Введение
<р> Рак желудка является третьей ведущей причиной развития рака. случаев смерти во всем мире. Несмотря на значительные успехи в диагностике и лечении рака желудка, пятилетние показатели выживаемости больных раком желудка остается ниже 30% в большинстве стран [1]. Кроме того, около половины пациентов, перенесших целебное хирургическую резекцию по-прежнему развиваются локо-региональных или отдаленных метастазов, несмотря на мульти-модальности терапевтического подхода и умирают от этой болезни [2,3]. Хотя большинство видов рака желудка отображать сходные клинические признаки, существует значительная гетерогенность в его гистопатологией и связанные с ними молекулярные изменения [4]. Соответственно, важно определить молекулярные биомаркеры, участвующие в канцерогенезе рака желудка для раннего выявления и целенаправленной терапии заболевания.
<Р> ДНК количество копий изменение (CNA) определяется как сегменты ДНК 1 кб или больше по размеру, является важным типом генетического изменения наблюдаются в раковых клетках [5]. СНА могут влиять на экспрессию генов, фенотипическое изменение и адаптацию путем разрушения проксимальных или отдаленные регуляторные участки ДНК или путем изменения уровней дозы гена [6,7]. Кроме того, распределение числа копий существенно отличается в разных популяциях предков, которые могут привести к различной восприимчивости к болезням через родовые группы [8]. В последнее время несколько групп проанализировали изменения ДНК числа копий в раке желудка с использованием массива сравнительную геномную гибридизацию (aCGH) и идентифицировали новые гены важную роль в патогенезе рака желудка [9-14]. Например, Цукамото и др. [10] исследовали CNAS в 30 случаях рака желудка с помощью BAC или PAC клонов, и определили наиболее частые участки ДНК прироста числа копий, как 20q13, 20q11, 8q24 и 20p12, и те потери, как 4q34-qter, 5q12, 18q21 и 3p14. Вентилятор и др. [11] обнаружили CNAS в 64 желудка тканей рака и 8 желудка линий раковых клеток путем использования BAC клонов, и заметил, что 20q12-20q13 и 9p21 были наиболее часто Усиленные и удаленные регионы, соответственно. Кроме того, Чанга и др. [12] изучали CNAS в 27 рака желудка по aCGH-244K и идентифицировали 8p11-Q24, 20q11-Q13 и 7q21-Q22 в качестве наиболее полученных регионов и 4q34, 6p25, 18q12 и 18q22 как наиболее потерянных регионов. В этих предыдущих исследованиях, различные микрочипов (BAC или PAC клон, олиго) были применены для исследования CNAS при раке желудка, и сообщили CNA регионы отличаются для различных изучаемых популяциях.
<Р> Для идентификации СНА важную роль в патогенезе от рака желудка в корейской популяции, мы впервые провели генома анализ числа копий ДНК с использованием aCGH-244K или aCGH-400K в 40 рака желудка, а затем подтверждено обнаруженные CNAS с помощью настраиваемой aCGH-60K в другом наборе 48 желудка раковые заболевания. Эффекты CNAS на экспрессию генов были проанализированы в некоторых из генов с СНА.
Открытие CNAS участие в канцерогенезе желудка Validation из aCGHs по MLPA анализа Для проверки и сузить регионы CNA рецидивирующих (&GТ; 20%) числа копий прибылей или убытков, наблюдаемых aCGH в 40 образцах, мы дополнительно проанализировали их аберраций в опухолевых и нормальных тканей совпавшие из других 48 больных раком желудка с помощью настраиваемой aCGH-60K. Области CNA в 8q24, 20q11-q13, 3p14.2 и 18q23 показали совпадающие изменения числа копий в aCGH-60K, но СНА в других регионах, таких, как 20p13-20p12 и 20q21.2, не показывают те же закономерности как в 244K и 400K, тем самым предлагая гетерогенные результаты среди aCGH платформ. Чтобы найти минимальные общие области (MCRs) от числа копий изменений среди трех платформ, мы перекрывали регионы CNA в общей сложности 88 образцов. MCRs рецидивирующих (> 20%) прирост количества копий, были обнаружены на нескольких участках хромосом, включая 7p22.1 (20%), 7q22.1 (31% ~ 44%), 8q24.21 (27% ~ 30%), 8q24.3 (22% ~ 48%), 13q34 (20% ~ 31%), и 20q11 ~ В13 (25% ~ 30%) (Таблица 1 и Таблица A в S1 File). MCRs рецидивирующих (> 20%) копия потери число также были обнаружены в семи хромосомных регионах, в том числе 3p14.2 (43%) укрывает FHIT Джин-зависимой ассоциации между уровнями СНА и мРНК Ассоциация CNAS с клинико-патологическими характеристиками 8q24.3 и 20q11-q13 области содержат сотни генов (таблица А в S1 Файл), но многие из них вряд ли участвуют в онкогенеза. Среди генов, расположенных в этих регионах, мы проанализировали уровни мРНК Scrib Исследуемая популяция и ДНК экстракции Мультиплекс Лигирование-зависимый Probe Amplification (MLPA) Анализ
<р> Чтобы обнаружить CNAs участие в канцерогенезе желудка, опухоли и нормальных тканей подобраны из 40 больных раком желудка были проанализированы с использованием массива сравнительную геномную гибридизацию (aCGH); 30 дел по aCGH-400К и 10 случаев по aCGH-244K. СНА были обнаружены по всему геному, и получает номер копии были более распространены, чем потери числа копий (рис 1А). Число CNAS сильно отличалась среди индивидуумов. Среднее число CNAS в случае было 64 для выигрышей и 40 для потерь (рис 1В), а средний длина CNA области составил 44016 пар оснований для выигрышей и 4732 п.н. для потерь (рис 1C). Общими CNAs были обнаружены с помощью контекстно-исправлен алгоритм с порогом р-значения 0,05 и порога перекрытия 0,9 (рис 1D). получает номер копирования были обычно обнаружены на участках хромосом 7p22.1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34 и 20q11-q13, а также копировать потери число часто наблюдались на 3p14.2, 6q26, 7q36.3, 13q34 и 18q23 , Потери были в основном обнаружены на концах хромосом, а размер был относительно небольшим. CNAs были менее распространены на хромосомах 2 и 15. общие длины аберраций с низким р-значение, главным образом снизилась, в пределах 1 кб-10 кб (рис 1E). Общие аберрации вокруг MYC
гена на 8q24.21 показаны на рис 1F. Данные aCGH-244K и aCGH-400K можно загрузить из Экспрессия гена Omnibus портале NCBI (в www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). (Номер доступа: GSE69318 и GSE69266 соответственно)
<р> Некоторые геномные дисбалансы, обнаруженные при aCGH были проверены с использованием мультиплексной перевязки-зависимого зонда ПЦР-амплификации на основе (MLPA). Шесть из образцов ткани 40 анализировали с использованием aCGH были доступны для ММПУ. Скопировать номер переделки MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), WDR60
(7q36.3), COL4A2
(13q34), NFATC1
(18q23) и NCOA3
(20q12) были проанализированы в шести совпавшего опухоли и пар нормальных тканей (268-1, 271-1, 272-2, 301 -1, 685-1 и 685-2). MYC
усиливалось в 271-1T и 301-1T (рис 2А), NCOA3
был получен в 301-1T и 685-2T (рис 2В), и FHIT
был удален в 271-1T, 301-1T и 685-1T (рис 2А). Эти результаты были весьма согласуются с детектируется aCGH. Тем не менее, количество копий потери генов, таких как WDR60
(рис 2С), NFATC1
(рис 2D) и COL4A2
(рис 2E), которые были найдены теряться в aCGH, не были обнаружены в ММПУ. Длина области удаления в WDR60
гена, обнаруженного aCGH был 2907 п.о., и COL4A2
и NFATC1
были 1903 п.н. и 2596 п.н., соответственно. На основании этих наблюдений, вполне вероятно, что аберрации, охватывающие небольшие области, наблюдаемые aCGH могут быть ложными.
Дополнительная проверка регионов CNA по aCGH-60K
(таблица 1 и таблица B в S1 File) <бр.>
<р> Для того, чтобы исследовать влияние СНА на экспрессию генов, мы измерили уровни мРНК нескольких генов ( MYC
, Scrib
, PUF60
, BOP1
, SNTA1
, E2F1
, CD40
, Eya2
, NCOA3
, FHIT
, ЦРК
и SMAD2
) на общих областей аберраций в 48 опухоли и подобраны нормальные ткани и проанализировали связь с СНА. Эффект CNAs на экспрессию генов анализировали путем сравнения изменения мРНК раза (FC) в раковых заболеваний с и без СНА. Корреляция между числом копий изменений и соответствующего экспрессии генов отличается в зависимости от копирования прибыли или убытков число. Большинство генов с потерями числом копий показал понижающей регуляции мРНК: уровень мРНК подавляются в FHIT
(таблица 2 и рис 3А), ЦРК
и SMAD2 <бр> генов (таблица 2). Тем не менее, мы обнаружили, что корреляция между числом копий прибыли и повышающей регуляции уровней мРНК гена специфические: уровни мРНК генов, таких как MYC
, PUF60
, BOP1
(рис 3B), и E2F1
были положительно связаны с прибыли числом копий. Тем не менее, ни одна ассоциация не была найдена между уровнями мРНК и числом копий генов, прирост таких как Scrib
, BCL2L1
, SNTA1
, CD40
, Eya2
и NCOA3
(таблица 2), что свидетельствует о том, что соотношение между числом копий прибыли и экспрессии генов могут быть специфические.
<р> связь между числом копий изменений и клинико-патологическими переменных анализировали в 88 больных раком желудка. Пятнадцать генов с повторяющимися (> 20%) число копий изменения были отобраны для анализа. Скопировать номер потери ЦРК
( P
= 0,07), SMAD2
( P
= 0,09), FHIT
( P
= 0,68), и NFATC1
( P
= 0,11) генов существенно не различаются между раков диффузного типа и рака кишечного типа (рис 3C). Тем не менее, копия получает номер, как правило, происходит при высокой распространенности заболеваемости раком кишечного типа, чем при раке диффузного типа (рис 3D и 3Е, таблица C в S1-файл). Для Scrib
( P
= 0,36), PUF60
( P
= 0,07), MAPK15
( P
= 0,08), E2F1
( P
= 0,14), SNTA1
( P
= 0,15), BCL2L1
( P
= 0,15), NCOA3
( P
= 0,22), и Eya2
( P
= 0,06), копия получает номер произошло при высокой распространенности заболеваемости раком кишечного типа, чем при раке диффузного типа, но разница не была статистически значимой. Скопировать номер коэффициенты усиления MYC
( P
= 0,03), BOP1
( P
= 0,03), и CD40
( P
= 0,01) были обнаружены при значительно высокой распространенности случаев рака кишечного типа по сравнению с диффузного типа рака. Для выявления связанных с возрастом СНА, мы проанализировали корреляцию между возрастом пациента и скопировать изменения числа с помощью коэффициентов корреляции Пирсона, но нашли никакой корреляции не было найдено между изменением числа копий генов 15 и возраста пациента (рис 4а). Иерархическая кластеризация анализ был проведен с целью пациентов группы с аналогичными СНА. Большинство пациентов с прироста количества копий на 8q24 также имели прирост числа копий на 20q11.21 или 20q13.12 (рис 4б). Данные были дополнительно разделены на 4 кластера в соответствии с наличием прироста количества копий на 8q24 и 20q11.21 (или 20q13.12). Копирование получает номер в 8q24 было в значительной степени связано с прирост количества копий на 20q11.21 или 20q13.12 ( P
= 0,005, точный критерий Фишера, таблица D в S1 File). Эти наблюдения указывают на то, что эти две области, 8q24 и 20q11.21 (или 20q13.12), может быть так же восприимчивы, чтобы скопировать прибыли в число рака желудка.
Обсуждение
<р> Изменение дозы гена на CNA в настоящее время все более широкое признание в качестве важного компонента онкогенеза. Для того, чтобы открыть роман CNAs участвует в патогенезе рака желудка, мы провели генома анализ CNAS в опухоли и соответствием нормальных тканей от 88 больных раком желудка и определили повторяющимся (> 20%) скопировать прибыль номер в нескольких хромосомных регионах, включая 7p22 0,1, 8q24.21, 8q24.3, 13q34, 20q11 ~ Q13 и рецидивирующих потери при 3p14.2, 4q35.2, 6q26 и 17p13.3. СНА в 7p22.1, 13q34 и 17p13.3 не сообщалось в других группах населения. В 7p22.1 регионы, определенные в настоящем исследовании, содержат гены FBXL18, ACTB, ACTG1 и RNF216. Хотя СНА на 7p22.1 не сообщалось при раке желудка, некоторые исследования сообщили, что их влияние на развитие яичников ясном клеток аденокарциномы [15] и эндометриоза [16]. В этом исследовании, число копий переделок MYC
(8q24.21), FHIT
(3p14.2), и NCOA3
(20q12) были проверены с использованием ММПУ, но скопировать потери число ( WDR60
, COL4A2
, NFATC1
) из около 2000bp не были подтверждены ММПУ. Нам не удалось выполнить обширную вычислительную оценку ложных положительных темпов массива на основе вызовов. Вместо этого мы сравнили распространенность потери числа копий между aCGH-244K &Amp; -400K И aCGH-60K с высокой плотностью зондов в соответствии с размерами потерь количества копий: 1kb-5KB, 5кб-10kb, 10kb-50kb, 50kb-100kb и 100k-. Статистически значимые различия были обнаружены только в потерях количества копий небольшого размера (1kb-5KB) (Таблица E в S1-файл). Кроме того, существенные различия были обнаружены в хромосомный локус-специфическим образом: никаких различий не было обнаружено в хромосомах 3, 6, 16, 17, и 20 (данные не показаны). Поэтому вполне возможно, что число копий потери небольшого размера обнаруженного в aCGH-244K и aCGH-400К может быть ложным в некоторых локусах.
<Р> Кроме того, мы проанализировали минимальные общие области повторяющимися (≥10%) амплификации или делеции в 88 рака желудка (таблица F в S1 файл) и сравнили их с большим раком желудка TCGA (Рак Атлас генома) исследование (14) и трех предыдущих исследованиях (Таблица G в S1-файл). Исследование TCGA состояла из 295 первичных желудка аденокарциномы и определили 30 координаторов уточнениями и 45 координационных удалений. Amplification (≥ 5 копий) в 8q24.21 ( MYC
), 17q12 ( ERBB2
и т.д.), 20q11.1-q13.33 (Eya2
, NCOA3
и т.д.), и удаление (0 копий) в 3p14.2 ( FHIT
) наблюдались в наших данных, а также данных из TCGA и исследований других (табл G в S1 File). Тем не менее, СНА в 7p22.1, 13q34 и 17p13.3 не сообщалось в исследовании TCGA и других групп населения. Число регионов СНА выявленных в исследовании TCGA было больше, чем настоящего исследования, которое может возникнуть в результате различных подгрупп членов выборки. Исследование TCGA состоит из большего кишечного типа (66,4%) по сравнению с диффузным типа раковые заболевания (23,4%).
<Р> Среди генов, расположенных на 8q24.21, MYC, как известно, стимулируют рост и пролиферацию нормальных клетки желудка и нокдаун MYC
сдерживает рост и пролиферацию клеток рака желудка [17]. MYC
кодирует транскрипционный фактор, который регулирует различных генов, связанных с пролиферации, дифференцировки и апоптоза [18]. MYC
усиливается и чрезмерно выраженное в раке желудка [19], и его экспрессия постепенно возрастает, как развивается рак [20]. MYC
усиление связано с агрессивным поведением клеток рака желудка [21,22]. В этом исследовании, число копий завоевания MYC
были найдены при высокой распространенности в рака кишечного типа по сравнению с раки диффузного типа, поддерживая наблюдение, что экспрессия MYC белок чаще наблюдается в intestinal- тип опухоли, чем в опухолях диффузного типа [23]. Мы проанализировали эффект MYC
CNAS на общую выживаемость в пределах каждого типа. Пациенты с числом копий усилений MYC
имели плохую общую выживаемость по сравнению с пациентами без, но разница не была статистически значимой при диффузной типа и кишечных раковых образований типа (S1). Рис Прирост числа копий POU5F1B
(POU домен класса 5 фактора транскрипции 1B) псевдо- на 8q24.21 были обнаружены в 27% анализируемых образцов. POU5F1B
, как известно, связано с мРНК изобилия и агрессивного фенотипа рака желудка [24].
, PUF60
и BOP1
на 8q24.3 и SNTA1
, E2F1
, CD40
, Eya2
и NCOA3
в 20q11-q13 (таблица 2). В настоящем исследовании, число копий завоевания Scrib
, SNTA1
, CD40
, Eya2
и NCOA3
были не связано с кратном изменением уровней мРНК. Тем не менее, PUF60
, BOP1
, и E2F1
гены оказались значительно сверхвыражен в опухолевых тканях с прироста числа копий. PUF60
был чрезмерно выраженное в раковых заболеваний с СНА ( P
= 0,038), но его экспрессия существенно не отличалась от опухолевых тканей и подобранных нормальных тканей в образцах без СНА ( P
= 0,111). PUF60 (поли-U, связывающий фактор сплайсинга 60kDa), плавкий предохранитель-связывающий белок-репрессор взаимодействующий (КИХ), играет определенную роль в ядерных процессах, таких как пре-мРНК сплайсинга и регуляции транскрипции. Кроме того, PUF60 Подавляет <ЕМ> MYC
транскрипции на Р2-промотора через керн-TFIIH базального фактора транскрипции [25]. В последнее время, Gumireddy и др. [26] сообщили, что PUF60 требуется для функции регулятора поступательной регулирующей IncRNA (treRNA), который участвует в инвазии и метастазирования опухолей. Число копий коэффициенты усиления PUF60
показывают сильную положительную корреляцию с выражением при раке желудка [27] и при раке яичников [28]. Эти наблюдения указывают на то, что число копия завоевания PUF60
может быть основным механизмом, лежащим в основе чрезмерной экспрессии гена при раке желудка.
<Р> В отличие от PUF60, то BOP1 и E2F1 были найдены быть чрезмерно выражены в опухолевых тканях с прироста количества копий, а также в тех, кто без. Число копий коэффициенты усиления BOP1
и E2F1
в данном исследовании, имели место в 23% и 25% исследованных образцов соответственно. Увеличение мРНК раза изменение BOP1
было значительным в опухолевых тканях с прироста числа копий ( P
= 0,024), а также в тех без ( P
&л; 0,001) , BOP1 (блок пролиферации 1) является составной частью PeBoW (pes1, Bop1 и WDR12) комплекса, который необходим для созревания 28S и 5.8S рибосомных РНК и формирования 60S рибосом [29]. BOP1 играет онкогенного роль в гепатоцеллюлярной карциномы путем индуцирования эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT) и содействие актинового цитоскелета ремоделирования [30]. BOP1
ген, как известно, сверхвыражен при раке прямой кишки с усилением 8Q [31], а также увеличение доз BOP1
ген связан с увеличением BOP1
мРНК в колоректального рака [32]. также сверхвыражен E2F1 в опухолевых тканях с прироста числа копий ( P
&л; 0,001), а также в тех без ( P
= 0,03). E2F1 играет решающую роль в контроле клеточного цикла и его активность регулируется посредством связывания с белком ретинобластомы в клеточного цикла-зависимым образом. Сверхэкспрессия E2F1 связана с развитием разнообразных опухолей, а также увеличением числа копию E2F1
, как известно, связаны с чрезмерной экспрессией гена в меланоме [33] и рак шейки матки [ ,,,0],34]. На основании этих наблюдений, вполне вероятно, что общее воздействие прироста числа копий на экспрессию генов при раке желудка варьирует в гене-зависимым образом
. <Р> Несмотря на то, получает номер копии на 13q34 не было зарегистрировано в рака желудка, то успехи были найдены в 20-30% исследованных образцов. Копирование получает номер в 13q34, как известно, связаны с прогрессированием ЦИН до плоскоклеточного рака [35] и с небольшой аденокарциномы толстой кишки [36]. Копирование получает номер в 17q12 часто встречаются при раке желудка. В настоящем исследовании, несколько генов, в том числе ERBB2
, GRB7
, STARD3
, PPP1R1B
, RARA
, и C17orf37, были усилены в 15-20% 88 случаев, в соответствии с результатами других исследований [37,38]. Мы не оценивали соотношение количества копий, и уровни экспрессии генов, но несколько групп сообщили о том, что гены играют важную роль в развитии рака желудка. Среди них, <ЕМ> ERBB2 (HER2)
часто усиливается и сверхвыражен в рака желудка [39-41], и усиление <ЕМ> HER2
был сильно связан с плохой выживаемостью, особенно в желудочно-кишечном тип рака желудка [42]. Иммунореактивность ERBB2 также происходит при более высокой скорости в распространенности кишечного типа, чем в диффузных подтипов [43]. Кроме того, PPP1R1B-STARD3
слитый транскрипт при раке желудка человека увеличивает образование колоний путем активации phosphatidylinosil-3-киназы и AKT сигнализации [44]. Частое усиление GRB7
и положительные изменения в экспрессии были также зарегистрированы при раке желудка [41,43].
<Р> Наиболее частые потери в этом исследовании были обнаружены на 3p14.2 (39% диффузного типа и 37% кишечных типов), где FHIT
расположен. FHIT
является хорошо известный ген супрессор опухолей [45], и часто участвует в потере гетерозиготности (LOH) и делеций в опухолях человека [46]. Первичные желудочных карцином представляют собой перестановку FHIT
гена и 20 из 30 (67%) образцов выставлялась отсутствие FHIT
экспрессии белка [47]. Потеря FHIT
экспрессии белка коррелирует с прогрессированием заболевания и плохой дифференциации в развитии рака желудка [48]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что FHIT
выражение восстанавливали рака желудка с или без его CNA, предполагая, что дозы генов, а также другие механизмы регулирования FHIT
выражение в рак желудка. Соматическая мутация Миссенс (экзон 6, кодон 61, ACG → ATG) из FHIT
также была определена в рака желудка [49]. Кроме того, высокая частота промотора гиперметилированием FHIT
(62%) наблюдается при рака желудка [50]. Таким образом, включение данных число копий с дополнительными геномных данных имеет важное значение для всестороннего понимания генетического контроля экспрессии генов [51].
<Р> количество копий потери нескольких генов в данном исследовании, существенно не отличались от рака диффузного типа и кишечного типа рака. Тем не менее, распространенность прироста количества копий отличается от обоих типов в определенных генах, предполагая, что факторы окружающей среды могут быть более влиятельными в прирост количества копий, чем потерь. Кроме того, пациенты с копией прироста числа на 8q24.21 и 8q24.3 имели тенденцию к прибыли на 20q11-q13, предполагая, обе области могут быть в равной степени подвержены копировать изменения числа. Это исследование было строго ограничено из-за небольшого количества образцов и отсутствие данных по выживаемости. Дальнейшее исследование в большой группе требуется, чтобы понять функциональное значение CNAS обнаруженную в этом исследовании. Кроме того, измерения мРНК не были выполнены на уровне генома. Мы проанализировали взаимосвязь между уровнями мРНК некоторых генов известно, что важную роль в патогенезе рака у человека и СНА. Значительная корреляция между уровнями экспрессии MYC
, PUF60
, BOP1
, и E2F1
генов и их СНА (таблица 2) , Статистически значимая корреляция между CNAS из MYC
, PUF60
, и E2F1
гены и их уровни экспрессии были найдены также Fan и др. (11). Тем не менее, требуются дальнейшие исследования, чтобы четко понять влияние СНА на экспрессию генов. В заключение, данное исследование показывает, что число копий ДНК получает в 8q24.21, 8q24.3, 20q11-20q13 и потери при 3p14.2 могут быть общие события в рак желудка. Тем не менее, СНА в 7p22.1, 13q34 и 17p13.3 может быть корейский конкретной. Кроме того, копия получает номер может быть более частым в кишечном типа, чем рак желудка диффузного типа.
Материалы и методы
<р> В общей сложности 88 пациентов, 35 женщин и 53 мужчин, которые подверглись целебное хирургической резекции по поводу рака желудка в период с ноября 2004 года по октябрь 2010 года на кафедре хирургии в медицинском центре Samsung, Сеул, Корея, участвовали в этом исследовании. Удалены хирургическим путем ткани опухоли были собраны после получения письменного информированного согласия от всех пациентов. Это исследование было одобрено Samsung Medical Center Board Review (SMC) Институциональная (IRB). Опухоли быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С до тех пор, пока это необходимо. До экстракции ДНК из свежезамороженных тканей, срезы помещают на предметном стекле и окрашивали H &Amp; E, чтобы оценить примесь опухолевыми и неопухолевых тканей. Опухолевые и неопухолевой участки были тщательно микродиссекции под микроскопом. В микродиссекции ткани расщепляли с помощью протеиназы К, и геномную ДНК выделяли в соответствии с инструкциями изготовителя (набор тканей DNeasy, Qiagen, Valencia, CA). Выборка состояла из 43 раков диффузного типа, 41-кишечного типа, и 4-х видов рака смешанного типа.
Анализ CNA используя aCGH
<р> aCGH проводили в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. После того, как ДНК-гибридизации и промывки, слайды были отсканированы непосредственно с использованием микрочипов сканер компании Agilent, и необработанные данные были извлечены с помощью функции извлечения программного обеспечения при настройке параметров ГКГ по умолчанию (Agilent Technologies). Интервалы CNA в Предполагаемые каждой выборки были определены с использованием программного обеспечения v7.0.4.0 Agilent геномная Workbench. /коэффициенты Cy3 Cy5 были преобразованы в журнал <суб> 2-преобразованных значений. Централизация и нечеткие нулевые поправки были применены к микрочипов. (ADM-2) алгоритм аберрация Метод обнаружения 2 на пороге 6.0 был использован для идентификации СНА в отдельных образцах и для определения частоты аберраций в образцах рака желудка (рис 5). Были использованы следующие фильтры: минимальное количество зондов в области > = 3, минимальное абсолютное среднее отношение логарифм области > = 0,25. Общие аберрации были обнаружены с помощью контекстно-исправлен алгоритм при р-значение < 0,05 и порог перекрытия 0,9. CNAR (Copy Number Переделка область) была определена как объединение более чем на 90 процентов перекрывающихся аберрантных сегментов по нескольким образцам. УСК сборки генома hg19 был использован в качестве человеческой последовательности референсного генома. Для каждой платформы (244K, 400K, и 60K), то в массиве метод нормализации глобальной Lowess был применен для коррекции локального пространственного смещения и непрерывных пространственных градиентов. После нормализации в массиве, квантиль между нормализацией массива была применена для сравнения результатов аберраций между массивами. Эти нормализациями проводились с использованием пакета limma в R. БЩУ (минимальная общая область) была определена как 100-процентным перекрытием общей области между образцами в CNAR. Есть несколько MCRs в CNAR в соответствии с возможными перекрывающей частоты. MCR амплификации и делеции анализировалась. Усиление и удаление было определено, когда нормализованное отношение log2 был ≥0.8 и ≤-0,8, соответственно. были проведены с использованием R статистический язык v.3.0.2 (www.r-project.org) Все статистические методы и визуализация отдельных аберрантных регионов.
<р> MLPA анализ проводили с использованием набора P200 САЛЬСА MLPA (MRC-Holland, Амстердам, Нидерланды) в соответствии с инструкциями изготовителя [52]. В комплект P200 содержит 14 зондов внутреннего контроля для оценки денатурации ДНК и количество ДНК, а также для хромосомы X и Y. Образцы ДНК были разведены ТЭ до 5 мкл, и нагревали при 98 ° С в течение 5 мин в ПЦР-пробирки в амплификатор с нагретой крышкой. После добавления 1,5 мкл буфера MLPA и 1,5 мкл смеси зонда, пробы были дополнительно нагревали в течение 1 мин при 95 ° С, а затем инкубировали в течение 16 ч при 60 ° С. Зонд последовательности для обнаруженных генов приведены в таблице H в S1 File. Лигирование отожженных олигонуклеотиды проводили путем разбавления образца до 40 мкл с буфером для разведения, содержащего 1 U-лигазы-65 фермента, и инкубацию в течение 15 мин при 54 ° С. -Лигазы фермент инактивировали путем нагревания при 98 ° С в течение 5 мин и Продукты лигирования амплифицировали с помощью ПЦР. В то время как при 60 ° С, добавляли 10 мкл буферного раствора, содержащего ПЦР-праймеры, дНТФ и сальса-полимеразы (MRC-Holland, Амстердам, Нидерланды). ПЦР проводили в течение 35 циклов (30 с при 95 ° С, 30 с при 60 ° С и 1 мин при 72 ° С). Реакции MLPA ПЦР разделяли с использованием системы электрофореза капилляров, ABI Prism-3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA), и данные анализировали с использованием GeneMaker 2.0.0 (SoftGenetics, State College, PA). Данные были нормализованы населения, а отношения зонда ниже 0,75 расценивались как признак удаления, в то время как отношения зонда выше 1,25 были расценены как признак усиления.
Количественная ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) <бр
Повышение рисков биозащиты, создаваемых синтетической биологией
Секвенирование РНК позволяет по-новому взглянуть на микробиом
Функция печени может иметь важное значение для риска болезни Альцгеймера.
У женщин больше шансов заболеть длительным COVID?
Как укрепить свою иммунную систему для борьбы с коронавирусом
Биологическая терапия может снизить риск тяжелой формы COVID-19
Пробиотики могут иметь терапевтические преимущества для пациентов с биополярным расстройством.
Исследование системы здравоохранения Шеппарда Пратта в Балтиморе показало, что пробиотики могут служить потенциальным терапевтическим подходом к биполярному расстройству и другим психическим заболеван
Будут ли диеты на основе ДНК и персонализированные лечебные продукты - будущее для похудения?
Большинство людей знают, что гены унаследованы от родителей и что ДНК этих родителей объединяются, чтобы создать уникальный генетический состав человека. Это определяет такие аспекты фенотипа, как цве
Мало доказательств наличия тромбоцитопении, связанной с мРНК COVID-19,
предлагает новое исследование FDA Несмотря на то, что для противодействия пандемии коронавирусной болезни 2019 г. (COVID-19) было выпущено множество вакцин, Сообщалось о некоторых серьезных побочных э