PLoS ONE: Kopioi numero voitot klo 8q24 ja 20q11-q13 mahasyövän ovat yleisempiä Suoliston-Type kuin Diffuusi-tyyppi

tiivistelmä

Tämä tutkimus oli suunnattu löytää DNA: n kopioiden määrän muutokset (CNAs) osallistuu syövän synnyn mahan ja ymmärtämään niiden kliinis merkitykset Korean väestöstä. DNA kopioluvut analysoitiin Agilent 244K tai 400K array vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) Tuoreiden pakastettujen kasvain ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin 40 mahalaukun syöpäpotilailla. Osa havaitusta CNA alueiden validoitiin käyttäen multiplex ligaatio riippuva anturi vahvistus (MLPA) kuudessa 40 potilasta ja räätälöityjä Agilent 60K aCGH riippumattomalla joukko 48 syöpien. MRNA-tasot geenien yhteisillä CNA alueet analysoitiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. Kopioi numero voitot olivat yleisempiä kuin tappioita koko genomin kasvainkudoksissa verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Keskimääräinen määrä muutoksia tapausta kohti oli 64 voittoja ja 40 tappiot, ja mediaani poikkeavuus pituus oli 44.016 emäsparia voittoja ja 4732 emäsparin menetyksistä. Kopioluvun voitot ovat usein havaittu 7p22.1 (20%), 8q24.21 (27% -30%), 8q24.3 (22% -48%), 13q34 (20% -31%), ja 20q11-q13 (25% -30%), ja tappiot 3p14.2 (43%), 4q35.2 (27%), 6q26 (23%), ja 17p13.3 (20% -23%). CNAs at 7p22.1, 13q34 ja 17p13.3 ei ole raportoitu muissa populaatioissa. Suurin osa kopioluvun tappiot liittyivät down-regulation mRNA-tasojen, mutta korrelaatio kopiomäärä voitot ja mRNA ekspressiotasot vaihteli geeni-riippuvaisella tavalla. Lisäksi kopioluvun voitot yleensä esiintyy useammin suoliston tyyppisten syöpien kuin diffuusi-tyypin syöpiä. Johtopäätöksenä on, että esillä oleva tutkimus osoittaa, että kopiomäärä voitot klo 8q24 ja 20q11-q13 ja tappiot 3p14.2 voi olla yhteinen tapahtumia mahasyövässä mutta CNAs at 7p22.1, 13q34 ja 17p13.3 voi olla korea-erityinen.

Citation: Jin DH, Park SE, Lee J, Kim KM, Kim S, Kim DH, et al. (2015) Kopioi numero pääsee jälleen klo 8q24 ja 20q11-q13 mahasyövän ovat yleisempiä Suoliston-Type kuin Diffuusi-tyyppi. PLoS ONE 10 (9): e0137657. doi: 10,1371 /journal.pone.0137657

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

vastaanotettu: 08 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 19 elokuu 2015; Julkaistu: 11 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Jin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja. ACGH-244K ja aCGH-400K data voidaan ladata NCBI Gene Expression Omnibus portaali (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, hakunumero: GSE69318 ja GSE69266, vastaavasti).

Rahoitus: tätä työtä tukivat avustusta National R &D Program for Cancer Control terveysministeriö ja hyvinvoinnin (p0270) ja Korean Health Industry Development Institute (KHIDI), rahoittama Ministry of Health & Welfare (HI14C1979), Korean tasavalta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on kolmanneksi suurin syy syöpään kuolemia maailmanlaajuisesti. Vaikka merkittäviä edistysaskeleita diagnosointiin ja hoitoon mahalaukun syövän, viiden vuoden eloonjäämisaste mahasyövän potilaat ovat alle 30% useimmissa maissa [1]. Lisäksi noin puolet potilaista, jotka tehdään parantava kirurginen resektio edelleen kehittää paikallista alueellista eikä etäispesäkkeitä huolimatta multimodaalisuuden terapeuttinen lähestymistapa ja kuolee tautiin [2,3]. Vaikka useimmat syöpien esiintyä vastaavia kliinisiä piirteitä, on huomattavaa heterogeenisyyttä sen histopatologian ja niihin liittyvien molekyylitason muutokset [4]. Näin ollen on tärkeää tunnistaa molekyylien biomarkkereiden mukana karsinogeneesi mahasyövän varhaista havaitsemista ja täsmähoitoihin taudin.

DNA kopioluvun muutos (CNA) määritelty DNA-segmentit 1 kb tai suurempia, on tärkeä tyyppi geneettinen muutos havaitaan syöpäsoluja [5]. CNAs voi vaikuttaa geenien ilmentyminen, fenotyyppisen vaihtelua ja sopeutumista hajottamalla proksimaalinen tai kaukaisia ​​DNA: n alueita tai muuttamalla geeni annostasot [6,7]. Lisäksi, jakelu kopioluvun on merkittävästi erilainen erillisissä esi populaatiot, mikä voi johtaa erilaisiin alttius taudeille koko esi ryhmien [8]. Viime aikoina useat ryhmät ovat analysoitiin muutokset DNA-kopioiden määrä mahasyövän käyttäen array vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) ja ovat tunnistaneet uusia geenejä tärkeää patogeneesissä mahasyövän [9-14]. Esimerkiksi, Tsukamoto et al. [10] tutki CNAs 30 tapauksessa mahasyövän käyttäen BAC tai PAC-kloonit, ja tunnistaa yleisimmät alueet DNA kopioluvun voitot 20q13, 20q11, 8q24, ja 20p12, sekä niille tappioita 4q34-qter, 5q12, 18q21, ja 3p14. Fan et ai. [11] havaittu CNAs 64 mahasyövässä kudosten ja 8 mahasyövän solulinjoissa käyttämällä BAC-klooneja, ja totesi, että 20q12-20q13 ja 9p21 olivat useimmin vahvistetaan ja poistetaan alueilla, vastaavasti. Lisäksi, Cheng et ai. [12] tutkitaan CNAs 27 mahasyövistä by aCGH-244K ja tunnistettu 8p11-q24, 20q11-q13, ja 7q21-q22 kaikkein sai alueiden ja 4q34, 6p25, 18q12 ja 18q22 kaikkein menetetty alueille. Näissä aiemmissa tutkimuksissa, eri mikrosiruja (BAC tai PAC-klooni, oligo) sovellettiin tutkia CNAs mahasyövän, ja raportoitu CNA alueet olivat erilaisia ​​eri tutkimuspopulaatiossa.

Tunnistaa CNAs tärkeä patogeneesissä mahalaukun syövän Korean väestö, ensin suorittanut genominlaajuisia analyysi DNA kopiomäärän käyttämällä aCGH-244K tai aCGH-400K 40 syöpien ja sitten validoitu havaitut CNAs käyttäen räätälöityjä aCGH-60K toisessa joukko 48 mahalaukun syövät. Vaikutukset CNAs geenien ilmentyminen analysoitiin joissakin geenien kanssa CNAs.

Tulokset

Discovery of CNAs mukana karsinogeneesi mahan

Voit löytää CNAs mukana karsinogeneesi mahan, kasvain ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin 40 mahasyöpäpotilaista analysoitiin joukko vertailevaa genomista hybridisaatiota (aCGH); 30 tapauksissa aCGH-400 K ja 10 tapauksissa aCGH-244K. CNAs havaittiin koko genomin, ja kopioluvun voitot olivat yleisempiä kuin kopiomäärä tappiot (kuvio 1A). Määrä CNAs oli hyvin erilaisia ​​henkilöissä. Keskimääräinen lukumäärä CNAs tapausta kohti oli 64 voittoja ja 40 tappiot (kuvio 1 B), ja mediaani pituuden CNA alue oli 44016 emäsparia voittoja ja 4732 emäsparin menetyksistä (kuvio 1 C). Yhteinen CNAs todettiin käyttäen yhteydessä korjattu algoritmi, jossa on p-kynnysarvo 0,05 ja päällekkäisiä kynnyksen 0,9 (kuvio 1 D). Kopioi numero voitot olivat yleisesti havaittu kromosomialueita 7p22.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34 ja 20q11-q13, ja kopioluvun tappiot usein havaittiin 3p14.2, 6q26, 7q36.3, 13q34 ja 18q23 . Tappiot ovat pääosin havaittiin päissä kromosomien, ja koko oli suhteellisen pieni. CNAs olivat harvinaisempia kromosomeissa 2 ja 15. Yhteinen poikkeavuus pituudet on alhainen p-arvo pääosin kuului 1 ke-10 kb (kuvio 1 E). Yhteinen poikkeamia noin MYC
geenin 8q24.21 esitetään kuviossa 1F. ACGH-244K ja aCGH-400K data voidaan ladata NCBI Gene Expression Omnibus portaali (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) (hakunumero: GSE69318 ja GSE69266, vastaavasti).

Validation n aCGHs mukaan MLPA analyysi

Jotkut genomista epätasapainoa havaita aCGH validoitiin käyttäen PCR-pohjainen multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus (MLPA). Kuusi 40 kudosnäytteiden analysoitiin aCGH oli saatavilla MLPA. Kopioi numero korjauksilla MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), WDR60
(7q36.3), COL4A2
(13q34), NFATC1
(18q23), ja NCOA3
(20q12) analysoitiin kuudessa Hyväksytty kasvain ja normaali kudos paria (268-1, 271-1, 272-2, 301 -1 685-1 ja 685-2). MYC
monistettiin 271-1T ja 301-1T (kuvio 2A), NCOA3
saavutettiin vuonna 301-1T ja 685-2T (kuvio 2B), ja FHIT
poistettiin 271-1T, 301-1T, ja 685-1T (kuvio 2A). Nämä tulokset olivat erittäin yhdenmukaisia ​​havaita aCGH. Kuitenkin kopioluku tappiot geenien kuten WDR60
(kuvio 2C), NFATC1
(kuvio 2D), ja COL4A2
(kuvio 2E), joiden todettiin on menetetty aCGH, ei havaittu MLPA. Pituus deleetion alue WDR60
geenin havaitaan aCGH on 2907 bp, ja COL4A2
ja NFATC1
olivat 1903 bp ja 2596 bp, vastaavasti. Näiden havaintojen perusteella, on todennäköistä, että poikkeamia ulottuu pienten alueiden havaita aCGH saattaa olla väärä.

ylimääräisen CNA alueiden aCGH-60K

validoimiseksi ja kaventaa CNA alueet toistuvan (> 20%) kopioluku voitot tai tappiot havaitsema aCGH on 40 näytettä, me analysoitiin edelleen niiden poikkeavuuksia kasvain ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin toisesta 48 mahasyöpäpotilaista käyttäen räätälöityjä aCGH-60K. CNA alueita 8q24, 20q11-q13, 3p14.2, ja 18q23 osoittivat päällekkäisiä korjauksilla kopio numero aCGH-60K, mutta CNAs muilla alueilla, kuten 20p13-20p12 ja 20q21.2, ei näytä samoja kuvioita kuten 244K ja 400K, mikä viittaa siihen, heterogeeninen tulosten joukossa aCGH alustoilla. Löytää minimaalinen yhteinen alueet (MCRs) kopioluvun muutoksia joukossa kolmella alustalla, me päällekkäin CNA alueita yhteensä 88 näytettä. MCRs toistuvan (> 20%) kopioluku voitot havaittiin useita kromosomaalisia alueita, mukaan lukien 7p22.1 (20%), 7q22.1 (31% ~ 44%), 8q24.21 (27% ~ 30%), 8q24.3 (22% ~ 48%), 13q34 (20% ~ 31%), ja 20q11 ~ q13 (25% ~ 30%) (taulukko 1 ja taulukko A S1 File). MCRs toistuvan (> 20%) Kopioi numero menetyksiä havaittiin myös seitsemässä kromosomi alueisiin, myös 3p14.2 (43%) kätkeminen FHIT
(taulukko 1 ja taulukko B S1 File).

Gene riippuvan assosiaation CNAs ja mRNA-tasot

vaikutuksen tutkimiseksi CNAs geenien ilmentymisen, mittasimme mRNA-tasot useiden geenien ( MYC
, SCRIB
, PUF60
, BOP1
, SNTA1
, E2F1
, CD40
, EYA2
NCOA3
, FHIT
, CRK
, ja Smad2
) yhteisillä poikkeavuus alueiden 48 kasvain ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin ja analysoi yhdistys kanssa CNAs. Vaikutus CNAs geenien ilmentymisen analysoitiin vertaamalla mRNA kertainen muutos (FC) syövät ja ilman CNAs. Korrelaatio kopioluku muutokset ja vastaava geeniekspressio oli erilainen mukainen kopioluvun voittoja ja tappioita. Suurin osa geenien kanssa kopioluvun tappiot osoittivat downregulation mRNA: mRNA taso vaimentua FHIT
(taulukko 2 ja kuvio 3A), CRK
, ja Smad2
geenejä (taulukko 2). Kuitenkin löysimme korrelaatio kopiomäärä voitot ja säätelyä mRNA-tasojen oli geenispesifiseen: mRNA tasot geenejä, kuten MYC
, PUF60
, BOP1
(kuvio 3B), ja E2F1
vaikuttivat myönteisesti kopioluku voittoja. Ei kuitenkaan assosioitunut mRNA-tasoja ja kopion numero voitot geenien kuten SCRIB
, BCL2L1
, SNTA1
, CD40
, EYA2
ja NCOA3
(taulukko 2), mikä viittaa, että suhde kopiomäärä voitot ja ilmentyminen voi olla geeneille.

Association of CNAs kanssa kliinis ominaisuudet

välinen yhteys kopioluku muutoksia ja kliinis muuttujat analysoitiin 88 mahasyöpäpotilaista. Viisitoista geenejä, joilla on uusiutuva (> 20%) kopioluvun muutoksia valittiin analyysiin. Kopioi numero tappiot CRK
( P
= 0,07), Smad2
( P
= 0,09), FHIT
( P
= 0,68), ja NFATC1
( P
= 0,11) geenit eivät vaihtelevat huomattavasti hajanainen-tyypin syöpiä ja suoliston-tyypin syöpiä (kuvio 3C). Kuitenkin kopioluvun voitot yleensä esiintyy esiintyvyys on suurta suoliston tyyppisten syöpien kuin diffuusi-tyypin syöpiä (kuvio 3D ja 3E, taulukko C S1 File). Sillä SCRIB
( P
= 0,36), PUF60
( P
= 0,07), MAPK15
( P
= 0,08), E2F1
( P
= 0,14), SNTA1
( P
= 0,15), BCL2L1
( P
= 0,15), NCOA3
( P
= 0,22), ja EYA2
( P
= 0,06), kopiomäärä voitot esiintyi yleisyys suolistonesteeseen-tyypin syöpiä kuin diffuusi-tyypin syöpiä, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Kopioi numero voitot MYC
( P
= 0,03), BOP1
( P
= 0,03), ja CD40
( P
= 0,01) havaittiin merkittävästi yleisyys suolistonesteeseen-tyypin syövät verrattuna hajanainen-tyypin syöpiä. Havaitsemiseksi iästä CNAs, analysoimme korrelaation potilaan iän ja kopioluvun muutos käyttämällä Pearsonin korrelaatiokertoimet mutta ei löytänyt korrelaatio löytyi kopioluvun muutos 15 geenien ja potilaan iästä (kuvio 4A). Hierarkkinen klusterointi analyysi suoritettiin, jotta ryhmään samanlaisten potilaiden CNAs. Suurin osa potilaista, joilla kopiomäärä lisäämisessä 8q24 oli myös kopiomäärä lisäämisessä 20q11.21 tai 20q13.12 (kuvio 4B). Tiedot jaettiin edelleen 4 klusterit mukaan läsnäolo kopioluvun lisäämisessä 8q24 ja 20q11.21 (tai 20q13.12). Kopioi numero lisäämisessä 8q24 oli merkitsevästi yhteydessä kopiomäärä lisäämisessä 20q11.21 tai 20q13.12 ( P
= 0,005, Fisherin testiä, taulukon D S1 File). Nämä havainnot viittaavat siihen, että näiden kahden alueen, 8q24 ja 20q11.21 (tai 20q13.12), voi olla samalla tavalla alttiita kopioida useita voittoja mahasyövässä.

Keskustelu

muutos geenin annostuksen by CNA tunnustetaan yhä tärkeänä osana kasvaimen. Voit löytää uusia CNAs mukana synnyssä mahalaukun syövän, teimme genominlaajuisia analyysi CNAs kasvaimen ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin 88 mahasyöpäpotilaista ja tunnistaa toistuvia (> 20%) Kopioi numero voitot useilla kromosomialueita kuten 7p22 0,1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11 ~ Q13 ja toistuva tappioita 3p14.2, 4q35.2, 6q26, ja 17p13.3. CNAs at 7p22.1, 13q34 ja 17p13.3 ei ole raportoitu muissa populaatioissa. 7p22.1 alueet tunnistettiin esillä olevassa tutkimuksessa sisältävät FBXL18, ACTB, ACTG1, ja RNF216 geenejä. Vaikka CNAs at 7p22.1 ei ole raportoitu mahasyövän, useat tutkimukset raportoivat vaikutus kehitykseen munasarjojen selvä adenokarsinooman [15] ja endometrioosia [16]. Tässä tutkimuksessa, kopioiden määrä korjauksilla MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), ja NCOA3
(20q12) validoitiin käyttäen MLPA, mutta kopioluvun tappiot ( WDR60
, COL4A2
, NFATC1
) noin 2000bp ei vahvistanut MLPA. Me kyennyt suorittamaan laajoja laskennallisen arvion väärien positiivisten määrien array-pohjainen kutsuvan. Sen sijaan olemme verranneet esiintyvyys kopioluvun tappioiden välillä aCGH-244k & -400K Ja aCGH-60K erittäin tiheä mukainen koettimien koot kopioluvun tappiot: 1 kb-5kb, 5kb-10 kb, 10 kb-50 kb, 50 kb-100kb, ja 100k-. Tilastollisesti merkitseviä eroja havaittiin vain kopiomäärän tappiot pienen koon (1 kb-5kb) (taulukko E S1 File). Lisäksi merkittäviä eroja havaittiin kromosomilokuksessa-spesifisellä tavalla: ei havaittu mitään eroja kromosomien 3, 6, 16, 17, ja 20 (tuloksia ei esitetty). Siksi on mahdollista, että kopion numero tappiot pienen koon havaittiin aCGH-244K ja aCGH-400K voi olla vääriä joissakin loci.

Lisäksi analysoitiin minimaalinen yhteisiä alueita toistuvien (≥10%) vahvistus tai poistaminen 88 syöpien (taulukko F S1 File) ja niitä verrattiin suuri mahasyövän TCGA (Cancer Genome Atlas) tutkimus (14) ja kolme aiemmissa tutkimuksissa (taulukko G S1 File). TCGA Tutkimus käsitti 295 ensisijaisen mahalaukun adenokarsinooman ja tunnistettu 30 polttoväli monistukset ja 45 polttoväli poistot. Monistus (≥ 5 kopiota) klo 8q24.21 ( MYC
), 17q12 ( ErbB2
jne), 20q11.1-q13.33 (EYA2
, NCOA3
jne), ja poisto (0 kappaletta) klo 3p14.2 ( FHIT
) havaittiin meidän data sekä datan TCGA ja muiden tutkimusten (taulukko G S1 File). Kuitenkin CNAs at 7p22.1, 13q34 ja 17p13.3 ei ole raportoitu TCGA tutkimuksessa ja muut populaatiot. Numero alueilla CNAs yksilöityjen TCGA tutkimuksessa oli suurempi kuin tässä tutkimuksessa, mikä saattaa johtua eri alaryhmiin näytteen jäsentä. TCGA Tutkimus koostuu suurempia suoliston-tyyppi (66,4%) verrattuna diffuusi-tyypin syöpiä (23,4%).

joukossa geenit sijaitsevat 8q24.21, MYC tiedetään edistää kasvua ja lisääntymistä normaaliin mahan soluja, ja knockdovvn MYC
hillitsee kasvua ja lisääntymistä mahasyövän solujen [17]. MYC
koodaa transkriptiotekijä, joka säätelee erilaisia ​​liittyvien geenien proliferaatiota, erilaistumista, ja apoptoosin [18]. MYC
vahvistetaan ja yliekspressoitu mahasyövässä [19], ja sen ilme pienenee asteittain, kun syöpä kehittyy [20]. MYC
vahvistus liittyy aggressiivista käyttäytymistä mahasyövän solujen [21,22]. Tässä tutkimuksessa, kopioiden määrä voittoja MYC
löydettiin esiintyvyys on suurta suoliston-tyyppinen syövät verrattuna hajanainen-tyypin syöpiä, tukee havainto, että MYC proteiinin ilmentymistä yleistyneet intestinal- kirjoita kasvaimia kuin diffuusi-tyypin kasvaimissa [23]. Olemme analysoineet vaikutus MYC
CNAs eloonjäämiseen kustakin tyypistä. Potilaat, joilla kopioluku voitot MYC
oli huono kokonaiselinaika verrattuna ilman, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä hajanainen tyyppi ja suoliston tyyppi syövät (S1 Kuva). Kopioluku voitot POU5F1B
(POU domain luokka 5 transkriptiotekijä 1B) pseudogeenistä on 8q24.21 löytyi 27% näytteistä analysoidaan. POU5F1B
tiedetään liittyvän mRNA runsauteen ja aggressiivinen fenotyyppi mahasyövän [24].

8q24.3 ja 20q11-q13 alueet sisältävät satoja geenejä (taulukko A S1 File), mutta monet eivät todennäköisesti mukana oncogenesis. Niistä geenit näillä alueilla sijaitsevien, olemme analysoineet mRNA tasot SCRIB
, PUF60
, ja BOP1
at 8q24.3 ja SNTA1
E2F1
, CD40
, EYA2
, ja NCOA3
at 20q11-q13 (taulukko 2). Esillä olevassa tutkimuksessa, kopioiden määrä voittoja SCRIB
, SNTA1
, CD40
, EYA2
, ja NCOA3
olivat ei liity kertamuutos mRNA-tasojen. Kuitenkin PUF60
, BOP1
, ja E2F1
geenejä havaittiin olevan merkittävästi yliekspressoitu tuumorikudoksissa kopio numero voittoja. PUF60
oli yli-ilmentynyt syöpiä CNAs ( P
= 0,038), mutta sen ilme ei ollut merkitsevää eroa kasvain kudosten ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin näytteistä ilman CNAs ( P
= 0,111). PUF60 (poly-U sitova silmukointi tekijä 60kDa), sulake-sitova proteiini-vuorovaikutuksessa repressori (FIR), on merkitystä ydinvoiman prosesseissa kuten valmiiksi mRNA ja transkription säätelyyn. Lisäksi, PUF60 vaimentaa MYC
transkription P2-promoottorin kautta ytimen TFIIH pohjapinta transkriptiotekijä [25]. Äskettäin Gumireddy et ai. [26] on raportoitu, että PUF60 tarvitaan säädin toiminta translaatiota sääteleviin IncRNA (treRNA), joka on mukana kasvaimen invaasion ja metastaasin. Kopioluku voitot PUF60
osoittavat voimakas positiivinen korrelaatio ilmaisu mahasyövän [27] ja munasarjasyövän [28]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kopioluvun voitot PUF60
voi olla merkittävä mekanismi taustalla yli-ilmentyminen geenin mahasyövässä.

Toisin PUF60, The BOP1 ja E2F1 havaittiin olla yli-ilmaistaan ​​kasvaimen kudoksiin kopioluku voitot sekä ilman. Kopioi numero voitot BOP1
ja E2F1
tässä tutkimuksessa esiintyi 23% ja 25% näytteistä tutkittiin, vastaavasti. Lisääntynyt mRNA kertainen muutos BOP1
oli merkittävä tuumorikudoksissa kopio numero voitot ( P
= 0,024) sekä niitä ilman ( P
< 0,001) . BOP1 (lohko leviämisen 1) on osa PeBoW (Pes1, Bop1, ja WDR12) kompleksi, joka vaaditaan kypsymisen 28S ja 5.8S ribosomi-RNA: t ja muodostumista 60S ribosomin [29]. BOP1 näyttelee onkogeenisessä rooli maksasolukarsinoomassa indusoimalla epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja edistämällä aktiinisytoskeletonin remontin [30]. BOP1
geenin tiedetään olevan yli-ilmentynyt peräsuolen syövän kanssa 8q voitto [31], ja annostus kasvu BOP1
geeni liittyy lisäystä BOP1
mRNA kolorektaalisyövässä [32]. E2F1 myös yliekspressoitunut tuumorikudoksissa kopio numero voitot ( P
< 0,001) ja joilla ei ole ( P
= 0,03). E2F1 on keskeinen rooli valvonnassa solusyklin ja sen aktiivisuutta säätelee sitoutumalla retinoblastoomaa proteiinin solusyklin-riippuvaisella tavalla. Yli-ilmentyminen E2F1 liittyy kehittää erilaisia ​​kasvaimia, ja lisääntynyt kopioluvun E2F1
tiedetään liittyvän yli-ilmentyminen geenin melanooman [33] ja kohdunkaulan syöpä [ ,,,0],34]. Näiden havaintojen perusteella, on todennäköistä, että kokonaisvaikutukset kopioluvun voitot geenien ilmentymisen mahasyövän vaihtelee geeni-riippuvaisella tavalla.

Vaikka kopiomäärä lisäämisessä 13q34 ei raportoitu mahasyövän, The voitot havaittiin 20-30% näytteistä tutkittiin. Kopioi numero lisäämisessä 13q34 tiedetään liittyvän etenemiseen CIN-muutos on okasolusyöpä [35] sekä ohutsuolen adenokarsinooma [36]. Kopioi numero lisäämisessä 17q12 ovat yleisiä mahasyövässä. Esillä olevassa tutkimuksessa useiden geenien, kuten ErbB2
, GRB7
, STARD3
, PPP1R1B
, RARA
, ja C17orf37, monistettiin 15-20% 88 tapauksessa johdonmukainen muiden tutkimusten [37,38]. Emme arvioida korrelaatiota kopioluvun ja ekspressiotasot geenien, mutta useat ryhmät ovat raportoineet, että geenit ovat tärkeitä mahasyövän. Niistä erbB2 (HER2) B usein vahvistetaan ja yliekspressoitu mahasyövistä [39-41], ja monistaminen HER2
oli vahvasti yhteydessä huonoon säilymiseen, erityisesti suoliston tyyppi mahasyöpä [42]. Immunoreaktiivisuus ErbB2 tapahtuu myös korkeammalla yleisyys suoliston tyyppi kuin diffuusi alatyyppeihin [43]. Lisäksi PPP1R1B-STARD3
fuusio transkriptio ihmisen mahasyövän kasvaa pesäkkeiden muodostumisen aktivoitumisen kautta phosphatidylinosil-3-kinaasi ja AKT signalointi [44]. Usein monistaminen GRB7
ja myönteisiä muutoksia ilmaisun raportoitiin myös mahasyövän [41,43].

Yleisimmät tappiot Tässä tutkimuksessa havaittu 3p14.2 (39% diffuusi-tyypit ja 37% suoliston tyypit), jossa FHIT
sijaitsee. FHIT
on tunnettu tuumorisuppressorigeeniä [45], ja on usein mukana Heterotsygotian menetys (LOH) ja poistot ihmisen kasvaimissa [46]. Ensisijainen mahakarsinoomat edustavat uudelleenjärjestely FHIT
geeniä ja 20 30 (67%) näytteet omasivat poissaoloon FHIT
proteiinin ilmentymisen [47]. Menetys FHIT
proteiinin ilmentyminen korreloi taudin etenemistä ja huono eriyttäminen mahasyövässä [48]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että FHIT
ilmentyminen väheni syöpien kanssa tai ilman sen CNA, viittaa siihen, että geeni annostus sekä muut mekanismit säätelevät FHIT
ilmentymistä mahasyövässä. Somaattinen missensemutaatio (eksoni 6, kodonissa 61, ACG → ATG) on FHIT
on myös tunnistettu mahasyövistä [49]. Lisäksi suuri taajuus promoottorin hypermetylaatiota FHIT
(62%) havaitaan mahasyövistä [50]. Siksi integrointi kopiomäärä data ylimääräisiä genomista tiedot ovat välttämättömiä kattavasti ymmärtämään geneettisen geenien toiminnan säätelystä [51].

Kopioi numero tappiot useiden geenien tässä tutkimuksessa ei ollut merkitsevää eroa hajanainen-tyypin syöpiä ja suoliston-tyypin syöpiä. Kuitenkin esiintyvyys kopioluvun myyntivoittoja oli erilaisia ​​välillä kumman tiettyjen geenien, mikä viittaa siihen, että ympäristötekijät voivat olla vaikutusvaltainen kopiomäärä voittoja kuin tappioita. Lisäksi potilailla, joilla on kopioluku voitot 8q24.21 ja 8q24.3 yleensä on voitot 20q11-q13, mikä on osoitus alueet voivat olla yhtä alttiita kopioluvun vaihtelua. Tämä tutkimus oli vakavasti rajoittunutta johtuen pieni määrä näytteitä ja puute selviytymisen tietoja. Lisätutkimuksia suuri kohortti tarvitaan ymmärtämään toiminnallista merkitystä CNAs löydetty tässä tutkimuksessa. Lisäksi mRNA mittauksia ei suoritettu genomin tasolla. Analysoimme suhde mRNA-tasoja noin geenit, joiden tiedetään olevan tärkeitä patogeneesissä ihmisen syövän ja CNAs. Merkittävä korrelaatio havaittiin välillä ekspressiotasot MYC
, PUF60
, BOP1
, ja E2F1
geenejä ja niiden CNAs (taulukko 2) . Tilastollisesti merkitsevä korrelaatio CNAs on MYC
, PUF60
, ja E2F1
geenejä ja niiden ekspressiotasot havaittiin myös Fan et al. (11). Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan selvästi ymmärtää vaikutus CNAs geenien ilmentymisen. Johtopäätöksenä on, että esillä oleva tutkimus osoittaa, että DNA: n kopioiden lukumäärä saa at 8q24.21, 8q24.3, 20q11-20q13 ja tappiot 3p14.2 voi olla yhteinen tapahtumia mahasyövässä. Kuitenkin CNAs at 7p22.1, 13q34 ja 17p13.3 voi olla korea-erityinen. Lisäksi kopioluvun voitot voivat olla yleisempiä suoliston-tyypin kuin diffuusi-tyyppinen mahasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuskanta ja DNA: n eristämiseksi

Yhteensä 88 potilasta, 35 naista ja 53 miestä, joille oli tehty parantava kirurginen resektio mahasyövän marraskuun 2004 ja lokakuun 2010 Kirurgian klinikka Samsung Medical Center, Seoul, Korea, osallistui tähän tutkimukseen. Kirurgisesti poistettu kasvainkudoksista kerättiin saatuaan kirjallisen tietoisen suostumuksensa kaikista potilaista. Tutkimus hyväksyi Samsung Medical Center (SMC) Institutional Review Board (IRB). Kasvaimet olivat pikajäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes niitä tarvitaan. Ennen DNA uuttamalla tuore kudoksia, leikkeet sijoitettiin objektilaseille ja värjättiin H &E arvioida sekoittumisen tumorous ja ei-syöpäkudoksissa. Kasvain ja ei-kasvain alueet microdissected huolellisesti mikroskoopilla. Mikropaloitelluista kudokset digestoitiin proteinaasi K ja genominen DNA eristettiin ohjeiden mukaisesti valmistajan (DNeasy Tissue Kit, Qiagen, Valencia, CA). Näyte koostui 43 hajanainen-tyypin syöpiä, 41 suolen-tyyppinen, ja 4 mixed-tyyppinen syöpiä.

CNA analyysi käyttäen aCGH

aCGH suoritettiin valmistajan suositusten. Sen jälkeen DNA-hybridisaatiolla ja pesu, diat skannattiin välittömästi käyttäen Agilent mikrosirujen skanneri, ja raakadatan uutettiin käyttämällä Feature Extraction ohjelmisto on oletuksena CGH parametriasetukset (Agilent Technologies). Otaksuttu CNA väliajoin kussakin näytteessä havaittiin käyttäen Agilent Perimän Workbench v7.0.4.0 ohjelmisto. Cy5 /Cy3 suhteet muunnettiin log _{2-muunnettuja arvoja. Keskittämisen ja sumea nolla korjauksia levitettiin mikrosirulla. Poikkeavuus Havaintomenetelmä 2 (ADM-2) algoritmi kynnysmäärään 6,0 käytettiin tunnistamaan CNAs yksittäisten näytteiden ja määrittää poikkeamaa taajuudet mahasyövässä näytteissä (kuvio 5). Seuraavia suodattimia käytettiin: vähimmäismäärä koettimien alueen > = 3, pienin absoluuttinen keskimääräinen log suhde alueen > = 0.25. Yhteinen aberraatioita havaittiin käyttämällä yhteydessä korjattu algoritmi p-arvo < 0,05 ja päällekkäisyys kynnys 0,9. CNAR (Copy Number Alteration Region) määriteltiin liiton yli 90 prosenttia päällekkäisiä poikkeava segmenttien poikki useita näytteitä. UCSC genomin kokoonpano hg19 käytettiin ihmisen viitteenä genomin sekvenssissä. Kunkin alustan (244K, 400K, ja 60K), within array globaali Lowess normalisoinnin menetelmää sovellettiin korjaamiseksi paikallisten paikkatietojen bias ja jatkuva paikkatietojen kaltevuudet. Kun sisällä array normalisointi, joka on kvantiili välillä array normalisointi levitettiin verrata poikkeamaa tuloksia poikki taulukot. Nämä normalizations suoritettiin käyttäen Limma paketin R. MCR (Minimal Common Region) määriteltiin 100 prosenttia päällekkäistä yhteinen alue välillä näytteitä CNAR. On olemassa useita MCRs on CNAR mukaan mahdollista päällekkäisyyttä taajuus. MCR vahvistuksen ja poisto analysoitiin. Vahvistusta ja poisto määriteltiin, kun normalisoitu log2 suhde oli ≥0.8 ja ≤-0,8, tässä järjestyksessä. Kaikki tilastolliset menetelmät ja visualisoinnin yksittäisten poikkeavien alueiden suoritettiin käyttäen R tilastokieltä v.3.0.2 (www.r-project.org).}

Multiplex Ligaatioseoksista riippuva Probe Vahvistus (MLPA) Analysis

MLPA analyysi suoritettiin käyttäen SALSA MLPA kit P200 (MRC-Holland, Amsterdam, Alankomaat) mukaan valmistajan ohjeiden [52]. P200 Sarja sisältää 14 sisäisen valvonnan antureista arvioida DNA denaturaatio ja DNA määrä, ja myös X- ja Y-kromosomi. DNA-näytteet laimennettiin TE 5 ui ja kuumennettiin 98 ° C: ssa 5 minuutin ajan PCR-putkissa lämpösyklilaitteessa jossa on lämmitetty kansi. Lisäyksen jälkeen 1,5 ui MLPA puskuria ja 1,5 ui koetinseosta, näytteet olivat edelleen kuumennettiin 1 min ajan 95 ° C: ssa ja sitten inkuboitiin 16 tuntia 60 ° C: ssa. Koetinsekvenssit havaittujen geenien ovat taulukossa H S1-tiedoston. Pariutunei- oligonukleotidien tehtiin laimentamalla näytteet 40 ul: laimennuksella, joka sisälsi 1 U ligaasia-65-entsyymin, ja inkuboimalla 15 min 54 ° C: ssa. Ligaasi entsyymi inaktivoitiin kuumentamalla 98 ° C: ssa 5 min ja ligaatio tuotteet monistettiin PCR: llä. Kun taas 60 ° C: ssa, lisättiin 10 ui puskuroitua liuosta, joka sisältää PCR-alukkeiden, dNTP: itä ja SALSA-polymeraasia (MRC-Holland, Amsterdam, Alankomaat) lisättiin. PCR suoritettiin 35 syklin ajan (30 s 95 ° C: ssa, 30 s 60 ° C: ssa ja 1 min 72 ° C: ssa). MLPA PCR-reaktiot erotettiin käyttäen kapillaarielektroforeesijärjestelmässä, ABI-Prism 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA), ja analysoitiin käyttämällä GeneMaker 2.0.0 (SoftGenetics, State College, PA).

• PLoS ONE: Merkittävä Association of Interleukin4 Intron 3 VNTR polymorfismin kanssa Alttius mahasyövän Etelä Intian väestöstä Telangana
• PLoS ONE: apoptoottisen vaikutus HIF-1α estäminen Yhdistettynä glukoosi plus insuliinihoitoa on mahasyövän Hypoksisissa ehdot