PLoS ONE: Ændret Ekspression af Hypoxi-Inducerbar Factor-1α (HIF-1α) og dens regulatoriske gener i Gastric Cancer Væv

Abstrakt

vævshypoksi inducerer omprogrammering af cellemetabolisme og kan resultere i normal celle transformation og kræft progression. Hypoxi-inducerbar faktor 1-alfa (HIF-1α), nøglen transskriptionsfaktoren, spiller en vigtig rolle i gastrisk cancerudvikling og progression. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge den underliggende lovgivningsmæssige signalvejen i mavekræft hjælp mavekræft vævsprøver. Integrationen af ​​genekspression profil og transkriptionel regulatorisk element database (TRED) blev forfulgt for at identificere HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 gen veje og deres regulerede gener. Dataene viste, at der var 82 differentielt udtrykte gener, der kunne reguleres af disse fem transkriptionsfaktorer i mavekræft væv og disse gener dannet 95 regulering modes, hvoraf syv gener (MMP1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, og TFF3 ) var hub molekyler, der er reguleret i det mindste to af disse fem transkriptionsfaktorer samtidigt og var forbundet med hypoxi, inflammation og immunsygdom. Real-Time PCR og western blot viste stigende af HIF-1α i mRNA og protein niveauer samt TIMP1, TFF3 i mRNA-niveauer i gastrisk cancer væv. Dataene er den første undersøgelse for at demonstrere HIF-1a-regulerede transkriptionsfaktorer og deres tilsvarende netværk gener i mavekræft. er behov for yderligere undersøgelse med en større stikprøve og mere funktionelle eksperimenter for at bekræfte disse data og derefter oversætte til klinisk biomarkør opdagelse og behandling strategi for mavekræft

Henvisning:. Wang J, Ni Z, Duan Z, Wang G Li F (2014) ændret ekspression af Hypoxi-Inducerbar Factor-1α (HIF-1α) og dens regulatoriske gener i Gastric Cancer væv. PLoS ONE 9 (6): e99835. doi: 10,1371 /journal.pone.0099835

Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: 10. januar, 2014 Accepteret: 19 maj 2014; Udgivet: 13 juni 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (̭20108025 ogQ.271.897), Specialized forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (É10061120093), Kina Postdoc Science Foundation (É10491311 ogÉ2T50285), Foundation of Jilin provinsen Health Department (É1Z049), Foundation of Jilin provinsen Videnskab og Teknologi Institut (É30522013JH ogÉ40414048GH) og Norman Bethune Program for Jilin University (.012.219). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i verden, der rammer ca. 800.000 personer og 65.000 kræftrelaterede dødsfald årligt [1]. Tidligere undersøgelser har vist, at afvigende cellulære stofskifte er et centralt element i tumorigenese og kræft progression [2], [3]. Specielt har omprogrammering af energistofskiftet medtaget som en ny kendetegnende for kræft [4] og unormal energi metabolisme kan påvises i forskellige human cancer, dvs, vil kræftceller omprogrammere deres metabolisme ved stigning i glykolysen i stedet for den mitokondrie oxidative fosforylering at generere celle energi [5]. Vævshypoxi er en afgørende drivkraft fører til cellemetabolisme reprograming [6]. Under hypoxi miljø, er celle glykolyse induceres og fører til stigning celleproliferation og til gengæld danner en ond cirkel af hypoxia-spredning stigende hypoksi, der fremmer celletransformation og cancer progression [7]. På genniveau, hypoxi-inducerbar faktor-1 (HIF-1) er den primære iltfølsomt transskriptionel aktivator og hjælper celler at tilpasse den lave spænding oxygen (hypoxia) [8]. HIF-1 er sammensat af en konstitutivt udtrykt β-underenhed og en hypoxi-inducerbar α-underenheden. Sidstnævnte (HIF-1α) kun stabiliseret under hypoxiske betingelser og regulerer HIF-1 transkriptionel aktivitet [9]. Til dato er HIF-1α vist at aktivere flere målgener, der involverer i væsentlige aspekter af cancer biologi, herunder erythropoiese, angiogenese, glucosemetabolisme, celleproliferation /overlevelse og apoptose [10]. HIF-1α kan interagere med forskellige andre cancer-beslægtede transkriptionsfaktorer (TFS) og danner et kompleks TF-gentranskription tilsynsnetværk under cancerudvikling og progression. Således er en forestilling ikke overraskende rejst, at kræftceller har differentieret og patologiske transkriptionelle mønstre i forhold til normale celler [11]. Tidligere undersøgelser viste opregulering af HIF-1α udtryk i mavekræft væv og celler [12], [13], mens de præcist underliggende reguleringsmekanismer mangler at blive defineret. Således i denne undersøgelse har vi udnyttet Affymatrix Exon Arrays at identificere differentiel genekspression profil i gastrisk cancer væv, og udførte real time PCR og western blot-analyser for at validere dataene. Konstruerede vi yderligere det uregelmæssige TF-gentranskription tilsynsnetværk forbundet med HIF-1α ekspression ved integration af transkriptionel regulatorisk element database (TRED) [14] og genekspression profil ved hjælp cytoscape software. Denne undersøgelse kunne identificere en systematisk gennemgang af de tilknyttede transkriptionelle regulering tilstande relateret med hypoxi og give indsigtsfulde oplysninger til fremtidig biomarkør opdagelse og ny behandling strategi for mavekræft.

Resultater og Diskussion

Profilering af forskelligt udtrykte gener i mavekræft versus normale væv

for at identificere de differentielt udtrykte gener i mavekræft, vi udnyttet de Affymatrix Exon Arrays, der indeholder 17.800 menneskelige gener at profilere fem par mavekræft og normale væv (patienters oplysninger var viste i tabel S1). Vi fandt i alt 2546 differentielt udtrykte gener, hvoraf 2422 var opreguleret og 124 blev nedreguleret (Tabel S2). Specifikt blev HIF-1α signifikant højt udtrykt i gastrisk cancer væv sammenlignet med de hosliggende normale væv (P < 0,01). Vi valideret yderligere microarray data ved at udføre kvantitativ real-time RT-PCR og western blot i en anden 10 par af mavekræft vs. normalt væv (patienternes oplysninger var viste i tabel S1). Den HIF-1α mRNA-ekspression viste 2,55 ± 0,56 fold opregulering i tumorvæv vs. normale dem (p < 0,01); western blot analyse viste en klar adskillelse mellem den relative protein tætheden af ​​HIF-1α i kræft væv (0,41 ± 0,24) vs. normale dem (0,17 ± 0,15) med p < 0,01, kan resultaterne ses i figur 1 og figur S1. Faktisk viste en tidligere undersøgelse, at HIF-1α ubikvitært blev udtrykt i humane og mus væv under hypoxi [15] og i mavekræft væv [12], [13], overekspression af som blev associeret med dårlig prognose af gastrisk kræftpatienter [12 ], [13]. Således har vi yderligere analyseret HIF-1α overekspression-associeret TF'er og deres potentielle målretning gener i mavekræft væv.

Identifikation af HIF-1α overekspression-associeret TF'er og deres potentielle målretning gener i gastrisk kræft væv

for at identificere HIF-1α overekspression-associeret TF'er og deres potentielle målretning gener, transkriptionel regulatorisk element database (TRED) giver et unikt værktøj til at analysere både cis
- og trans
- regulatoriske elementer i pattedyr, som hjælper til bedre at forstå den omfattende gen forordninger og regulatoriske netværk, især på niveau med transkriptionelle forordninger. Således, ved hjælp af integration genekspression profil og lovgivningsmæssige oplysninger fra TRED, vi analyserede HIF-1α og andre fire HIF-1α-relaterede transkriptionsfaktorer (dvs. NFκB1, BRCA1, STAT3, og STAT1), der alle var opreguleret i gastrisk kræft væv og fandt, at de dannede disse regulatoriske netværk TF-gen med 82 gener, 79 som blev opreguleret og 3 blev nedreguleret (tabel S3). Figur 2 viste bi-klynger analyse af disse 82 differentielt udtrykte gener i gastrisk kræft væv versus normale væv.

Efter at databasen for anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID) [16] blev anvendt til funktionel annotation af disse 82 differentielt udtrykte gener. Vi listet de top fire sygdomsområder klasser, der er forbundet med disse 82 afvigende gener (tabel 1) og fandt, at den mest betydningsfulde klasse er kræft med 29 gener, efterfulgt af infektion (18 gener), Hjerte-kar (25 gener) og immun sygdom (26 gener) .

Identifikation af mavekræft-relaterede transkriptionsfaktor-genet (TF-gen) netværk

Baseret på transkriptionel regulerende element database og genekspression profil, vi bygget den transkriptionelle regulatoriske netværk relateret til HIF- 1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 med disse 82 gener i mavekræft væv. Vores data viste, at disse 82 gener kan danne 95 forskellige regulering tilstande (figur 3A) og den detaljerede TF-genregulering modes oplysninger vises i Tabel S4.

For bedre at forstå de lovgivningsmæssige netværk, vi bygget en korte rammerne af netværket (figur 3B). Transkriptionsfaktorer HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 kunne danne ramme for de lovgivningsmæssige netværk, som direkte er reguleret 21, 45, 2, 12, og 10 gener, hhv. NFκB1 blev reguleret direkte af HIF-1α og det var rigtigt, at størstedelen af ​​de lovgivningsmæssige netværk var direkte reguleret af HIF-1α (21/82) og NFκB1 (45/82), de vigtigste regulatorer er forbundet med hypoxi og betændelse i kræft [ ,,,0],17]. Gastrisk cancer er kendetegnet ved vævshypoxi og kronisk inflammation (såsom Helicobacter
pylori-infektion). I vores nuværende undersøgelse, HIF-1α var signifikant opreguleret i gastrisk cancer sammenlignet med de hosliggende normale væv (P < 0,01). Desuden viste vores aktuelle data, at ekspression af mere end 20 gener, der direkte reguleres af HIF-1α ændredes hos gastrisk cancer væv, herunder NFκB1, nøglen regulator molekyle i inflammation og cancer [18] og målretning af NFKB kunne være nyttige i kemoforebyggelse af forskellige menneskelige kræftformer [19].

nedstrøms af de lovgivningsmæssige sti netværk er primært reguleret af STAT3 (12/82) og STAT1 (10/82), medlemmer af signal transducer og aktivator af transskription familie ( stats). STAT'er signalering med Jak er en kanonisk pathway at regulere gener, der er involveret i mange fysiologiske processer ved at overføre signaler fra cellemembranen til kernen [20]. For at regulere parakrin cytokin signalering og ændringer i metastatiske steder, STAT3 har både tumor-indre og ydre virkninger [21]. Målretning Jak-STAT3 signalvejen betragtes som en potentiel terapeutisk strategi, især i forbindelse med tumor inflammation og immunitet [21]. Kontinuerlig deregulering af gener ved vedvarende aktiveret NFKB og STAT3 i tumor mikromiljø er to afgørende aspekter for betændelse og ondartet progression [17]. En tidligere undersøgelse viste en kooperativ virkning af STAT3 og HIF-1α på aktivering af gener under hypoxi miljø i renale celle carcinom-celler [22]. Den specifikke mekanisme Jak-STAT aktivering, især STAT3 i mavekræft skal stadig bestemmes, selv om vores aktuelle data viste signifikant højere niveau af JAK1, STAT3 og STAT1 udtryk i mavekræft væv.

Funktion analyse af navet -genes

en given transskription faktor kan regulere snesevis, hvis ikke hundredvis, af target gener, mens et gen kunne reguleres af flere forskellige TF'er i gen regulatoriske netværk. Således har vi antaget, at hub gener reguleres af flere transkriptionsfaktorer samtidigt i mavekræft, som kan have synergistiske virkninger på menneskers carcinogenese. I den aktuelle undersøgelse, vi identificeret syv gener (herunder MMP1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, og TFF3), der direkte kan reguleres med mindst to centrale transkriptionsfaktorer, de fleste af dem er hub noder, der forbinder med NFκB1 og STAT'er pathway (figur 4). Da transkriptionsfaktorer regulere målgener gennem en transkription-afhang måde at modulere deres mRNA-ekspression, her udført vi QRT-PCR for at undersøge ekspression af TIMP1 og TFF3 mRNA, to målgener af HIF-a Den relative ekspression af TIMP1 og TFF3 mRNA var 1,58 ± 0,25 og 2,16 ± 0,59 fold opreguleret i ti tumor vs. normale væv, henholdsvis (figur 1).

Desuden familien af ​​matrixmetalloproteinaser (MMP'er) er det vigtigste ekstracellulære matrix remodeling enzymer, aktivitet er resultatet af interaktionen mellem tumorceller og tumormikromiljøet og er stramt kontrolleret af transkriptionel aktivering, herunder en kompleks proteolytisk aktiveringskaskade samt endogent system af vævsinhibitorer af metalloproteinaser (TIMP'er) [23]. MMP1 er blevet rapporteret at være involveret i gastrisk cancercelleinvasion [24]. Desuden TLR2 er medlem af toll-lignende receptorer og spiller en fundamental rolle i patogen anerkendelse og aktivering af medfødt immunitet ved aktivering af NFKB. TLR2 kan fungere som en initiator for at give de inficerede eller tilskadekomne celler en ny chance for at udvikle sig til kræftceller og ukontrolleret celledeling [25]. I mellemtiden, Fc-fragmentet af IgG, lavaffinitets IIIa-receptoren (FCGR3A, også kendt som CD16a) tilhører Fc gamma receptorfamilien (FCGR). FCGR3A
polymorfisme var forbundet med modtagelighed for visse autoimmune sygdomme og FCGR3A har en vigtig rolle i at fjerne de immunkomplekser fra kroppen og også deltager i cytotoksiske responser mod tumorceller og smitstoffer [26]. Interferon regulatorisk faktor (IRF) -1 er også en immun aktivt molekyle og inflammatoriske proces regulator, fandtes aktiveringen af ​​IRF-1 og NF-KB, der skal samtidigt aktiveres i melanom [27]. Desuden polymorfier af trefoil-faktor 3 ( TFF3
) promotoren var forbundet med gastrisk cancer modtagelighed [28] og TFF3 blev reguleret af både HIF-1 og NFKB [29]. Overekspression af TFF3 var en uafhængig indikator for samlet overlevelse af mavecancerpatienter [30]. Igen, FAS (også kendt som TNFSF6 /CD95 /Apo-1) tilhører tumornekrosefaktorreceptor superfamilien (medlem 6) og spiller en væsentlig rolle i reguleringen af ​​extrinsic apoptose pathway [31]. Reduceret FAS udtrykkelse var forbundet med øget risiko for cancer ved nedregulering af FAS-medieret apoptose [32]. Men viste vores aktuelle data, et selvmodsigende højt udtryk niveau af FAS i gastrisk kræft væv annonce yderligere undersøgelse er nødvendig for at bekræfte det. Samlet set ændret ekspression af disse gener i gastrisk kræft væv behov for yderligere kontrol som biomarkører for mavekræft diagnose og prognose. Disse gener er afgørende i inflammation og immun relaterede sygdomme, som yderligere kan indikere betydningen af ​​ Helicobacter
pylori infektion i gastrisk udvikling af kræft og progression.

Materialer og metoder

Tissue prøver

i alt 15 mavecancerpatienter blev rekrutteret til kræft og det fjerne normalt væv samling fra det første hospital i Jilin University, Changchun, Kina. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité af College of Basic Medical Sciences, Jilin Universitet, blev hver patient samtykket i et skriftligt informeret samtykke formular. Dataene blev analyseret anonymt. Alle væv blev taget fra kirurgi værelse og lynfrosset og opbevaret i flydende nitrogen inden for 10 minutter efter resektion. TNM og histologiske klassifikation blev udført i henhold til World Health Organization (WHO) kriterier.

RNA isolering og microarray hybridisering og scanning

Tissue RNA blev isoleret ved hjælp Trizol (Invitrogen, CA, USA) og yderligere oprenset ved anvendelse af RNeasy Mini kit (Qiagen, Düsseldorf, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. RNA-koncentrationen blev derefter bestemt ved anvendelse af UV2800 ultraviolet spektrofotometer (UNIC, NY, USA) med A260 /A280 forhold mellem 1.8~2.0 og RNA-koncentrationen blev varierede fra 100 ng /pi til 1 pg /pl.

GeneChip Menneskelig Exon 1.0 ST (Affymetrix, CA, USA) blev anvendt til at profilere differentielt udtrykte gener i gastrisk kræft væv vs. de normale i overensstemmelse med protokollen fra Affymetrix (P /N 900.223). 1 ug RNA-template blev anvendt Kort fortalt til omvendt transkriberet til cDNA og cDNA-prøver blev fordøjet i cDNA-fragmenter med endonukleaser og derefter mærket med reagenset DNA-mærkning, som Affymetrix. Derefter blev de mærkede cDNA-prøver anvendt som prober til hybridisering til arrayet chips ved inkubering ved 45 ° C og roteret ved 60 rpm i 17 timer. Efter vasket og farvet chips efter krydsning blev chips scannet ved hjælp GeneChip Scanner3000 med GeneChip Operating Software (GCOS). Alle instrumenter, chips, og reagenser blev alle købt fra Affymetrix.

Analyse af differentielt udtrykte gener i kræft versus normale væv

GeneChip Operating Software blev anvendt til at analysere de chips og udtrække de rå billeder signal data. Geo datasæt NCBI tiltrædelse antal vores undersøgelse er: GSE56807. Rå signaldata blev derefter indført og analyseret med Limma algoritme til at identificere de differentielt udtrykte gener. De lineære modeller og empiriske Bayes metoder var at analysere data. Dette forhindrede et gen med en meget lille fold ændring fra at blive bedømt som differentielt udtrykt blot på grund af en utilsigtet lille tilbageværende SD. De resulterende P-værdier blev justeret ved hjælp af BH FDR algoritme. Gener blev anset for at være væsentligt forskelligt udtrykt hvis begge FDR værdier var < 0,05 (kontrollere den forventede FDR til højst 5%) og genekspression viste mindst 2-fold ændringer mellem kræft og deres tilsvarende normale væv med Log2FC > 1 eller log2FC < -1, P-værdi < 0.05.

Kvantitativ real-time RT-PCR

For QRT-PCR-analyse, var mindre end 5 ug totalt RNA revers transkriberet til cDNA med 1 ^{st cDNA Synthsis Kit (Takara , Dalian, Kina); ekspression af mRNA for human HIF-1α, TIMP1 og TFF3 blev undersøgt ved QRT-PCR med SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, Kina) og Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR System. Den relative udtryk for mRNA blev normaliseret til p-actin udtryk ved sammenlignende Ct-metoden (2 -ΔΔCt, ACt = Ct _{target-Ct β-actin, ΔΔCt = ACt tumor-ACt normal). Alle primere blev udformet med Primer Premier 6 Software blev primersekvenser til amplifikation anført i tabel 2. Data fra QRT-PCR blev analyseret med GraphPad Prism version 5.0, blev forskellene mellem grupper statistisk evalueret ved prøve en-halet t-test med p værdi < 0,05 betragtes som væsentlig}}

Western blot-analyse

om 1 mm ^{3 af vævsprøver blev poleret med flydende nitrogen og derefter homogeniseret i celle lysis buffer (Beyotime, Kina) i. 4 ° C i 30 minutter, fjernedes celledebris ved centrifugering ved 10000 rpm i 20 min i 4 ° C. Proteinkoncentrationen blev analyseret ved Bradford-proteinassay (Bio-Rad, USA). Hele proteinet blev separeret med 10% SDS-PAGE og derefter overført til en PVDF-membran (0,45 um) i 2 timer. Efter 2 timers blokering med 5% mælk i TBST, inkuberedes membranen med muse-anti-HIF-1α (Santa Cruz, CA, USA) ved 1:200 fortynding og muse-anti-β-actin (Proteintech, USA) ved 1: 2000 fortynding i 4 ° C i 12 timer og efterfulgt af 2 h inkubation med gede-anti-muse-IgG (Proteintech, USA) ved 1:2000 fortynding. Efter vask af TBST, opdaget membranen signaler ved hjælp af forøget kemiluminescens ECL (Beyotime, Kina). Image J software blev anvendt til kvantitativ analyse af HIF-1α signalintensiteter med normaliseret med p-actin niveauer. Data blev analyseret med GraphPad Prism version 5.0, blev forskellene mellem grupper statistisk evalueret ved prøve en-halet t-test med p-værdi < 0,05 betragtes som signifikant}

Konstruktion af transkriptionsfaktor gen netværk baseret på genekspression. profil og transkriptionel regulatorisk element database

transskription faktor (TF) gen-netværk blev konstrueret baseret på genekspression profil og transkriptionel regulatorisk element database (TRED) ved hjælp cytoscape software i henhold til de lovgivningsmæssige interaktion og den differentielle ekspression værdier for hver TF og genet. Nabomatricen af ​​TF'er og gener blev foretaget af relationerne attribut blandt alle gener og TF'er. Den ellipse i TF-gen netværk repræsenterede gener med rød (op-reguleret) og grøn (nedreguleret), trekanter repræsenterer transkriptionsfaktorer. Forholdet mellem TF og deres mål var repræsenteret med pile, pilens retning var fra Kilde til Target.

Analyse af sygdom forbundet gener og gen-pathway annotation

Database for anmærkning, Visualisering og integrerede Discovery (DAVID) funktionel annotation software blev anvendt til at analysere den funktionelle berigelse af afvigende gener. "GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS" mulighed, oplysninger om sygdommen forening berigelse af gen klynger. Vi valgte "GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS" til at identificere sygdommen klasse berigelse og "KEGG_PATHWAY" for sti berigelse med Benjamini metoden bestemmelse af betydelig berigelse score≥1.3.

Støtte oplysninger
figur S1.
Western blot analyse af HIF-1α i 10 par mavekræft og normale væv
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s001
(DOC)
tabel S1.
Patienter data
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s002
(DOC)
tabel S2.
Oversigt over 2546 differentielt udtrykte gener i gastrisk cancer væv sammenlignet med de fjerne normale væv. Gene ekspressionsniveauerne i gastrisk kræft væv vs. de fjerne normale væv var mindst 2 gange anderledes med en p-værdi < 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s003
(XLSX)
tabel S3.
Oversigt over these82 differentielt udtrykte gener i TF-regulatoriske netværk i mavekræft væv
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s004
(XLSX)
Tabel S4.
Den 95 regulering modes dannet af 82 differential gener i TF-gen regulatoriske netværk. Alle regulering oplysninger stammer fra transskriptionel regulatorisk element database (TRED)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s005
(XLSX)

Tak

Vi takker også den Medjaden Bioscience Limited (Hong Kong, Kina) til redigering og korrekturlæsning dette manuskript.

• PLoS ONE: Simulering af Swansons Litteratur-Based Discovery: Anandamide Behandling inhiberer vækst af mavekræft celler in vitro og in Silico
• PLoS ONE: Interleukin 17A Fremmer Gastric Cancer invasiv via NF-KB Mediated matrixmetalloproteinaser 2 og 9 Expression