Plos ONE: Kopiraj Število Dobički pri 8q24 in 20q11-Q13 želodčnega raka so pogostejše v črevesju-Type kot Diffuse-Type

Povzetek

Ta študija je bila namenjena odkrivanju število DNA kopijo sprememb (CNAs), ki sodelujejo pri karcinogenosti želodcu in na razumevanju svojih clinicopathological pomene na korejskem prebivalstva. število kopij DNA smo analizirali z Agilent 244K ali 400K niz primerjalne genomske hibridizacije (aCGH) v sveže zmrznjene tumorja poveže normalno tkivo od 40 bolnikov z rakom želodca. Nekatere od ugotovljenih CNA regijah so bili potrjeni s pomočjo multipleks ligacijskega odvisna od sonda ojačanja (MLPA) v šestih od 40 bolnikov in prilagojene Agilent 60K aCGH v samostojni sklop 48 želodčnega raka. Ravni mRNA genov pri skupnih regijah CNA smo analizirali z uporabo kvantitativnega PCR v realnem času. Kopiranje številka dobički so bili bolj pogosti kot izgube v celotni genom v tumorskih tkivih, v primerjavi z ujemanjem normalnih tkivih. Povprečno število sprememb na primeru je bilo 64 za dobičke in 40 za izgube, mediana dolžina aberacije bilo 44.016 bp za dobičke in 4732 bp za izgube. Kopiranje število dobički so pogosto odkrita 7p22.1 (20%), 8q24.21 (27% -30%), 8q24.3 (22% -48%), 13q34 (20% -31%), in 20q11-Q13 (25% -30%) in izgube na 3p14.2 (43%), 4q35.2 (27%), 6q26 (23%) in 17p13.3 (20% -23%). CNAs na 7p22.1, 13q34 in 17p13.3 niso poročali pri drugih populacijah. Večina izgub število kopij je bilo povezano z zmanjšanjem števila ravni mRNA, vendar je korelacija med kopijo dobičkov število in ravni mRNA izražanja spreminjajo v genski odvisnega način. Poleg tega, kopiranje število dobički večinoma pojavljajo pogosteje pri rakih intestinalnega tipa kot pri rakih razpršeno tipa. Skratka, ta študija kaže, da število kopija dobički na 8q24 in 20q11-V13 in izgube na 3p14.2 lahko skupne dogodke na raka želodca pa CNAs na 7p22.1, 13q34 in 17p13.3 lahko korejski specifične.

Navedba: Jin DH, Park SE, Lee J, Kim KM, Kim S, Kim DH, et al. (2015) Kopiraj Število dobički na 8q24 in 20q11-V13 želodčnega raka so pogostejše v črevesju-Type kot Diffuse-Type. PLoS ONE 10 (9): e0137657. doi: 10,1371 /journal.pone.0137657

Urednik: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPONSKA

Prejeto: 8. marec 2015; Sprejeto: 19. avgust 2015; Objavljeno: 11. september 2015

Copyright: © 2015 Jin et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek. Podatki o aCGH-244K in aCGH-400K je mogoče prenesti s strani NCBI Gene Expression Omnibus portal. (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, pristop številka: GSE69318 in GSE69266, v tem zaporedju)

Financiranje: To delo je podprta s sredstvi iz državnega R & D programa za raka nadzor, Ministrstvo za zdravje in dobro počutje (p0270) in inštituta Koreje Health Industry Development (KHIDI), ki ga je ministrstvo za zdravje &financira; Welfare (HI14C1979), Republika Koreja

nasprotujočimi si interesi. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Rak želodca je tretji najpogostejši vzrok za nastanek raka. smrti po vsem svetu. Kljub velikim napredkom v diagnostiki in zdravljenju raka želodca, petletna stopnja preživetja bolnikov z rakom želodca ostala pod 30%, v večini držav [1]. Poleg tega je približno polovica bolnikov, ki opravijo kurativno kirurško resekcijo še vedno razvija loco-regionalne ali oddaljenih metastaz kljub multimodalnosti terapevtskega pristopa in umre zaradi bolezni [2,3]. Čeprav je večina želodca raka prikazati podobne klinične značilnosti, obstaja velika raznolikost v svoji histopatologijo in pripadajoči molekularne spremembe [4]. Zato je pomembno ugotoviti, molekularne biološke označevalce, ki sodelujejo pri karcinogenosti raka želodca za zgodnje odkrivanje in ciljno zdravljenje bolezni.

DNK število kopij sprememba (CNA), opredeljen kot segmentov DNA 1 kb ali večje velikosti, je pomemben tip genskega spreminjanja opazili pri rakavih celicah [5]. CNAs lahko vplivajo na izražanje genov, fenotipsko spremembo in prilagoditev, ki jih moti proksimalni ali oddaljenih DNK regulatorne regije ali spreminjajo ravni genov dozirnih [6,7]. Poleg tega je porazdelitev števila kopiranja se bistveno razlikuje v različnih prednikov populacije, ki lahko povzročijo različne dovzetnosti za bolezni na prednikov skupin [8]. Nedavno je več skupin analizirali spremembe DNK število kopij na raka želodca uporablja niz primerjalne genomske hibridizacije (aCGH) in so odkrili nove gene pomembne pri patogenezi raka želodca [9-14]. Na primer, Tsukamoto sod. [10] raziskovali CNAs v 30 primerov raka želodca s pomočjo BAC ali PAC klonov, in identificirati najpogostejše regije DNA števila kopij dobička kot 20q13, 20q11, 8q24 in 20p12, in tiste izgub kot 4q34-qter, 5q12, 18q21 in 3p14. Ventilator sod. [11] odkrijejo CNAs v 64 želodčne tkivih rakom in 8 želodca linij rakavih celic z uporabo koncentracije alkohola v krvi klonov, in ugotovili, da so bili 20q12-20q13 in 9p21 najbolj pogosto dopolnjena in izbrisanih regije oz. Poleg tega Cheng et al. [12] študiral CNAs v 27 želodčnih rakov po aCGH-244K in označene 8p11-Q24, 20q11-Q13 in 7q21-q22 kot najbolj pridobljenih regij in 4q34, 6p25, 18q12 in 18q22 kot najbolj izgubljenih regij. V teh predhodnih študijah, so bili uporabljeni različni mikromrež (BAC ali PAC klon, oligo), da razišče CNAs pri raku želodca in poročali CNA regije so bile različne za različne študijske populacije.

Za identifikacijo CNAs pomembno v patogenezo raka želodca na korejskem populaciji, smo najprej izvedli genom za celotno analizo števila kopij DNA z uporabo aCGH-244K ali aCGH-400K v 40 želodčnih rakov in nato potrdil ugotovljenih CNAs z uporabo prilagojene aCGH-60K v drugem nizu 48 želodca raka. Učinki CNAs na izražanje genov so bili analizirani v nekaterih genov z CNAs.

Rezultati

Odkritje CNAs vključeni v karcinogenosti želodčne

Da bi odkrili CNAs vključeni v karcinogenosti želodca, tumorja poveže normalno tkivo od 40 bolnikov z rakom želodca smo analizirali z uporabo niza primerjalne genomske hibridizacije (aCGH); 30 primerov, ki jih aCGH-400K in 10 primerov, ki jih aCGH-244K. CNAs so bile odkrite v celotnem genomu, in število kopija dobički so bili bolj pogosti kot izgube števila kopij (slika 1A). Število CNAs bila povsem drugačna pri posameznikih. Povprečno število CNAs na primeru je bilo 64 za dobičke in 40 za izgube (slika 1B), mediana dolžina regije CNA je bilo 44.016 bp za dobičke in 4732 bp izgub (slika 1C). Skupna CNAs so odkrili s pomočjo kontekst popravljeni algoritem s pragom p-vrednost 0,05 in praga prekrivanja 0,9 (slika 1D). Kopiranje število dobički so pogosto odkrije na kromosomske regije 7p22.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34 in 20q11-V13, in copy izgube število so pogosto opazili na 3p14.2, 6q26, 7q36.3, 13q34 in 18q23 . Izgube so bile v glavnem odkrita na koncih kromosomov in velikost je relativno majhen. CNAs so manj pogosta na kromosomih 2 in 15. skupni aberacij dolžine z nizko vrednostjo p večinoma padle v 1 kb, 10 kb (slika 1E). Skupna aberacije okoli MYC
gene na 8q24.21 so prikazani na sliki 1F. Podatki o aCGH-244K in aCGH-400K je mogoče prenesti s strani NCBI Gene Expression Omnibus portala (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). (pristopno številko: GSE69318 in GSE69266 oz)

Validation od aCGHs s MLPA analize

Nekateri genomske neravnovesja zazna bila aCGH potrjena uporabo na osnovi PCR multipleks ligacijskega odvisna od sonda ojačanja (MLPA). Šest vzorcev tkiva 40 analizirali z aCGH bili na voljo za MLPA. Kopiranje številka spremembe v MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), WDR60
(7q36.3), COL4A2
(13q34), NFATC1
(18q23) in NCOA3
(20q12) so bili analizirani v šestih ujema tumorja in normalnih tkiv parov (268-1, 271-1, 272-2, 301 -1, 685-1 in 685-2). MYC
smo pomnožili v 271-1T in 301-1T (slika 2A), NCOA3
je pridobil v 301-1T in 685-2T (slika 2B) in FHIT
je bil izbrisan v 271-1T, 301-1T in 685-1T (slika 2A). Ti rezultati so bili zelo skladne s tistimi, ki jih aCGH zazna. Vendar pa je WDR60
(slika 2C), NFATC1
(slika 2D) in COL4A2
(slika 2E), ki so bile ugotovljene izgube števila kopij genov, kot so da se izgubi v aCGH, niso bili odkriti v MLPA. Dolžina izbris regije v WDR60
gena, ki aCGH odkritih je bilo 2907 bp, in COL4A2
in NFATC1
bilo 1903 bp in 2596 bp oz. Na podlagi teh ugotovitev, je verjetno, da so lahko aberacije segajo majhne regije, ki jih aCGH opazili false.

Dodatna validacija CNA regij z aCGH-60K

Za potrditev in omejiti CNA regije ponavljajočih (> 20%) števila kopij dobičke ali izgube, ki jih aCGH opazili v 40 vzorcih, smo dodatno analizirali svoje aberacije v tumor in pokrite normalnih tkiv iz drugega 48 bolnikov z rakom želodca uporablja prilagojeno aCGH-60K. CNA regije na 8q24, 20q11-Q13, 3p14.2 in 18q23 pokazala sovpada spremembe o številu kopij v aCGH-60K, vendar CNAs na drugih območjih, kot 20p13-20p12 in 20q21.2, ni pokazal iste vzorce kot pri 244K in 400K, s čimer se kaže heterogene rezultate med aCGH platformah. Da bi našli minimalne skupne regije (DARS) od števila kopij sprememb med tremi platform, smo prekrita CNA regije v skupno 88 vzorcev. DARS ponavljajočih (> 20%) kopiranje dobički število bili odkriti v več regijah kromosomskih vključno 7p22.1 (20%), 7q22.1 (31% ~ 44%), 8q24.21 (27% ~ 30%), 8q24.3 (22% ~ 48%), 13q34 (20% ~ 31%) in 20q11 ~ V13 (25% ~ 30%) (Tabela 1 in Tabela A S1 datoteke). DARS ponavljajočih (> 20%) kopirati izgube število je bilo ugotovljeno tudi v sedmih kromosomskih regijah, vključno 3p14.2 (43%), dajanje zatočišča FHIT
(Tabela 1 in Tabela B v S1 datoteke)

združenje Gene-odvisna od ravni CNAs in mRNA

Da bi raziskali vpliv CNAs na izražanje genov, smo izmerili raven mRNA iz več genov ( MYC
, SCRIB
, PUF60
, BOP1
, SNTA1
, E2F1
, CD40
, EYA2
NCOA3
, FHIT
, CRK
in SMAD2
) na skupnih aberacij regij v 48 tumorja in usklajena normalnih tkiv in analizirali povezavo z CNAs. Učinek CNAs na genske ekspresije smo analizirali s primerjavo sprememb v mRNA pokrovček (FC) v raka z in brez CNAs. Korelacija med kopijo število sprememb in ustrezno izražanje genov je bila drugačna po kopirati številko dobičke ali izgube. Večina genov z izgubami števila kopij pokazala downregulation mRNA: raven mRNA je navzdol reguliranih v FHIT
(tabela 2 in slika 3A), CRK
in SMAD2
genov (tabela 2). Vendar pa smo ugotovili korelacijo med števila kopij dobičkov in uravnavanjem ravni mRNA je gen: ravni mRNA v genih, kot so MYC
, PUF60
, BOP1
(slika 3B) in E2F1
so pozitivno povezana s številčnimi kopija dobičke. Vendar pa ni bilo združenje ugotovljeno med mRNA in kopirati številko večjo genov, kot so SCRIB
, BCL2L1
, SNTA1
, CD40
, EYA2
in NCOA3
(tabela 2), kar kaže, da je lahko odnos med števila kopij dobičkov in izražanja gen.

zveza CNAs z clinicopathological značilnosti

povezava med številko izvoda sprememb in clinicopathological spremenljivke smo analizirali 88 bolnikov z rakom želodca. Petnajst geni s ponavljajočim (> 20%) število kopij spremembe so bile za analizo izbrali. Kopiranje številka izgube CRK
( P
= 0,07), SMAD2
( P
= 0,09), FHIT
( P
= 0,68) in NFATC1
( P
= 0,11) geni niso med difuzna tipa raka in raka črevesnih tipa (slika 3c), občutno razlikujejo. Vendar pa je število kopij dobički večinoma pojavi na visoki razširjenosti v raka intestinalnega tipa kot pri rakih difuzna tipa (slika 3D in 3E, preglednica C v S1 datoteke). Za SCRIB
( P
= 0,36), PUF60
( P
= 0,07), MAPK15
( P
= 0,08), E2F1
( P
= 0,14), SNTA1
( P
= 0,15), BCL2L1
( P
= 0,15), NCOA3
( P
= 0,22) in EYA2
( P
= 0,06), število kopij dobički prišlo na visoki razširjenosti v raka intestinalnega tipa kot pri rakih difuzna tipa, vendar razlika ni bila statistično značilna. Kopiraj številko dobičkov MYC
( P
= 0,03), BOP1
( P
= 0,03) in CD40
( P
= 0,01), so bile na zelo visoki ravni razširjenosti primerov raka, črevesnih tipa v primerjavi z razpršeno tipa raka. Za odkrivanje CNAs povezanih s staranjem prebivalstva, smo analizirali povezavo med starosti bolnika in kopiranje sprememb številko z uporabo Pearson korelacijske koeficiente, vendar ne najde korelacija je bilo med spremembo števila kopij 15 genov in starosti bolnikovega (slika 4A). Hierarhična analiza povezovanje bila izvedena, da bi bolniki v skupini s podobnimi CNAs. Večina bolnikov s številko izvoda dobičkov na 8q24 imeli tudi število kopij dobičke na 20q11.21 ali 20q13.12 (slika 4B). Podatki so bili nadalje razdeljeni v 4 skupinah glede na prisotnost število kopij dobičkov na 8q24 in 20q11.21 (ali 20q13.12). Kopiranje številka dobički na 8q24 je bistveno povezan s kopijo število dobički na 20q11.21 ali 20q13.12 ( P
= 0,005, Fisherjev natančni test; Tabela D v S1 datoteke). Te ugotovitve kažejo, da lahko obe regiji, 8q24 in 20q11.21 (ali 20q13.12) podobno dovzetni za kopiranje število dobički pri raku želodca.

Pogovor

S spremembo genov odmerka s CNA je vedno bolj priznana kot pomembno sestavino tumorigeneze. Da bi odkrili nove CNAs sodelujejo v patogenezi raka želodca, smo izvedli genom za celotno analizo CNAs v tumor in se ujema normalno tkivo od 88 bolnikov z rakom želodca in identificirati pogostim (> 20%) število kopij koristi na več kromosomskih regij, vključno z 7p22 0,1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11 ~ Q13 in a ponavljajoče se izgube na 3p14.2, 4q35.2, 6q26 in 17p13.3. CNAs na 7p22.1, 13q34 in 17p13.3 niso poročali pri drugih populacijah. Regije 7p22.1 opredeljene v tej študiji vsebujejo gene FBXL18, ACTB ACTG1 in RNF216. Čeprav so CNAs na 7p22.1 niso poročali pri raku želodca, številne študije poročajo njihov vpliv na razvoj jajčnikov jasno celic adenokarcinoma [15] in endometrioze [16]. V tej študiji, kopirati številko adaptacije myc
(8q24.21), FHIT
(3p14.2) in NCOA3
(20q12) so bile potrjene z uporabo MLPA, vendar kopirati izgube številko ( WDR60
, COL4A2
, NFATC1
) okrog 2000bp niso bili potrjeni s MLPA. Mi pa ni izvedla obsežno računalniško oceno lažno pozitivnih stopenj, ki temeljijo na diod kliče. Namesto tega smo primerjali razširjenost izgub števila kopij med aCGH-244k & -400K In aCGH-60K z zelo gosto sonde po velikosti izgub število kopij: 1 KB-5KB, 5KB-10 KB, 10 KB, 50 KB, 50kb-100 KB, in 100k-. Statistično pomembne razlike samo v izgube števila kopij majhnosti (1 KB-5KB) (tabela E v S1 datoteke). Poleg tega je bilo ugotovljeno, pomembnih razlik v kromosomski locus specifični način: nobenih razlik bile ugotovljene v kromosomih 3, 6, 16, 17 in 20 (podatki niso prikazani). Zato je možno, da kopirati izgube število manjših velikosti, odkritih v aCGH-244K in aCGH-400K lahko lažno v nekaterih lokusih.

smo tudi analizirali minimalne skupne regije ponavljajočim (≥10%) ojačanje ali izbrisa v 88 želodčnih raka (tabela F v S1 datoteke) in jih primerjali z velikim raka želodca TCGA (rak Genome Atlas) študije (14) in treh predhodnih študij (tabela G v S1 datoteke). Študija TCGA je bila sestavljena iz 295 osnovnih želodčnih adenokarcinome in določila 30 kontaktnih ojačitve in 45 osrednjih izbris. Amplification (≥ 5 izvodov) na 8q24.21 ( MYC
), 17q12 ( erbB2
itd), 20q11.1-q13.33 (EYA2
, NCOA3
itd), in izbris (0 izvodov) na 3p14.2 ( FHIT
) so v naših podatkih kot tudi podatki iz TCGA in študij drugih ljudi (Tabela G v opazili S1 File). Vendar CNAs na 7p22.1, 13q34 in 17p13.3 niso poročali v študiji TCGA in druge populacije. Število regijah CNAs opredeljenih v študiji TCGA je bil večji od te študije, ki bi nastala zaradi različne podskupine članov vzorcev. Študija TCGA sestoji iz večjega črevesne tipa (66,4%) v primerjavi z razpršeno tipa raka (23,4%).

Med genov, ki se nahajajo na 8q24.21 je MYC znano, da spodbujajo rast in širjenje normalno želodčne celice in rasklapanje za MYC
zadržuje rast in razmnoževanje želodčnih rakavih celic [17]. MYC
kodira transkripcijski dejavnik, ki ureja vrsto genov, povezanih s proliferacijo, diferenciacijo in apoptozo [18]. MYC
ojačeno in prekomerno izražen v rakom želodca [19], in njegove izražanje povečuje postopoma razvije rak [20]. MYC
ojačanja je povezan z agresivnim obnašanjem želodca rakavih celic [21,22]. V tej študiji, kopirati številko pridobitve MYC
so bile ugotovljene na visoki razširjenosti v raka na črevesno tipa v primerjavi z rakom na razpršeno tipa, ki podpirajo ugotovitev, da je MYC protein izraz pogosteje opažen v intestinal- tip tumorjev kot difuzna tipa tumorjev [23]. Analizirali smo vpliv myc
CNAs na celotno preživetje znotraj posamezne vrste. Bolniki s številko izvoda dobičkom myc
imeli slabe celokupno preživetje v primerjavi s tistimi brez, vendar razlika ni bila statistično pomembna pri difuzni tip in črevesnih raka tipa (S1 sl). Število copy Pozitivne za POU5F1B
(POU domene razred 5 transkripcijski faktor 1B) pseudogene na 8q24.21 so našli v 27% analiziranih vzorcev. POU5F1B
je znano, da so povezani z mRNA izobilju in agresivnega fenotipa raka želodca [24].

8q24.3 in 20q11-V13 regije vsebuje na stotine genov (tabela A v S1 File), mnogi pa so verjetno vpleteni v onkogenezo. Med genov, ki se nahajajo v teh regijah, smo analizirali ravni mRNA SCRIB
, PUF60
in BOP1
na 8q24.3 in SNTA1
E2F1
, CD40
, EYA2
in NCOA3
na 20q11-Q13 (tabela 2). V tej študiji, kopirati številko pridobitve SCRIB
, SNTA1
, CD40
, EYA2
in NCOA3
bili ni povezan z kratno spremembo mRNA. Vendar pa je PUF60
, BOP1
in E2F1
geni bilo ugotovljeno, da so bistveno preveč izražen v tumorskih tkivih števila kopij dobičke. PUF60
bil preveč izražen v raka s CNAs ( P
= 0,038), vendar izraz ni pomembno razlikovala med tumorskih tkiv in izravnanih normalnih tkivih v vzorcih brez CNAs ( P
= 0,111). PUF60 (poli-U vezavo spajalni faktor 60kDa), varovalko veže-interakcije protein represivni (FIR), igra pomembno vlogo pri jedrskih procesih, kot so pre-mRNA spajanje in transkripcijske regulacije. Poleg tega PUF60 zavira MYC
prepis na promotorja P2 skozi jedro-TFIIH bazalni transkripcijski faktor [25]. Nedavno Gumireddy sod. [26] poročal, da je PUF60 potrebna za delovanje regulatorja na translacijskih regulativnega IncRNA (treRNA), ki je vključen v tumorske invazije in metastaz. Kopiranje število dobičkov PUF60
kažejo močno pozitivno korelacijo z izrazom na raka želodca [27] in raka jajčnikov [28]. Te ugotovitve kažejo, da se število copy pridobitve PUF60
lahko velik mehanizem, ki je podlaga prekomerno ekspresijo gena raka želodca.

V nasprotju z PUF60 je BOP1 in E2F1 je bilo ugotovljeno, da se preveč izražen v tumorskih tkivih s številko izvoda dobičke, kot tudi na tiste, ki nimajo. Kopiranje število dobičkov BOP1
in E2F1
v tej študiji se je pojavila pri 23% in 25% vzorcev je študiral oz. Povečane mRNA kratno spremembo BOP1
bila pomembna v tumorskih tkivih števila kopij dobičkov ( P
= 0,024), kot tudi pri tistih brez ( P
< 0,001) . BOP1 (blok orožja 1) je sestavni del kompleksa PeBoW (Pes1, Bop1 in WDR12), ki je potreben za zorenje 28s in 5.8S ribosomske RNA in formiranje 60S ribosoma [29]. BOP1 igra onkogenega vlogo pri karcinomom jetrnih celic z indukcijo epitelne-mezenhimskih prehod (EMT) in spodbujanje aktina skeleta preoblikovanja [30]. BOP1
gen je znano, da je prekomerno izražen v raka danke z 8q dobiček [31], in povečanje odmerka od BOP1
gen je povezana s povečanjem BOP1
mRNA v kolorektalnega raka [32]. E2F1 je tudi prekomerno izražen v tumorskih tkivih števila kopij dobičkov ( P
< 0,001) in tiste, ki nimajo ( P
= 0,03). E2F1 igra ključno vlogo pri nadzoru celičnega ciklusa in njegova dejavnost urejena z vezavo na retinoblastom beljakovin na način celičnega cikla odvisna. Over-izraz je iz E2F1 povezana z razvojem različnih tumorjev, in povečano število kopijo je E2F1
znano, da je povezana s prekomerno ekspresijo gena v melanoma [33] in raka materničnega vratu [ ,,,0],34]. Na podlagi teh ugotovitev, je verjetno, da skupni učinek števila kopij dobičkov na izražanje genov pri raku želodca spreminja v genski odvisnega način.

Čeprav število copy dobički na 13q34 niso bile navedene v rakom želodca je dobički so bile ugotovljene v 20-30% vzorcev študirali. Kopiranje številka dobički na 13q34 je znano, da je povezana z napredovanjem predrakavih sprememb MV neoplazije do skvamoznega karcinoma [35] in z majhnimi črevesja adenokarcinom [36]. Kopiranje številka dobički na 17q12 so pogoste pri raku želodca. V tej študiji je več genov, vključno s erbB2
, GRB7
, STARD3
, PPP1R1B
, RARA
, in C17orf37, smo pomnožili v 15-20% v 88 primerih, v skladu z drugimi študijami [37,38]. Nismo oceni korelacijo števila kopij in izražanja ravni genov, temveč več skupin so poročali, da so geni pomembni za razvoj raka želodca. Med njimi ErbB2 (HER2)
pogosto pomnožili in prekomerno izražen v želodčnih raka [39-41], in ojačanje HER2
je močno povezana s slabim preživetje, zlasti v črevesju vrsta raka želodca [42]. Radioinkorporacijo ErbB2 se pojavlja tudi na višji stopnji razširjenosti v črevesni tipa kot v razpršenih podtipov [43]. Poleg tega PPP1R1B-STARD3
fuzija prepis v človeškega raka želodca poveča nastanek kolonij z aktivacijo phosphatidylinosil-3-kinaze in AKT signalizacijo [44]. Pogoste ojačanje so poročali tudi GRB7
in pozitivne spremembe v izražanju z rakom želodca [41,43].

Najpogostejše izgube v tej študiji so pri odkrije na 3p14.2 (39% razporedijo-vrste in 37% črevesnih vrst), kjer FHIT
se nahaja. FHIT
je znana zaviralnih genov [45], in je pogosto vključena v izgubo heterozigotnosti (LOH) in izbrisov v človeških tumorjih [46]. Primarni želodčni karcinomi predstavljajo preureditev v FHIT
gena in 20 30 (67%) vzorcev razstavljen odsotnost FHIT
protein izraz [47]. Izguba FHIT
protein izraz povezana z napredovanjem bolezni in slabe diferenciacije rakom želodca [48]. V tej raziskavi smo ugotovili, da je FHIT
izraz se je zmanjšalo v želodčnih raka, z ali brez njegovega CNA, kar kaže, da genski odmerek kot tudi drugi mehanizmi uravnavajo FHIT
izraz v rakom želodca. Somatična missense mutacij (eksonu 6, kodon 61, ACG → ATG) za FHIT
Ugotovljena je bila tudi v želodčnih raka [49]. Poleg tega bi visoka frekvenca promotor hypermethylation za FHIT
(62%) se pojavi v želodcu raka [50]. Zato, povezovanje podatkov, število kopij z dodatnim genomskih podatkov je bistvenega pomena za celovito razumevanje genetske kontrolo genske ekspresije [51].

Kopiraj številko izgube več genov v tej študiji niso bistveno razlikovali med difuzna tipa raka in intestinalnega tipa raka. Vendar pa je bila razširjenost število kopij dobičkov razlikuje med obema vrstama v določenih genov, kar kaže, da se lahko okoljski dejavniki bolj vpliven pri kopiranju število dobičkov kot izgub. Poleg tega so bolniki s kopijo število dobičkov iz 8q24.21 in 8q24.3 večinoma imajo dobičke na 20q11-Q13, kar kaže na obe regiji lahko enako dovzetni za kopiranje razlike številko. Ta študija je bila močno omejena zaradi majhnega števila vzorcev in pomanjkanje podatkov o preživetju. Nadaljnje študije v veliki kohorti je potrebno razumeti funkcionalno pomen CNAs odkrite v tej študiji. Poleg tega so bile meritve mRNA ne izvaja na ravni genoma. Analizirali smo razmerje med mRNA nekaterih genov znano, da so pomembni pri patogenezi raka ljudi in CNAs. Pomemben korelacija je bilo med izražanjem MYC
, PUF60
, BOP1
in E2F1
geni in njihovo CNAs (tabela 2) . Statistično značilno korelacijo med CNAs za MYC
, PUF60
in E2F1
geni in njihove stopnje izraženosti je bilo tudi Fan et al. (11). Vendar pa je potrebna nadaljnja raziskava jasno razumeti učinek CNAs na genske ekspresije. Skratka, ta študija kaže, da število DNA kopije pridobi na 8q24.21, 8q24.3, 20q11-20q13 in izgube na 3p14.2 lahko skupni dogodki v raka želodca. Vendar CNAs na 7p22.1, 13q34 in 17p13.3 lahko korejski specifične. Poleg tega, kopiranje številka dobički lahko pogostejše v črevesju tipa kot rak difuzno tipa želodca.

Materiali in metode

Študija prebivalstva in DNA ekstrakcijo

Skupaj 88 bolnikov, 35 žensk in 53 moških, ki so prestali kurativno kirurško resekcijo raka želodca med novembrom 2004 in oktobrom 2010 na oddelku za kirurgijo v Samsung Medical Center, Seulu v Koreji, so sodelovali v tej študiji. Kirurško odstranili tumor tkiva smo po pridobitvi pisno privolitev iz vseh bolnikov zbirajo. Ta študija je odobril Samsung Medical Center (SMC) Institutional Review Board (IRB). Tumorji sta zaskočno zamrznjene v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C, dokler jih ne potrebujemo. Pred ekstrakcijo DNA iz sveže zamrznjene tkiva, so odseki dani na stekelca in obarvajo s H & E ovrednotiti primesi tumorskih in ne-tumorskih tkiv. Tumor in ne tumor področja so skrbno microdissected pod mikroskopom. Je microdissected tkiva smo razgradili s proteinazo K in genomsko DNA smo izolirali v skladu z navodili proizvajalca (DNeasy Tissue kit, Qiagen, Valencia, CA). Vzorec je sestavljalo 43 difuzna tipa raka, 41 črevesne tipa, in 4 raka mešanega tipa.

CNA analiza, ki uporablja aCGH

aCGH bila izvedena v skladu s priporočili proizvajalca. Po hibridizacijo DNA in pranje, so diapozitivi skenirane takoj uporabo Agilent mikromrež skener in surovi podatki so bili pridobljeni s pomočjo za kopiranje programske opreme v nastavitvah CGH parametrov privzete (Agilent Technologies). so bile ugotovljene domnevni CNA intervali v vsakem vzorcu z uporabo Agilent Genomska Workbench v7.0.4.0 programske opreme. Cy5 /razmerja Cy3 so spremenili v dnevnik _{2-spremenili vrednosti. Centralizacija in mehke nič popravki so bili uporabljeni za mikromrež. The (ADM-2) algoritem aberacija metoda za odkrivanje 2 na pragu 6.0 je bila uporabljena za identifikacijo CNAs v posameznih vzorcih in določiti aberacija frekvenc v vzorcih raka želodca (slika 5). smo uporabili naslednji filtri: Najmanjše število sond v regiji > = 3, najmanjša absolutna povprečno razmerje dnevnik regije > = 0,25. Skupne aberacije so odkrili s pomočjo kontekst popravljeni algoritem pri vrednostjo p < 0.05 in prag prekrivanje 0,9. CNAR (Copy Number Sprememba regija) je bila opredeljena kot zvezo več kot 90 odstotkov prekrivajočih zmotna segmentih v več vzorcev. UCSC Sestav genom hg19 smo uporabili kot sekvenco humanega genoma referenca. Za vsako platformo (244K, 400K in 60K), je bila uporabljena v paleto svetovno Lowess metoda normalizacija popraviti za lokalno prostorsko pristranskosti in zveznih prostorskih vzponi. Po znotraj polja normalizacije, je bil uporabljen kvantil med nizi normalizacijo primerjati rezultate aberacije čez polja. Te normalizations so bile izvedene z uporabo paketa limma v R. The MCR (Minimal Skupna regija) je definiran kot 100-odstotno prekrivajo skupnem območju med vzorci v CNAR. Obstaja več DARS v CNAR glede na morebitno prekrivanja frekvenco. Zahtevani minimalni kapital za ojačanje in izbrisa smo analizirali. Dopolnjevanje in izbris je bil določen, ko je bilo normalizirano razmerje log2 ≥0.8 in ≤-0,8 oz. smo opravili z uporabo R statistični jezik v.3.0.2 (www.r-project.org) vse statistične metode in vizualizacijo posameznih zmotna regij.}

Multiplex Ligation odvisni Probe Amplification (MLPA) Analiza

MLPA Analiza je bila izvedena s pomočjo SALSA MLPA kit P200 (MRC-Holland, Amsterdam, Nizozemska), v skladu z navodili proizvajalca [52]. Komplet P200 vsebuje 14 sond, notranje kontrole, da bi ocenila DNA denaturacijo in količino DNA, in tudi za kromosom X in Y. Vzorci DNA so bili razredčimo z VE 5 ul in segrevamo pri 98 ° C za 5 minut v PCR cevi v termostat z ogrevanim pokrovom. Po dodatku 1,5 ul MLPA pufra in 1,5 ul sondo mešanice bili vzorci dodatno segrevamo 1 minuto pri 95 ° C in nato inkubiramo 16 ur pri 60 ° C. Sekvence sonde za odkritih genov so navedeni v tabeli H v S1 datoteke. Ligacija spojenih oligonukleotidov smo izvedli z razredčevanjem vzorcev do 40 ul s pufrom za redčenje, ki vsebuje 1 U ligaze-65 encim, in inkubiranje pri 15 min pri 54 ° C. Ligaze encim je inaktiviramo s segrevanjem pri 98 ° C je bilo 5 min in ligacijske izdelki pomnožili s PCR. Medtem ko je pri 60 ° C, dodamo 10 ul v zapufrani raztopini, ki vsebuje PCR primerji, dNTP in SALSA polimerazo (MRC-Holland, Amsterdam, Nizozemska). PCR smo izvedli pri 35 ciklih (30 s pri 95 ° C, 30 s pri 60 ° C in 1 min pri 72 ° C). Reakcije MLPA PCR ločimo z uporabo sistema elektroforezo kapilarni, je ABI-Prism 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA), in analizirati podatke s a GeneMaker 2.0.0 (SoftGenetics, State College, PA). Podatki so bili prebivalci normalizirani in razmerja sonde pod 0,75 šteli za označbo izbrisa, medtem ko so se razmerja sonda nad 1,25 obravnavati kot znak ojačanja.

Kvantitativna Real-Time PCR (QRT-PCR)