PLoS ONE: Kopier Antal Gevinster ved 8q24 og 20q11-q13 i Gastric Cancer er mere almindelige i Tarm-Type end Diffuse-Type

Abstrakte

Den foreliggende undersøgelse havde til formål at opdage DNA-kopi nummer ændringer (CNA'er) involveret i carcinogenese af maven og på at forstå deres klinisk-patologiske betydninger i den koreanske befolkning. DNA-kopier, blev analyseret ved hjælp af Agilent 244K eller 400K vifte komparativ genomisk hybridisering (aCGH) i frisk frosset tumor og matchede normale væv fra 40 mavecancerpatienter. Nogle af de påviste CNA regioner valideret ved anvendelse multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MLPA) i seks af de 40 patienter og tilpasset Agilent 60K aCGH i et selvstændigt sæt af 48 gastrisk kræft. MRNA-niveauerne af gener ved de fælles CNA regioner blev analyseret ved brug af kvantitativ real-time PCR. Kopier nummer gevinster var mere udbredt end tab på tværs af hele genomet i tumorvæv sammenlignet med matchede normale væv. Det gennemsnitlige antal ændringer pr tilfælde var 64 for gevinster og 40 for tab, og median aberration længde var 44.016 bp for gevinster og 4732 bp for tab. Kopier nummer gevinster blev ofte opdages ved 7p22.1 (20%), 8q24.21 (27% -30%), 8q24.3 (22% -48%), 13q34 (20% -31%), og 20q11-q13 (25% -30%), og tab på 3p14.2 (43%), 4q35.2 (27%), 6q26 (23%), og 17p13.3 (20% -23%). CNA'er på 7p22.1, 13q34, og 17p13.3 er ikke blevet rapporteret i andre populationer. De fleste af de kopital tab var forbundet med nedregulering af mRNA-niveauer, men korrelationen mellem kopital gevinster og mRNA ekspressionsniveauer varieres i et gen-afhængig måde. Desuden kopital gevinster tendens til at forekomme mere almindeligt i intestinal-type cancere end i diffust-type kræftformer. Konklusionen er, at nærværende undersøgelse tyder, at kopi nummer gevinster på 8q24 og 20q11-q13 og tab på 3p14.2 kan være fælles arrangementer i mavekræft men CNAs på 7p22.1, 13q34, og 17p13.3 kan være koreansk-specifikke.

Henvisning: Jin DH, Park SE, Lee J, Kim KM, Kim S, Kim DH, et al. (2015) Copy Number gevinster på 8q24 og 20q11-q13 i Gastric Cancer er mere almindelige i Tarm-Type end Diffus-Type. PLoS ONE 10 (9): e0137657. doi: 10,1371 /journal.pone.0137657

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

Modtaget: Marts 8, 2015; Accepteret: August 19, 2015; Udgivet: 11 September, 2015

Copyright: © 2015 Jin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Dataene aCGH-244K og aCGH-400K kan downloades fra NCBI s Gene Expression Omnibus portal. (Www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, tiltrædelse nummer: GSE69318 og GSE69266 henholdsvis)

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National R &D Program for Cancer Control Ministeriet for Sundhed og Velfærd (
.120.270) og fra Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed & Velfærd (HI14C1979), Republikken Korea

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den tredje hyppigste årsag til kræft. dødsfald på verdensplan. Trods betydelige fremskridt i diagnosticering og behandling af gastrisk kræft, fem-års overlevelse satser mavecancerpatienter forblive under 30% i de fleste lande [1]. Desuden ca. halvdelen af ​​de patienter, der gennemgår helbredende kirurgisk resektion stadig udvikle loco-regionale eller fjernmetastaser på trods af multi-modalitet terapeutisk tilgang og dør af sygdommen [2,3]. Selv om de fleste gastriske kræftformer viser lignende kliniske træk, der er betydelig heterogenitet i histopatologi og tilknyttede molekylære ændringer [4]. Det er derfor vigtigt at identificere molekylære biomarkører involveret i carcinogenese af mavekræft til tidlig opdagelse og målrettede behandling af sygdommen.

DNA kopital ændring (CNA) defineret som DNA-segmenter 1 kb eller større i størrelse, er en vigtig type genetisk ændring observeret i cancerceller [5]. CNA'er kan påvirke genekspression, fænotypiske variation og tilpasning ved at afbryde proksimale eller fjerne regulatoriske regioner DNA- eller ved at ændre gen dosisniveauer [6,7]. Desuden er fordelingen af ​​kopiantal er signifikant forskellig hos forskellige ancestral populationer, hvilket kan resultere i forskellige modtagelighed for sygdomme i nedarvede grupper [8]. For nylig har flere grupper analyseret ændringer af DNA kopi nummer i mavekræft hjælp vifte komparativ genomisk hybridisering (aCGH) og har identificeret nye gener vigtige i patogenesen af ​​mavekræft [9-14]. For eksempel, Tsukamoto et al. [10] undersøgte CNAs i 30 tilfælde af mavekræft ved hjælp BAC eller PAC-kloner, og identificeret de hyppigste områder af DNA kopi nummer gevinster som 20q13, 20q11, 8q24 og 20p12, og de af tab som 4q34-qter, 5q12, 18q21, og 3p14. Fan et al. [11] opdaget CNAs i 64 mavekræft væv og 8 mavekræft cellelinjer ved hjælp BAC-kloner, og bemærkede, at 20q12-20q13 og 9p21 var de hyppigst forstærkede og slettede regioner hhv. Desuden Cheng et al. [12] undersøgte CNAs i 27 gastriske kræft ved aCGH-244K og identificeret 8p11-Q24, 20q11-q13, og 7q21-q22 som den mest vundet regioner og 4q34, 6p25, 18q12, og 18q22 som de mest tabte regioner. I disse tidligere undersøgelser blev forskellige mikroarrays (BAC eller PAC-klon, oligo) anvendes til at undersøge CNAs gastrisk kræft, og de rapporterede CNA regioner var forskellige for de forskellige studier befolkninger.

For at identificere CNAs vigtigt i patogenesen af mavekræft i den koreanske befolkning, vi først udført en genom-dækkende analyse af DNA-kopi nummer ved hjælp aCGH-244K eller aCGH-400K i 40 gastrisk kræft og derefter valideret de fundne CNAs bruger en tilpasset aCGH-60K i andet sæt 48 gastrisk cancere. Virkningerne af CNAs på genekspression blev analyseret i nogle af de gener med CNAs.

Resultater

Fund af CNA'erne involveret i carcinogenese af maven

At opdage CNAs involveret i carcinogenese i maven, tumor og matches normale væv fra 40 mavecancerpatienter blev analyseret ved anvendelse matrix komparativ genomisk hybridisering (aCGH); 30 tilfælde af aCGH-400K og 10 tilfælde af aCGH-244K. CNA'er blev påvist på tværs af hele genomet, og kopi nummer gevinster var mere udbredt end kopi nummer tab (Fig 1A). Antallet af CNAs var meget forskellige blandt de individer. Det gennemsnitlige antal CNAs per tilfælde var 64 for gevinster og 40 for tab (Fig 1B), og median længde af CNA regionen var 44.016 bp for gevinster og 4732 bp for tab (Fig 1C). De fælles CNA'er blev påvist ved hjælp af en kontekst-korrigeret algoritme med en p-værdi tærskel på 0,05 og overlap tærskel på 0,9 (figur 1D). Kopiér nummer gevinster blev almindeligt fundet på kromosomale regioner 7p22.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, og 20q11-q13, og eksemplarnummer tab blev ofte observeret på 3p14.2, 6q26, 7q36.3, 13q34, og 18q23 . Tabene blev stort set opdaget i enderne af kromosomer, og størrelsen var relativt lille. Den CNA'er var mindre almindelige på kromosomer 2 og 15. De fælles aberration længder med en lav p-værdi primært faldt inden for 1 kb-10 kb (Fig 1E). Fælles afvigelser omkring MYC
gen ved 8q24.21 er vist i fig 1F. Dataene aCGH-244K og aCGH-400K kan downloades fra NCBI s Gene Expression Omnibus portal (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). (Tiltrædelse nummer: GSE69318 og GSE69266 henholdsvis)

Validering af aCGHs af MLPA analyse

Nogle genomiske ubalancer opdaget af aCGH valideret ved anvendelse af PCR-baserede multiplex ligation-afhængige sonde forstærkning (MLPA). Seks af 40 vævsprøver de analyseres ved hjælp aCGH var tilgængelige for MLPA. Kopiér nummer ændringer af MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), WDR60
(7q36.3), COL4A2
(13q34), NFATC1
(18q23), og NCOA3
(20q12) blev analyseret i seks matchede tumor og normale væv par (268-1, 271-1, 272-2, 301 -1, 685-1 og 685-2). MYC
blev opformeret i 271-1T og 301-1T (Fig 2A), NCOA3
blev opnået i 301-1T og 685-2T (Fig 2B), og FHIT
blev slettet i 271-1T, 301-1T, og 685-1T (figur 2A). Disse resultater var meget i overensstemmelse med dem opdaget af aCGH. Men kopitallet tab af gener såsom WDR60
(Fig 2C), NFATC1
(Fig 2D), og COL4A2
(Fig 2E), der blev fundet at være tabt i aCGH, ikke er påvist i MLPA. Længden af ​​sletningen region i WDR60
gen opdaget af aCGH var 2907 bp, og COL4A2
og NFATC1
var 1903 bp og 2596 bp. Baseret på disse observationer, er det sandsynligt, at de afvigelser, der spænder over små områder observeret af aCGH kan være falsk.

Yderligere validering af de CNA regioner ved aCGH-60K

For at validere og indsnævre CNA regioner af recidiverende (> 20%) kopi nummer eller -tab observeret af aCGH i de 40 prøver, vi yderligere analyseret deres afvigelser i tumor og matchede normale væv fra en anden 48 mavecancerpatienter ved hjælp af en tilpasset aCGH-60K. De CNA regioner på 8q24, 20q11-q13, 3p14.2, og 18q23 viste sammenfaldende ændringer af kopi nummer i aCGH-60K, men CNAs på andre områder, såsom 20p13-20p12 og 20q21.2, viste ikke de samme mønstre som i 244K og 400K, hvilket tyder heterogene resultater blandt aCGH platforme. For at finde minimale fælles regioner (MCRS) af kopi nummer ændringer blandt de tre platforme, vi overlappede de CNA regionerne i alt 88 prøver. Den MCRS af recidiverende (> 20%) kopital gevinster blev opdaget på flere kromosomale regioner, herunder 7p22.1 (20%), 7q22.1 (31% ~ 44%), 8q24.21 (27% ~ 30%), 8q24.3 (22% ~ 48%), 13q34 (20% ~ 31%), og 20q11 ~ q13 (25% ~ 30%) (tabel 1 og tabel A i S1 File). Den MCRS af recidiverende (> 20%) kopi antal tab blev også fundet i syv kromosomale regioner, herunder 3p14.2 (43%) huser FHIT
(tabel 1 og tabel B i S1 File)

Gene-afhængige sammenhæng mellem CNA'er og mRNA niveauer

for at undersøge effekten af ​​CNA'er på genekspression, vi målte mRNA-niveauer for flere gener ( MYC
, SCRIB
, PUF60
, BOP1
, SNTA1
, E2F1
, CD40
, EYA2
, NCOA3
, FHIT
, CRK
, og SMAD2
) ved de fælles aberration regioner i 48 tumor og matches normale væv og analyseret foreningen med CNA'er. Virkningen af ​​CNAs på genekspression blev analyseret ved at sammenligne mRNA fold ændring (FC) i cancere med og uden CNA'er. Sammenhængen mellem kopital ombygninger og tilsvarende genekspression var forskellig i forhold til at kopiere antal gevinster eller tab. De fleste gener med kopi nummer tab viste nedregulering af mRNA: mRNA niveau blev nedreguleret i FHIT
(tabel 2 og figur 3A), CRK
, og SMAD2
gener (tabel 2). Vi fandt imidlertid sammenhængen mellem kopi nummer gevinster og opregulering af mRNA niveauer blev gen-specifikke: mRNA niveauer i gener såsom MYC
, PUF60
, BOP1
(fig 3B), og E2F1
var positivt associeret med kopi nummer gevinster. Imidlertid blev ingen sammenhæng fundet mellem mRNA-niveauer og kopiere nummer gevinster af gener såsom SCRIB
, BCL2L1
, SNTA1
, CD40
, EYA2
NCOA3
(tabel 2) tyder på, at forholdet mellem kopi nummer gevinster og udtryk kan være gen-specifikke.

Foreningen af ​​CNAs med klinisk-patologiske karakteristika

Sammenhængen mellem kopital ombygninger og klinisk-patologiske variabler blev analyseret i 88 mavecancerpatienter. Femten gener med tilbagevendende (> 20%) kopi antal ændringer blev udvalgt til analyse. Kopiér nummer tab på CRK
( P
= 0,07), SMAD2 Hotel ( P
= 0,09), FHIT
( P
= 0,68), og NFATC1
( P
= 0,11) gener ikke varierer betydeligt mellem diffus-type kræft og tarm-type kræft (figur 3C). , Kopi nummer gevinster tendens Men at forekomme ved en høj forekomst i tarm-type kræft end i diffust-type kræft (Fig 3D og 3E, tabel C i S1 File). For SCRIB
( P
= 0,36), PUF60
( P
= 0,07), MAPK15 Hotel ( P
= 0,08), E2F1
( P
= 0,14), SNTA1
( P
= 0,15), BCL2L1 Hotel ( P
= 0,15), NCOA3 Hotel ( P
= 0,22), og EYA2
( P
= 0,06), forekom kopital gevinster ved en høj forekomst i tarm-typen cancere end i diffust-type kræft, men forskellen var ikke statistisk signifikant. Kopiér nummer gevinster MYC
( P
= 0,03), BOP1 Hotel ( P
= 0,03), og CD40
( P
= 0,01) blev fundet på et betydeligt høj forekomst i tarm-type kræft i forhold til diffus-type kræft. For at detektere aldersrelateret CNAs analyserede vi sammenhæng mellem patientens alder og kopiere nummerændring hjælp Pearsons korrelationskoefficienter men fandt ingen korrelation blev fundet mellem kopiantal ændring af 15 gener og patientens alder (Fig 4A). Hierarkisk klyngedannelse analyse blev udført for at gruppere patienter med lignende CNA'er. De fleste af patienterne med kopi nummer gevinster på 8q24 havde også kopital gevinster ved 20q11.21 eller 20q13.12 (Fig 4B). Data blev yderligere opdelt i 4 klynger ifølge tilstedeværelsen af ​​kopital gevinster ved 8q24 og 20q11.21 (eller 20q13.12). Kopier nummer gevinster på 8q24 var signifikant associeret med kopi nummer gevinster ved 20q11.21 eller 20q13.12 ( P
= 0,005, Fishers eksakte test, tabel D i S1 File). Disse observationer tyder på, at de to regioner, 8q24 og 20q11.21 (eller 20q13.12), kan være tilsvarende modtagelige for kopiere antal gevinster i mavekræft.

Diskussion

Ændringen af ​​gen dosering af CNA bliver i stigende grad anerkendt som en vigtig del af tumorigenese. At opdage roman CNAs involveret i patogenesen af ​​mavekræft, vi udførte en genom-dækkende analyse af CNA'erne i tumor og matches normale væv fra 88 mavecancerpatienter og identificeret tilbagevendende (> 20%) kopi antal gevinster på flere kromosomale regioner, herunder 7p22 0,1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11 ~ Q13 og et løbende tab på 3p14.2, 4q35.2, 6q26, og 17p13.3. Den CNA'er på 7p22.1, 13q34, og 17p13.3 er ikke blevet rapporteret i andre populationer. De 7p22.1 regioner identificeret i den foreliggende undersøgelse indeholder FBXL18, ACTB, ACTG1, og RNF216 generne. Selvom CNA'er på 7p22.1 ikke er blevet rapporteret i gastrisk kræft, rapporterede flere undersøgelser deres indvirkning på udviklingen af ​​æggestokkene klar celle adenocarcinom [15] og endometriose [16]. I denne undersøgelse, kopiere antal ændringer af MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), og NCOA3
(20q12) valideret ved anvendelse MLPA, men kopi nummer tab ( WDR60
, COL4A2
, NFATC1
) på omkring 2000bp blev ikke valideret af MLPA. Vi har undladt at udføre omfattende beregningsmæssige vurdering af falsk positive satser for matrix-baserede kald. I stedet har vi sammenlignet forekomsten af ​​kopi nummer tab mellem aCGH-244k & -400K Og aCGH-60K med meget tætte sonder efter størrelsen af ​​kopital tab: 1 kb-5kb, 5 kb-10KB, 10 kb-50 KB, 50 KB-100KB, og 100k-. Statistisk signifikante forskelle blev fundet kun i kopi antal tab lille størrelse (1 kb-5 kb) (tabel E i S1 File). Derudover blev de betydelige forskelle fundet i kromosomale locus-specifik måde: ingen forskelle blev fundet i kromosomer 3, 6, 16, 17, og 20 (data ikke vist). Derfor er det muligt, at kopiere antal tab af lille størrelse påvist i aCGH-244K og aCGH-400K kan være falsk i nogle loci.

Vi analyserede desuden minimale fælles områder af tilbagevendende (≥10%) forstærkning eller sletning i 88 gastrisk kræft (tabel F i S1 fil) og sammenlignet dem med det store mavekræft TCGA (The cancer Genome Atlas) undersøgelse (14) og tre tidligere undersøgelser (tabel G i S1 fil). Den TCGA Undersøgelsen bestod af 295 primære gastrisk adenokarcinom og identificeret 30 fokale amplifikationer og 45 fokale sletninger. Forstærkning (≥ 5 kopier) på 8q24.21 ( MYC
), 17q12 ( ERBB2
etc.), 20q11.1-q13.33 (EYA2
, NCOA3
etc.), og sletning (0 kopier) på 3p14.2 ( FHIT
) blev observeret i vores data samt data fra TCGA og andres studier (tabel G i S1 fil). Men CNA'er på 7p22.1, 13q34, og 17p13.3 er ikke blevet rapporteret i TCGA undersøgelsen og andre befolkningsgrupper. Antallet af regionerne i CNA'er identificeret i TCGA undersøgelsen var større end den nuværende undersøgelse, som kunne følge af de forskellige undergrupper af prøven medlemmer. Den TCGA Undersøgelsen består af større intestinal-type (66,4%) sammenlignet med diffundere-type kræft (23,4%).

Blandt de gener lokaliseret på 8q24.21, er MYC kendt for at fremme væksten og proliferationen af ​​normale gastriske celler og knockdown af MYC
begrænser væksten og proliferationen af ​​gastriske cancerceller [17]. MYC
koder en transkriptionel faktor, der regulerer en række forskellige gener relateret til proliferation, differentiering og apoptose [18]. MYC
forstærkes og over-udtrykt i gastrisk kræft [19], og dets ekspression øges, efterhånden som kræften udvikler [20]. MYC
amplifikation er forbundet med den aggressive opførsel af gastriske cancerceller [21,22]. I denne undersøgelse, kopiere antal gevinster på MYC
blev fundet på en høj forekomst i tarmen-type kræft sammenlignet med diffuse-type kræft, støtte den observation, at MYC proteinekspression er observeret hyppigere i tarm- skriv tumorer end i diffust-type tumorer [23]. Vi har analyseret effekten af ​​ MYC
CNAs på den samlede overlevelse inden for hver type. Patienter med kopi nummer gevinster på MYC
havde dårlig samlet overlevelse sammenlignet med dem uden, men forskellen var ikke statistisk signifikant i diffust type og tarm typen kræftformer (S1 Fig). Kopitallet gevinster af POU5F1B
(POU domænenavn klasse 5 transkriptionsfaktor 1B) pseudogen på 8q24.21 blev fundet i 27% af de analyserede prøver. POU5F1B
er kendt for at være forbundet med mRNA overflod og en aggressiv fænotype i gastrisk kræft [24].

De 8q24.3 og 20q11-q13 regioner indeholder hundredvis af gener (Tabel A i S1 File), men mange er usandsynligt involveret i onkogenese. Blandt generne i disse regioner, vi analyserede mRNA niveauerne af SCRIB
, PUF60
, og BOP1 dele på 8q24.3 og SNTA1
, E2F1
, CD40
, EYA2
, og NCOA3 på
20q11-q13 (tabel 2). I den foreliggende undersøgelse, kopiere antal gevinster på SCRIB
, SNTA1
, CD40
, EYA2
, og NCOA3
var ikke forbundet med en fold ændring i mRNA-niveauer. Men den PUF60
, BOP1
, og E2F1
gener viste sig at være betydeligt over-udtrykt i tumorvæv med kopi nummer gevinster. PUF60
var overudtrykt i kræft med CNAs ( P
= 0,038), men dens udtryk var ikke signifikant forskellig mellem tumorvæv og matchede normale væv i prøver uden CNAs ( P
= 0,111). PUF60 (poly-U bindende splejsning faktor 60 kDa), et FUSE-bindende protein-interagerende repressor (FIR), spiller en rolle i nukleare processer såsom præ-mRNA splejsning og transkriptionel regulering. Desuden PUF60 undertrykker MYC
transkription ved P2-promotoren gennem kernen-TFIIH basal transskription faktor [25]. For nylig Gumireddy et al. [26] rapporterede, at PUF60 er nødvendig for regulator funktion translationel regulatorisk IncRNA (treRNA), der er involveret i tumor invasion og metastase. Kopier nummer gevinster PUF60
viser en stærk positiv korrelation med udtryk i gastrisk kræft [27] og i ovariecancer [28]. Disse observationer tyder på, at kopi nummer gevinster på PUF60
kan være en stor mekanisme ligger til grund for over-ekspression af genet i mavekræft.

I modsætning til PUF60, den BOP1 og E2F1 blev fundet være over-udtrykkes i tumorvæv med kopi nummer gevinster samt i dem uden. Kopier nummer gevinster BOP1
E2F1
i denne undersøgelse fandt sted i 23% og 25% af prøverne undersøges, henholdsvis. Øget mRNA fold ændring af BOP1
var signifikant i tumorvæv med kopi nummer gevinster ( P
= 0,024) samt i dem uden ( P
< 0,001) . BOP1 (blok af proliferation 1) er en bestanddel af PeBoW (Pes1, Bop1, og WDR12) kompleks, som er nødvendig for modning af 28S og 5,8S ribosomale RNA'er og dannelse af 60S ribosom [29]. BOP1 spiller en onkogen rolle i hepatocellulært carcinom ved at inducere epitel-mesenkymale overgang (EMT) og fremme aktincytoskelettet remodeling [30]. BOP1
gen er kendt for at være overudtrykt i endetarmskræft med 8Q gevinst [31], og dosering forøgelse af BOP1
gen er forbundet med en stigning på BOP1
mRNA i kolorektal cancer [32]. Den E2F1 blev også overudtrykt i tumorvæv med kopi nummer gevinster ( P
< 0,001) og i dem uden ( P
= 0,03). E2F1 spiller en afgørende rolle i kontrollen af ​​cellecyklussen og dets aktivitet reguleres via binding til retinoblastoma protein i en celle-cyklus-afhængig måde. Over-ekspression af E2F1 er forbundet med udviklingen af ​​en lang række tumorer, og det øgede kopiantallet af er E2F1
vides at være associeret med over-ekspression af genet i melanom [33] og livmoderhalskræft [ ,,,0],34]. Baseret på disse observationer, er det sandsynligt, at den samlede virkning af kopi nummer gevinster på genekspression i mavekræft varierer i et gen-afhængig måde.

Selvom kopi nummer gevinster på 13q34 ikke blev rapporteret i mavekræft, den gevinster blev fundet i 20-30% af prøverne undersøgt. Kopital gevinster på 13q34 er kendt for at være forbundet med udviklingen af ​​cervikal intraepithelial neoplasi til pladecellecarcinom [35], og med tyndtarmen adenocarcinom [36]. Kopier nummer gevinster på 17q12 er hyppige i mavekræft. I den foreliggende undersøgelse, adskillige gener, herunder ERBB2
, GRB7
, STARD3
, PPP1R1B
, RARA
, og C17orf37, blev opformeret i 15-20% af de 88 sager, i overensstemmelse med andre undersøgelser [37,38]. Vi ikke vurdere korrelationen af ​​kopiantal og ekspressionsniveauer for generne, men flere grupper har rapporteret, at generne er vigtige i udviklingen af ​​mavekræft. Blandt dem, ERBB2 (HER2)
ofte amplificeres og overudtrykkes i gastriske cancere [39-41], og amplifikation af HER2
var kraftigt forbundet med ringe overlevelse, især i den intestinale type gastrisk cancer [42]. Immunoreaktivitet i ErbB2 sker også ved en højere prævalens i tarm type end i de diffuse undertyper [43]. Desuden PPP1R1B-STARD3
fusion udskrift i human mavekræft øger kolonidannelse gennem aktivering af phosphatidylinosil-3-kinase og AKT signalering [44]. Hyppig forstærkning af Der blev også rapporteret GRB7
og positive ændringer i udtryk i gastrisk kræft [41,43].

blev opdaget De hyppigste tab i denne undersøgelse om 3p14.2 (39% i diffundere-typer og 37% af tarm typer), hvor FHIT
er placeret. FHIT
er en velkendt tumorsuppressorgen [45], og er ofte involveret i tabet af heterozygositet (LOH) og sletninger i humane tumorer [46]. Primære gastriske carcinomer udgør en omlægning af den FHIT
gen og 20 af 30 (67%) prøver udviste en mangel på FHIT
protein udtryk [47]. Tab af FHIT
proteinekspression korrelerer med sygdomsprogression og dårlig differentiering i gastrisk kræft [48]. I den foreliggende undersøgelse, vi observeret, at FHIT
ekspression blev reduceret i gastriske cancere med eller uden sin CNA, hvilket antyder, at genet dosering samt andre mekanismer regulere FHIT
ekspression i gastrisk cancer. En somatisk missense mutation (exon 6, codon 61, ACG → ATG) af FHIT
er også blevet identificeret i gastrisk kræft [49]. Endvidere en høj frekvens af promotor hypermethylering af FHIT
(62%) observeres i gastriske cancere [50]. Derfor integrerer kopital data med yderligere genomisk data er afgørende for omfattende forstå genetiske kontrol af genekspression [51].

Kopier nummer tab på flere gener i denne undersøgelse ikke var signifikant forskellig mellem diffus-type kræft og intestinal-type cancere. Men forekomsten af ​​kopital gevinster var forskellig mellem de to typer i visse gener, hvilket tyder på, at miljøfaktorer kan være mere indflydelsesrige i kopital gevinster end tab. Desuden patienter med kopi nummer gevinster på 8q24.21 og 8q24.3 tendens til at have gevinster på 20q11-q13, hvilket tyder på de to regioner kan være lige så modtagelige for kopiere nummer variation. Denne undersøgelse blev alvorligt begrænset på grund af det lille antal prøver og manglen på overlevelsesdata. Yderligere undersøgelser i en stor kohorte er nødvendig for at forstå den funktionelle betydning af CNA'erne opdaget i denne undersøgelse. Derudover blev mRNA målinger ikke udføres på et genomplan. Vi analyserede forholdet mellem mRNA-niveauer af nogle gener vides at være vigtige i patogenesen af ​​human cancer og CNA'er. En signifikant korrelation blev fundet mellem ekspressionsniveauerne af MYC
, PUF60
, BOP1
, og E2F1
gener og deres CNAs (tabel 2) . En statistisk signifikant korrelation mellem CNAs af MYC
, PUF60
, og E2F1
gener og deres ekspressionsniveauer blev også fundet af Fan et al. (11). Imidlertid er yderligere undersøgelse forpligtet til klart at forstå effekten af ​​CNA'er på genekspression. Konklusionen er, at denne undersøgelse tyder på, at DNA-kopi nummer gevinster ved 8q24.21, 8q24.3, 20q11-20q13 og tab ved 3p14.2 kan være fælles arrangementer i mavekræft. Men CNA'er på 7p22.1, 13q34, og 17p13.3 kan være koreansk-specifikke. Desuden kopiere antal gevinster kan være hyppigere hos tarm-type end diffus type mavekræft.

Materialer og metoder

Undersøgelse befolkning og DNA-ekstraktion

I alt 88 patienter, 35 kvinder og 53 mænd, som havde gennemgået helbredende kirurgisk resektion for mavekræft perioden november 2004 og oktober 2010 på Institut for Kirurgi i Samsung Medical center, Seoul, Korea, deltog i denne undersøgelse. Kirurgisk fjernet tumorvæv blev opsamlet efter opnåelse skriftligt informeret samtykke fra alle patienterne. Denne undersøgelse blev godkendt af Samsung Medical Center (SMC) Institutional Review Board (IRB). Tumorerne blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil brug. Forud for DNA-ekstraktion fra de friske frosne væv blev sektionerne anbragt på objektglas og farvet med H &E for at evaluere blandingen af ​​tumor-og ikke-tumor-væv. Tumor- og ikke-tumor områder blev mikrodissekeres omhyggeligt under et mikroskop. De Mikrodissekterede væv blev fordøjet med proteinase K, og det genomiske DNA blev isoleret i overensstemmelse med producentens instruktioner (DNeasy Tissue kit, Qiagen, Valencia, CA). Prøven bestod af 43 diffus-type kræft, 41 tarm-typen, og 4 blandet type kræft.

CNA analyse ved hjælp aCGH

aCGH blev udført i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Efter DNA hybridisering og vask blev objektglassene scannet umiddelbart bruge en Agilent microarray scanner, og rå data blev udvundet ved hjælp af Feature Extraction Software på CGH parameter standardindstillingerne (Agilent Technologies). Formodede CNA intervaller i hver prøve blev identificeret ved hjælp af Agilent Genomisk Workbench v7.0.4.0 software. Cy5 /Cy3 forhold blev omdannet til log _{2-transformerede værdier. Centralisering og fuzzy nul korrektioner blev anvendt til microarray. Den Aberration Detection Metode 2 (ADM-2) algoritme ved tærskel 6,0 blev anvendt til at identificere CNA'er i individuelle prøver og bestemme aberration frekvenser i gastrisk cancer prøver (Fig 5). De følgende filtre blev anvendt: mindste antal sonder i region > = 3, minimum absolutte gennemsnitlige log-forhold på området > = 0,25. Fælles afvigelser blev påvist ved hjælp af kontekst-korrigerede algoritme ved p-værdi < 0,05 og et overlap tærskel på 0,9. Den CNAR (Kopier nummer Ændring Region) blev defineret som foreningen af ​​mere end 90 procent overlappende afvigende segmenter på tværs af flere prøver. UCSC genom samling hg19 blev anvendt som den humane henvisning genomsekvens. For hver platform (244K, 400K, og 60K) blev inden vifte globale Lowess normalisering metode, der anvendes til at korrigere for lokal rumlig bias og kontinuerlig rumlige gradienter. Efter den inden vifte normalisering blev en fraktil mellem vifte normalisering anvendes til at sammenligne aberration resultater på tværs af arrays. Disse normalizations blev udført under anvendelse af limma pakke i R. MCR (Minimal fælles region) blev defineret som en 100 procent overlappende fælles region mellem prøver i CNAR. Der er flere MCRS i CNAR henhold til mulig overlapning frekvens. MCR af forstærkning og sletning blev analyseret. Forstærkning og sletning blev defineret, da det normaliserede log2 forholdet var ≥0.8 og ≤-0,8 hhv. Alle statistiske metoder og visualisering af de enkelte afvigende regioner blev udført ved hjælp af R statistisk sprog v.3.0.2 (www.r-project.org).}

Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) Analyse

MLPA analyse blev udført under anvendelse af SALSA MLPA kit P200 (MRC-Holland, Amsterdam, Holland) ifølge producentens anvisninger [52]. Den P200 Sættet indeholder 14 interne kontrolsystemer sonder til at vurdere DNA denaturering og DNA mængde, og også for X- og Y-kromosom. DNA-prøver blev fortyndet med TE til 5 pi og blev opvarmet ved 98 ° C i 5 minutter i PCR-rør i en thermocycler med et opvarmet låg. Efter tilsætning af 1,5 pi MLPA puffer og 1,5 pi probe mix, prøver blev yderligere opvarmet i 1 minut ved 95 ° C og derefter inkuberet i 16 timer ved 60 ° C. Probesekvenserne for detekterede gener er angivet i tabel H i ​​S1 Fil. Ligering af annealede oligonukleotider blev udført ved at fortynde prøverne til 40 pi med en fortynding indeholdende 1 U Ligase-65-enzymet, og inkubering i 15 minutter ved 54 ° C. Ligasen inaktiveres enzymet ved opvarmning til 98 ° C i 5 min og ligeringsprodukter blev amplificeret ved PCR. Mens ved 60 ° C blev 10 pi af en bufferopløsning, der indeholder PCR-primere, dNTP'er og SALSA polymerase (MRC-Holland, Amsterdam, Holland) blev tilsat. PCR blev udført i 35 cykler (30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C og 1 min ved 72 ° C). De MLPA PCR-reaktioner blev separeret under anvendelse af kapillarelektroforese systemet blev ABI-prisme 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA), og dataene analyseres med en GeneMaker 2.0.0 (SoftGenetics, State College, PA). Data, var befolkningen-normaliseret, og sonde nøgletal under 0,75 blev betragtet som en indikation af sletning, mens probe forhold over 1,25 blev betragtet som et tegn på forstærkning.

Kvantitative Real-Time PCR (QRT-PCR)