= 0,02), histologische graad ( P
= 0,01), Borrmann type ( P
= 0,01), tumor locatie ( P
= 0.00), lymfeklier metastase ( P
= 0,03), en pathologisch stadium ( P
= 0,03); c-myc expressie met Borrmann type ( P
= 0,00). BCL-2 expressie werd in verband met een goede overleving in univariate analyse ( P
= 0,01). Multivariate analyse toonde dat bcl-2-expressie en pathologische stadium werden gedefinieerd als onafhankelijke prognostische factoren. Er waren significante verschillen van de totale 5-jaarsoverleving volgens bcl-2 expressie of niet in fase IIB ( P
= 0,03).

Conclusie

De expressie van bcl-2 was een onafhankelijke prognostische factor voor patiënten met maagkanker; is het misschien een kandidaat voor de maagkanker enscenering systeem

Visum:. Liu X, Cai H, H Huang, Long Z, Shi Y, Y Wang (2011) De prognostische betekenis van apoptose-gerelateerde biologische merkers in Chinese Gastric kankerpatiënten. PLoS ONE 6 (12): e29670. doi: 10.1371 /journal.pone.0029670

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Ontvangen: 29 juni 2011; Aanvaard: 2 december 2011; Gepubliceerd: 28 december 2011

Copyright: © 2011 Liu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Hoewel het aantal gevallen van maagkanker is aanzienlijk afneemt. tientallen jaren, was het nog de vierde meest voorkomende kanker en de tweede meest voorkomende doodsoorzaak door kanker [1], [2]. Het was belangrijk om precies de kans op slechte prognose te voorspellen om het therapeutische effect te maximaliseren en bij de behandeling van kankerpatiënten de nadelige gevolgen. Onder de prognostische factoren nu beschikbaar voor maagkanker, de meest nauwkeurige en belangrijke voorspellende factor was de UICC TNM stadium. Als gevolg van de variabiliteit van de prognose in hetzelfde stadium van maagkanker, was het onmogelijk om de prognose precies te voorspellen via conventionele procedures staging. Daarom was het noodzakelijk om te zoeken naar de andere specifieke factoren om subgroepen van patiënten met agressieve verloop van de ziekte te identificeren. Onlangs hebben sommige studies aangetoond dat andere pathologische factoren, zoals het aantal positieve lymfeknopen aanwezigheid van extracapsulaire lymfeklieren en tumorgrootte hadden extra prognostische waarde [3] - [5]. Aangezien sommige biologische markers, zoals oncogenen, tumor-suppressor genen, celcyclus regulatoren en DNA repair genen gerelateerd waren aan tumoren ontstaan, groei, invasie en metastase, vele wetenschappers gewijd aan het zoeken naar de nieuwe prognostische factoren deze moleculaire merkers. Ondanks het feit dat enkele studies de prognostische betekenis van de markers, zoals p53, bcl-2, bax, en c-myc bij maagkanker geëvalueerd, de resultaten waren omstreden [6] - [11]. Bovendien zijn deze eerdere studies uitgevoerd om de aanvullende waarde van de prognostische merkers naar de 6e UICC TNM onderzoek was dringend om de relatie tussen deze fabrikanten en de 7de UICC TNM helderen. Eindelijk waren er geen studies ter evaluatie van de expressie van deze moleculaire prognostische betekenis bij maagkanker patiënten in China. Daarom onderzochten we de expressie van biologische merkers zoals p53, bcl-2, bax, en c-myc in deze studie.

p53 proteïnen waren de producten van tumorsuppressorgenen, die optrad door het moduleren celproliferatie via controle van de G1 arrestatie controle punt van de celcyclus [12], [13]. bcl-2 en bax behoorde tot de bcl-2 familie, en de laatste was een van de belangrijkste klassen van apoptose regulerende moleculen. Het bcl-2 familie werden ingedeeld in twee subfamilies: anti-apoptose proteïnen (bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, bfl-1, schep-1 en MCL-1) en pro-apoptose proteïnen (bax, bak , BCL-Xs, slecht, bid, en HRK) [14]. Aangetoond is dat de Bax Bcl-2 kan liggen dat de relatieve gevoeligheid of resistentie van cellen aan simuli [15] apoptotische. c-myc proteïne een type transcriptiefactor. Een eerdere studie toonde de c-myc-expressie is toegevoegd met celproliferatie [16].

In deze studie, evalueerden we de expressie van biologische merkers zoals p53, bcl-2, bax, en c-myc, gecorreleerd hun expressie aan klinisch-pathologische kenmerken en evalueerden hun prognostische waarde.

Materialen en methoden

patiënten

In januari 1996 en december 2007, 4426 patiënten met een histologisch bevestigde primaire maagdarmkanker onderging curatieve D2 gastrectomy bij de afdeling maagkanker en weke delen sarcoom in Fudan University Shanghai Cancer Center. Van deze patiënten, werden 501 gevallen geselecteerd, omdat hun monsters immunohistochemisch werden gekleurd na de operatie met routine histologisch onderzoek. Gegevens werden opgehaald uit operatieve en pathologische rapporten van patiënten, en follow-up gegevens werden verkregen via de telefoon, brief, en de polikliniek klinische database. Dit onderzoek bestond uit 339 mannen en 162 vrouwen 22-82 jaar oud, gemiddelde leeftijd was 57 jaar. Staging werd uitgevoerd volgens de UICC TNM staging Indeling voor carcinoom van de maag (zevende editie, 2010). Een follow-up van alle patiënten werd volgens onze standaard protocol uitgevoerd (om de drie maanden voor ten minste 2 jaar, om de zes maanden voor de komende 3 jaar, en na 5 jaar elke 12 maanden voor het leven). De check-up items opgenomen lichamelijk onderzoek, tumor-marker onderzoek, echografie, borst radiografie, computertomografie tomografische scan, en endoscopisch onderzoek. De mediane follow-up tijd was 44,6 maanden op het moment van de analyse. De schriftelijke toestemming was verkregen van alle patiënten, en deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Shanghai Cancer Center van Fudan University. De studie was retrospectief.

Immunohistochemische kleuring

p53, bcl-2, bax, en c-myc werden gedetecteerd door immunohistochemische methode. Alle primaire antilichamen en muizen monoklonale antilichamen werden verkregen van Dako (Hamburg. Duitsland). Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd door het verbeteren gemerkte polymeersysteem (ELPS) methode, met 10% formaline gefixeerd, in paraffine ingebedde materialen. Serial 5 pm paraffine secties werden deparaffinised met xyleen en gehydrateerd met ehanol /gedemineraliseerd water. Daarna werden de secties geïncubeerd met methanol /0,3% H _{2O 2 gedurende 10 min en geblokkeerd met aspecifieke kleuring blokkeringsreagens. Na overnacht incubatie bij 4 ° C met anti-p53, bcl-2, bax, en c-myc antilichaam (verdund 1:100, 1:100, 1:100, 1:100 respectievelijk), coupes werden behandeld volgens standaard immunoperoxidase methoden met behulp van een streptavidine biotine-peroxidase complex kit (LSAB + kit /HRP; Dako). De peroxidase reactie werd vervolgens ontwikkeld met diaminobenzidine (Dako). Negatieve controle coupes werden onderworpen aan dezelfde procedure, behalve dat het eerste antilichaam werd vervangen door PBS. Geen positieve kleuring werd waargenomen in de controles. De positie van de kleuring was voornamelijk in cel cytoplasma voor bax en c-myc, cytoplasma en cytomembrane voor BCL-2, kern voor p53.}

Immunohistochemische kleuring scoring

Alle schijfjes werden geëvalueerd door twee pathologen zonder kennis van de klinische uitkomst. Het percentage immunoreactieve cellen en kleuring intensiteiten werden bij elk monster. Het percentage immunoreactieve cellen werd beoordeeld op een schaal van 0 tot 4: geen kleuring wordt gescoord als 0, 1-10% van de cellen gekleurd gescoord als 1, 11-50% als 2, 51-80% als 3 en 81- 100% als 4. De kleuring intensiteiten werd gerangschikt van 0 tot 3: 0 wordt gedefinieerd als negatieve, zwak 1, 2 en gemodereerd en 3 zo sterk, respectievelijk. De ruwe gegevens werden omgezet in de immunohistochemische score (IHS) door vermenigvuldiging van de hoeveelheid en intensiteit scores. Een IHS score van 9-12 werd beschouwd als een sterke immunoreactiviteit (+++), 5-8 als matig (++), 1-4 als zwak (+), en 0 als negatief (-). Aan de uiteindelijke analyse, de gevallen had een score van minder dan 1 werden beschouwd als negatief, en ≥1 werd als positief beschouwd.

Statistische analyse

Het verband tussen klinische en pathologische factoren en biologische markers werd geëvalueerd door Chi-kwadraat test. Vijf-jaarsoverleving werd berekend door Kaplan-Meier-methode, en de verschillen tussen de overleving curves werden onderzocht met log-rank test. Alle belangrijke variabelen waargenomen in univariate analyse werden opgenomen in de multivariate survival analyse met behulp van Cox proportionele risico model. De geaccepteerde niveau van betekenis was P Restaurant < 0,05. Statistische analyses en grafieken werden uitgevoerd met behulp van de SPSS 13.0 statistisch pakket (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultaten

klinisch-pathologische kenmerken

Er waren 339 mannen en 162 vrouwen (2,09: 1) met een gemiddelde leeftijd van 57 jaar. Er was 57 (11,4%) vroege maagkanker en 444 (88,6%) gevorderde maagkanker. Volgens weefseltype werden goed gedifferentieerde tumoren waargenomen bij 9 (1,8%) patiënten, matig gedifferentieerd in 164 (32,7%) patiënten en slecht gedifferentieerde tumoren overige 328 (65,5%) patiënten. Volgens Borrmann type 57 (10,4%) waren het type 0, 36 (7,2%) type I, 15 (3,0%) type II, 371 (74,0%) type III, 22 (4,4%) type IV. Van 501 patiënten, 159 (31,7%) had tumoren in het bovenste derde, 72 (14,4%) had tumoren in het middelste derde deel, 244 (48,7%) had tumoren in het onderste deel van de maag, en 26 (5,2%) had tumoren bezetten twee derde of meer van de maag. Lymfeklier metastase werd waargenomen bij 356 patiënten, de metastase bedroeg 71,1%. De verdeling van pathologisch stadium was als volgt: 35 (7,0%) patiënten was voor stadium IA, 52 (10,4%) IB, 60 (12,0%) IIA, 83 (16,5%) IIB, 88 (17,6%) IIIA, 83 ( 16,5%) IIIB, en 100 (20,0%) IIIC.

p53 expressie

p53-expressie was positief in 64,9% van alle maagkanker weefsels. p53 kleuring werd waargenomen in de kern van carcinoomcellen (figuur 1). p53 werd geassocieerd met bax en c-myc (Tabel 1). Goed gedifferentieerde histologie gecorreleerd met p53 expressie. Er was geen correlatie met geslacht, leeftijd, Borrmann type tumor locatie, lymfeklieren metastase, en pathologisch stadium (tabel 2).

BCL-2 expressie

BCL-2 expressie was positief in 22,2% van maagkanker weefsels. bcl-2-kleuring werd waargenomen in het cytoplasma en cytomembrane van carcinoomcellen (figuur 1). bcl-2-expressie was geassocieerd met bax (tabel 1). Er was correlatie met pathologisch stadium, maar geen verband met geslacht, leeftijd, histologische type, de Borrmann type tumor locatie, lymfeklieren metastase, en (tabel 2).

Bax expressie

bax expressie was positief in 42,9% van maagkanker weefsels. bax kleuring werd waargenomen in het cytoplasma van carcinoomcellen (figuur 1). bax-expressie was geassocieerd met p53, bcl-2 en c-myc (Tabel 1). Vrouwelijk geslacht, matig gedifferentieerd, Borrmann II, bovenste derde plaats, en lymfeklier metastasen gecorreleerd met bax expressie. Als pathologisch stadium verhoogde de expressie van bax werd vaker. Er was geen correlatie met de leeftijd (tabel 2).

c-myc expressie

c-myc-expressie positief in 58,1% van maagkanker weefsels was. c-myc kleuring werd waargenomen in het cytoplasma van carcinoomcellen (figuur 1). c-myc-expressie was geassocieerd met p53 en bax (tabel 1). Borrmann III gecorreleerd met c-myc-expressie. Er was geen correlatie zien met geslacht, leeftijd, weefseltype, tumorlokalisatie, lymfeknoop metastase en pathologisch stadium (tabel 2). Bovendien, ruwe data op clinicopathologische functies en immunologische evaluaties voor 501 gevallen van maagkanker werd toonde als een extra tafel in een Excel-formaat (tabel S1).

Univariate analyse

De over-all vijf -jarig overleving was 53,7% voor alle 501 patiënten. Vijf-jaars overleving was 64,9% en 50,5% in BCL-2 positieve en bcl-2 negatieve patiënten respectievelijk, en dit verschil was statistisch significant (fig. 2). Behalve bcl-2-expressie, het belangrijke prognostische factoren opgenomen: tumor, Borrmann type status van lymfeklieren en pathologisch stadium. Tabel 3 vertoonden bevindingen univariate analyse prognostische factoren.

Multivariaatanalyse

Multivariate overlevingsanalyse inclusief alle significant univariate analyse vermelde prognostische factoren, werd uitgevoerd om de onafhankelijke prognostische factoren voor maagkanker bepalen . Multivariate analyse met Cox proportional hazards model bleek dat bcl-2-expressie en pathologische stadium waren onafhankelijke prognostische factoren (Tabel 4).

Vergelijking van overleving afhankelijk van biologische markers in hetzelfde stadium

Volgens 7e UICC TNM-classificatie, maagkanker was verdeeld in 7 fasen: fase IA, IB podium, stadium IIA, IIB, IIIA, IIIB, IIIC. Op basis van de BCL-2 expressie, werd elke fase verdeeld in bcl-2-positieve en bcl-2 negatieve groep. Er waren significante verschillen in overleving over-all 5 jaar tussen de BCL-2-positieve en bcl-2 negatieve groep volgens stadium IIB ( P
= 0,003). Bovendien vonden we dat er significante verschillen van-alles over 5-jaars overleving tussen de bcl-2-positieve en bcl-2 negatieve groep volgens Borrmann III ( P
= 0,002); geen significante verschillen volgens fase II en fase III (figuur 3).

Discussie

De identificatie van prognostische factoren bij maagkanker was van essentieel belang voor het voorspellen van de overleving van patiënten en het bepalen van de optimale therapeutische strategieën. Vele studies hebben aangetoond dat de diepte van invasie en lymfeklier waren de belangrijkste prognostische factoren bij maagkanker [17], [18]. Als gevolg van de variabiliteit van prognose binnen dezelfde pathologische stadium van maagkanker, zijn er veel onderzoekingen voor specifieke biologische merkers identificeren van patiënten met een slechtere prognose [19] - [21]. Ondertussen, de expressie van p53, bcl-2, bax, en c-myc zijn bekend om te worden geassocieerd met tumorogenese. Daarom was het doel van deze studie te onderzoeken of deze biologische merkers kan worden gebruikt als extra prognostische factoren traditionele TNM bij maagkanker. In dit onderzoek werd de expressie van deze eiwitten werd onderzocht in 501 gevallen van gereseceerd primaire menselijke maagkanker.

De immunohistochemische expressie prijzen van p53, bcl-2, bax, en c-myc waren 64,9%, 22,2% , 42,9%, 58,1%, respectievelijk, en de resultaten waren consistent met de expressie tarieven van andere studies gerapporteerd als 17-84,1% 12,7-67%, 42,4-58,0%, 23,5-72,9% respectievelijk [9], [12 ], [22] - [26]. p53 een belangrijke rol gespeeld bij apoptose. Het veranderde het vaakst in de menselijke kanker. Wildtype p53-eiwit geïnduceerde groeiremming op de G1 /S-fase van de celcyclus in respons op DNA beschadiging, waardoor de proliferatie van cellen voorkomen. Gedempte-type p53 verloor de functie, en liet cellen met beschadigd DNA te laten groeien. In deze studie, een omgekeerde correlatie tussen p53 en weefseltype werd gevonden, waaruit bleek dat deregulering van p53 kan leiden tot ongecontroleerde proliferatie bij maagkanker. Was consistent met een eerdere studie [22]. Het was controverse over de prognostische waarde van p53, hebben sommige studies dat p53 geassocieerd met een slechte prognose [27], [28], terwijl andere gemeld dat p53 heeft geen invloed op de prognose [29], [30]. Ons onderzoek toonde aan dat p53 niet gerelateerd aan de prognose van maagkanker. bax fungeerde als een versneller van apoptose op mobiele leven. Een eerdere studie voorgesteld dat de verhouding van Bax Bcl-2 een belangrijke rol gespeeld bij het reguleren van de neiging tot apoptose [31]. In deze studie, de expressie van bax geassocieerd met die van bcl-2 en Bax overexpressie significant gecorreleerd met een aantal klinische en pathologische kenmerken zoals geslacht, weefseltype, Borrmann soort, tumorlokalisatie en lymfeklier. We vonden dat patiënten met positieve uitdrukking van bax geneigd waren lymfekliermetastase presenteren en bax geen onafhankelijke prognostische factor. Dit resultaat verschilde van een eerder onderzoek. Anagnostopoulos et al. [24] gemeld dat negatieve bax expressie in de maag werd geassocieerd met lymfeklier metastase en een slechte klinische prognose. De redenen voor de tegenstrijdige resultaten waren niet duidelijk. Het was mogelijk dat het gen verschillen tussen westerse mensen en Oost mensen bijgedragen. De proto-oncogen c-myc was een meester regulator van de proliferatie en transformatie cel door middel van zowel transcriptie en nontranscriptional middelen, en werd vaak gedereguleerd in menselijke maligniteiten. Ninomiya et al. [26] gemeld dat overmaat reactiviteit tegen c-myc product vaker voorkwamen bij invasieve kanker dan in gelokaliseerde kanker en c-myc productie expressie in kankerweefsel goed gecorreleerd met peritoneale verspreiding, en patiënten met c-myc positieve expressie hadden slechtere prognose dan mensen met een c-myc negatieve expressie. In de huidige studie, hebben we geen relatie tussen de c-myc meningsuiting en invasieve gedrag en andere dan Borrmann soort prognose te vinden. We vonden dat c-myc expressie werd meer geassocieerd met Borrmann III.

Het bcl-2-gen werd eerst beschreven als een oncogen in folliculair lymfoom. Het was bekend dat ze apoptose [32] remmen, maar sommige studies hebben gemeld dat overexpressie van bcl-2 onderdrukt cellulaire proliferatie en is geassocieerd met minder agressief biologisch gedrag [33], [34]. bcl-2 is beschreven in diverse humane epitheliale maligne tumoren waaronder maagcarcinoom. De precieze rol en klinische betekenis van bcl-2 nog worden opgehelderd. Eerdere studies hebben aangetoond dat de expressie van bcl-2 is geassocieerd met een betere prognose in niet-kleine-cel-longkanker en maagkanker [35], [36]. Pietenpol et al. [37] gemeld dat overexpressie van bcl-2 remde de groei van verschillende vaste tumorcellijnen. Saegusa et al. [33] heeft aangetoond dat de meerderheid van bcl-2 + kankercellen was een proliferatieve toestand en de gemiddelde expressie van Ki-67 labeling index en etikettering apoptotische index bcl-2 + foci waren significant lager dan die in bcl-2- brandpunten. Aizawa et al. [36] liet zien dat de expressie van bcl-2 in gevorderde maagkanker geassocieerd met een lagere apoptotische index en een betere prognose. Al deze studies suggereerden dat bcl-2 niet alleen geremd apoptose, maar ook onderdrukt cellulaire proliferatie activiteit. In deze studie, karakteriseerden we voor de eerste keer de expressie van bcl-2 eiwit in Chinese maagkankerpatiënten. Onze gegevens toonden aan dat bcl-2 was significant gecorreleerd met een betere overleving.

De identificatie van prognostische factoren bij maagkanker was van essentieel belang voor het voorspellen van de overleving van patiënten en het bepalen van de optimale therapeutische strategieën. Het was bekend dat de diepte van de invasie en de aanwezigheid of afwezigheid van lymfekliermetastase waren de belangrijkste prognostische factoren bij maagkanker. Echter was het onmogelijk om de prognose precies te voorspellen via conventionele staging procedures als gevolg van de variabiliteit van de prognose in hetzelfde stadium van maagkanker. Liu et al. [5] blijkt dat er significante verschillen tussen de grotere omvang tumor groep en de kleine-size tumor groep volgens fase IIIb en IV. Daarom was het noodzakelijk om te zoeken naar de andere specifieke factoren om subgroepen van patiënten met agressieve verloop van de ziekte te identificeren vooral in de 7e editie van de UICC TNM-classificatie. Volgens de 7e UICC TNM classificatie, werd elk stadium van maagkanker verder onderverdeeld in bcl-2-positieve en bcl-2 negatieve groep. Onze gegevens toonden aan dat de expressie van bcl-2 sterk beïnvloed prognose in fase IIB. De resultaten gaven aan dat de expressie van bcl-2 aanvullende prognose in patiënten met maagkanker kan bieden.

enkele beperkingen van dit onderzoek moeten worden bevestigd. Eerst werd de status van Helicobacter pylori niet beschreven. Als een cruciale kankerverwekkend, maagkanker, kunnen Helicobacter pylori worden gekoppeld aan andere parameters zoals bcl-2. Ten tweede werd de relatie tussen tumor recidief en bcl-2 niet onderzocht.

Tot slot kan de expressie van bcl-2 dienen als een bruikbare indicator voor het voorspellen van de prognose van patiënten met maagkanker. Daarom zou het een kandidaat voor de staging-systeem in aanvulling op de conventionele factoren.

Ondersteunende informatie
Tabel S1.
Ruwe data op clinicopathologische functies en immunologische evaluaties voor 501 gevallen van maagkanker
doi:. 10.1371 /journal.pone.0029670.s001
(XLS)

• PLoS ONE: Stathmin1 Plays Oncogene Rol en een doelwit van MicroRNA-223 in Gastric Cancer
• PLoS ONE: Gene Expression Signature Analysis Geeft Vorinostat als een kandidaat-therapie voor maagkanker