PLoS ONE: Altered Expression von Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF-1α) und seine regulatorische Gene in Magenkrebsgewebe

Abstrakt

Gewebehypoxie induziert Reprogrammierung des Zellstoffwechsels und kann zu normalen Zelltransformation und Tumorprogression. Hypoxie-induzierbaren Faktor 1-alpha (HIF-1α), der Schlüsseltranskriptionsfaktor spielt eine wichtige Rolle bei der Magenkrebs-Entwicklung und Progression. Diese Studie soll die zugrunde liegenden regulatorischen Signalweg bei Magenkrebs mit Magenkrebs Gewebeproben zu untersuchen. Die Integration von Genexpressionsprofil und Transkriptionsregulationselement-Datenbank (TRED) wurde verfolgt HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 Gen Wege und ihre regulierten Gene zu identifizieren. Die Daten zeigten, dass es 82 waren differentiell exprimierte Gene, die von diesen fünf Transkriptionsfaktoren bei Magenkrebs Gewebe und diese Gene gebildet 95 Regelungsarten geregelt werden könnte, unter denen sieben Gene (MMP1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS und TFF3 ) waren Nabe Moleküle, die gleichzeitig mindestens zwei dieser fünf Transkriptionsfaktoren reguliert werden und wurden mit Hypoxie, Entzündung und Immunstörungen in Verbindung gebracht. Real-Time PCR und Western-Blot zeigte Erhöhung von HIF-1α in mRNA und Protein-Ebene sowie TIMP1, TFF3 in mRNA-Spiegel im Magenkrebsgewebe. Die Daten sind die erste Studie, HIF-1α-regulierte Transkriptionsfaktoren und ihre entsprechenden Netzwerk-Gene in Magenkrebs nachzuweisen. Weitere Studien mit einer größeren Probengröße und funktioneller Experimente ist notwendig, um diese Daten zu bestätigen und dann übersetzen in die klinische Entdeckung von Biomarkern und Behandlungsstrategie für Magenkrebs

Citation:. Wang J, Ni Z, Duan Z, Wang G , Li F (2014) veränderte Expression von Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF-1α) und seine regulatorische Gene in Magenkrebsgewebe. PLoS ONE 9 (6): e99835. doi: 10.1371 /journal.pone.0099835

Editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 10. Januar 2014; Akzeptiert: 19. Mai 2014; Veröffentlicht: 13. Juni 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit teilweise wurde von der National Natural Science Foundation of China (̭20108025 und̬71897), Spezialforschungsfonds für das Doktoratsstudium der Higher Education of China (É10061120093), China Postdoctoral Science Foundation (É10491311 undÉ2T50285) durch Zuschüsse unterstützt, Gründung der Jilin Provincial Health Department (É1Z049), Gründung der Provinz Jilin Abteilung Wissenschaft und Technologie (É30522013JH undÉ40414048GH) und dem Norman Bethune Programm der Universität Jilin (É2219). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt, die jährlich etwa 800.000 Menschen und 65.000 Krebs-Todesfälle betrifft [1]. Frühere Studien haben gezeigt, dass anomale Zellstoffwechsel ist ein wesentliches Merkmal bei der Tumorentstehung und Tumorprogression [2], [3]. Speziell, Neuprogrammierung des Energiestoffwechsels als Schwellen Kennzeichen von Krebs aufgenommen wurde [4] und abnormale Energiestoffwechsel ist in verschiedenen menschlichen Krebs, dh Krebszellen nachweisbar ihre Metabolisierung durch Erhöhung Glykolyse anstelle der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung umprogrammieren Zelle zu erzeugen, Energie [5]. Gewebehypoxie ist eine entscheidende Antriebskraft, was zu Zellmetabolismus reprograming [6]. Unter Hypoxie-Umgebung wird Zelle Glykolyse induziert und führt die Zellproliferation und wiederum zu erhöhen, einen Teufelskreis von Hypoxie-Proliferation steigernde Hypoxie bilden, die Zelltransformation und Tumorprogression fördern [7]. An der Gen-Ebene, Hypoxie-induzierbaren Faktors-1 (HIF-1) ist die primäre sauerstoffempfindlichen Transkriptionsaktivator und hilft Zellen, die die niedrigen Sauerstoffspannung (Hypoxie) [8] anzupassen. HIF-1 ist aus einem konstitutiv exprimierten β-Untereinheit und einer Hypoxie-induzierbaren α-Untereinheit. Letztere (HIF-1α) nur unter hypoxischen Bedingungen stabilisiert und reguliert HIF-1 transkriptionale Aktivität [9]. Bislang HIF-1α gezeigt mehrere Zielgene zu aktivieren, die in entscheidenden Aspekte der Krebsbiologie beinhalten, einschließlich Erythropoese, Angiogenese, Glukosestoffwechsel, Zellproliferation /Überleben und Apoptose [10]. HIF-1α kann mit verschiedenen anderen Krebsbezogenen Transkriptionsfaktoren (TFs) interagieren und eine komplexe TF-Gen-Transkription regulatorische Netzwerk während der Krebsentstehung und Progression bilden. Somit wird eine Konzeption nicht überraschend erhöht, dass Krebszellen haben Differential und pathologische Transkriptionsmuster im Vergleich zu normalen Zellen [11]. Frühere Studien zeigten, Hochregulation von HIF-1α-Expression in Magenkrebs Geweben und Zellen [12], [13], während die eben zugrunde liegenden Regulationsmechanismen definiert werden bleiben. Somit wird in dieser Studie verwendeten wir die Affymatrix Exon Arrays die differentielle Genexpressionsprofil in Magenkrebsgewebe zu identifizieren und durchgeführt Echtzeit-PCR und Western-Blot die Daten zu überprüfen analysiert. Wir konstruierten weiter die aberrant TF-Gen Transkriptionsregulationsnetzwerk assoziiert mit HIF-1α-Expression durch die Integration der Transkriptionsregulationselement Datenbank (TRED) [14] und Genexpressionsprofil unter Verwendung Cytoscape Software. Diese Studie könnte eine systematische Darstellung der zugehörigen Transkriptionsregulation Modi mit Hypoxie und bieten interessante Informationen für zukünftige Entdeckung von Biomarkern und neue Behandlungsstrategie für Magenkrebs im Zusammenhang identifizieren.

Ergebnisse und Diskussion

Profilieren von differentiell exprimierten Genen bei Magenkrebs im Vergleich zu normalen Geweben

die differentiell exprimierten Gene in Magenkrebs zu identifizieren, können wir die Affymatrix Exon Arrays verwendet, die 17.800 menschlichen Gene enthalten fünf Paare von Magenkrebs und normalen Geweben zu profilieren (Patienten Informationen waren in Tabelle S1 gezeigt). Wir fanden insgesamt 2546 differentiell exprimierten Gene, von denen 2422 wurden hochreguliert und 124 wurden herunterreguliert (Tabelle S2). Insbesondere wurde HIF-1α signifikant hoch in Magenkrebs Geweben exprimiert im Vergleich zu den benachbarten normalen Geweben (P < 0,01). Wir validiert weiterhin die Microarray-Daten durch quantitative Echtzeit-RT-PCR und Western-Blot in weiteren 10 Paaren von Magenkrebs durchführen vs. normalen Geweben (Patienten Informationen in Tabelle S1 gezeigt wurden). Die HIF-1α-mRNA-Expression zeigte 2,55 ± 0,56 fache Hochregulation in Tumorgeweben gegen Normalen (p < 0,01); Western-Blot-Analyse zeigte eine klare Trennung zwischen der relativen Proteindichte von HIF-1α in Krebsgewebe (0,41 ± 0,24) vs. Normalen (0,17 ± 0,15) mit p < 0,01, die Ergebnisse können in Abbildung 1 und Abbildung S1 zu sehen. Tatsächlich zeigte eine frühere Studie, dass HIF-1α ubiquitär in der Human- und Mausgeweben unter Hypoxie exprimiert wurde [15] und bei Magenkrebs Gewebe [12], [13], die Überexpression von der mit einer schlechten Prognose von Patienten mit Magenkrebs assoziiert war [12 ], [13]. So haben wir analysiert, weitere HIF-1α Überexpression-assoziierten TFs und deren potenzielle Zielgene in Magenkrebsgewebe.

Identifizierung von HIF-1α-Überexpression-assoziierten TFs und deren potenzielle Zielgene in Magenkrebsgewebe

HIF-1α-Überexpression-assoziierten TFs und ihre potenziellen Zielgene, Transkriptionsregulationselement-Datenbank (TRED) bietet ein einzigartiges Werkzeug identifizieren sowohl zu analysieren cis
- und trans
- regulatorische Elemente bei Säugetieren, hilft, die die umfassende Genregulationen und regulatorische Netzwerke besser zu verstehen, vor allem auf der Ebene der Transkriptions Vorschriften. Damit die Integration Genexpressionsprofil und regulatorische Informationen von TRED mit analysierten wir HIF-1α und vier anderen HIF-1α-bezogenen Transkriptionsfaktoren (dh NFκB1, BRCA1, STAT3 und STAT1), die alle in Magenkrebs hochreguliert waren und Geweben gefunden, dass sie diese TF-Gen regulatorischen Netzwerken mit 82 Genen gebildet, 79 davon wurden hochreguliert und 3 wurden herunterreguliert (Tabelle S3). Abbildung 2 zeigt die bi-Cluster-Analyse dieser 82 differentiell exprimierten Gene in Magenkrebsgewebe im Vergleich zu normalen Geweben.

Danach wird die Datenbank für die Annotation, Visualisierung und integrierten Entdeckung (DAVID) [16] wurde für die funktionelle angewendet Anmerkung dieser 82 differentiell exprimierten Gene. Wir verzeichneten die Top-Klassen vier Krankheit, die mit diesen 82 veränderten Genen (Tabelle 1) und fand zusammen, dass die wichtigste Klasse Krebs durch Infektion (18 Gene), gefolgt mit 29 Genen, Herz-Kreislauf (25 Gene) und Immunkrankheit (26 Gene) .

Identifizierung von Magenkrebs-related transcription factor-Gen (TF-Gen) Netzwerk

Basierend auf Transkriptionsregulationselement Datenbank und Genexpressionsprofil konstruierten wir die Transkriptionsregulations Netzwerk HIF im Zusammenhang 1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 mit diesen 82 Genen in Magenkrebsgewebe. Unsere Daten zeigten, dass diese 82 Gene 95 verschiedene Regelungsarten bilden können (3A) und die detaillierte TF-Genregulation Modi Informationen sind in Tabelle S4 aufgeführt.

Um das regulatorische Netzwerk besser zu verstehen, die wir gebaut ein kurze Rahmen des Netzes (3B). Transkriptionsfaktoren HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → ← STAT3 STAT1 konnten den Rahmen des Regelungsnetzwerk zu bilden, durch die direkt 21 geregelt, 45, 2, 12 und 10 Gene, respectively. NFκB1 wurde direkt von HIF-1α geregelt und es war wahr, dass die Mehrheit des regulatorischen Netzwerkes direkt von HIF-1α geregelt wurden (21/82) und NFκB1 (45/82), die Schlüsselregulatoren mit Hypoxie und Entzündungen bei Krebserkrankungen [ ,,,0],17]. Magenkrebs wird durch Gewebshypoxie und chronische Entzündung (wie Helicobacter-pylori-Infektion
) charakterisiert. In unserem aktuellen Studie, HIF-1α war signifikant in Magenkrebs up-reguliert im Vergleich zu den benachbarten normalen Geweben (P < 0,01). Darüber hinaus zeigten unsere aktuellen Daten, dass die Expression von mehr als 20 Gene, die direkt geregelten von HIF-1α sind in Magenkrebsgewebe verändert, einschließlich NFκB1, der Schlüsselregulator Molekül in Entzündungen und Krebs [18] und von NFKB Targeting nützlich sein könnte, in Chemo-Prävention von verschiedenen Krebserkrankungen des Menschen [19].

die hinter dem Regulationsweg Netzwerk vor allem von STAT3 (12/82) und STAT1 (10/82), die Mitglieder der Signalgeber und Aktivator der Transkription Familie geregelt ( STATs). STATs mit Jak Signalgebung ist eine kanonische Pathway-Gene zu regulieren, die in vielen physiologischen Prozessen durch Signale von der Zellmembran zum Kern übertragen [20] beteiligt sind. Zur Regulierung der parakrine Cytokine Signaling und Veränderungen in Metastasen, STAT3 übt sowohl tumor intrinsische und extrinsische Effekte [21]. Targeting Jak-STAT3-Signalweges wird als eine potenzielle therapeutische Strategie betrachtet, vor allem im Zusammenhang mit der Tumor Entzündung und Immunität [21]. Kontinuierliche Deregulierung von Genen durch anhaltend aktivierte NFkB und STAT3 in Tumor-Mikroumgebung ist zwei entscheidende Aspekte für Entzündungen und malignen Progression [17]. Eine frühere Studie zeigte eine kooperative Wirkung von STAT3 und HIF-1α auf Aktivierung von Genen unter Hypoxie Umgebung in Nierenzellkarzinomzellen [22]. Der spezifische Mechanismus der Jak-STAT-Aktivierung, insbesondere STAT3 bei Magenkrebs noch bestimmt werden, obwohl unsere aktuellen Daten deutlich höhere JAK1-, STAT3 und STAT1-Expression in Magenkrebsgewebe zeigte.

Funktionsanalyse der Nabe -genes

A gegebenen Transkriptionsfaktor Dutzende regulieren kann, wenn nicht Hunderte der Zielgene, während ein Gen durch mehrere verschiedene TFs in genregulatorischen Netzwerken geregelt werden könnte. So gingen wir davon aus, dass Nabe Gene durch mehrere Transkriptionsfaktoren gleichzeitig bei Magenkrebs reguliert wird, die synergistische Effekte auf die menschliche Karzinogenese haben. In der gegenwärtigen Studie identifizierten wir sieben Gene (einschließlich MMP1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS und TFF3), die direkt von zumindest zwei Schlüsseltranskriptionsfaktoren reguliert werden kann, die meisten von ihnen sind Hub-Knoten, die mit NFκB1 Verknüpfung und STATs Weg (Abbildung 4). Da Transkriptionsfaktoren, die Zielgene durch ein Transkriptions-abhing Weise regulieren ihre mRNA-Expression zu modulieren, hier führten wir qRT-PCR die Expression von TIMP1 und TFF3 mRNA, zwei Zielgene von HIF-alpha die relative Expression von TIMP1 und TFF3 mRNA war es zu untersuchen 1,58 ± 0,25 und 2,16 ± 0,59 fach in zehn Tumor vs. normalen Geweben hochreguliert, bzw. (Abbildung 1).

Darüber hinaus ist die Familie der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) die Hauptextrazellulären Matrix Remodeling Enzyme ist, Aktivität davon ist das Ergebnis der Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und Tumor-Mikroumgebung und dicht durch die Transkriptionsaktivierung gesteuert wird, eine komplexe proteolytische Aktivierungskaskade sowie endogene System von Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs) einschließlich [23]. MMP1 wurde berichtet, dass bei Magenkrebs Zellinvasion beteiligt zu sein [24]. Darüber hinaus ist TLR2 Mitglied von Toll-like-Rezeptoren und spielt eine grundlegende Rolle bei der Krankheitserreger Anerkennung und Aktivierung der angeborenen Immunität durch Aktivierung von NFkB. TLR2 kann als Initiator fungieren die infizierte oder verletzte Zellen, eine zweite Chance zu geben, in Krebszellen und unkontrollierte Zellproliferation zu entwickeln [25]. Inzwischen gehört das Fc-Fragment von IgG, mit niedriger Affinität IIIa-Rezeptor (FCGR3A, auch bekannt als CD16a bekannt) an den Fc-gamma-Rezeptor-Familie (FCGR). FCGR3A
Polymorphismus wurde mit Anfälligkeit für bestimmte Autoimmunerkrankungen assoziiert und FCGR3A hat eine wichtige Rolle in der Immunkomplexe aus dem Körper entfernt und beteiligt sich auch an zytotoxischen Antworten gegen Tumorzellen und infektiöse Mittel [26]. Der interferon regulatory factor (IRF) -1 ist auch ein Immun aktives Molekül und Entzündungsprozeßregler, die Aktivierung von IRF-1 und NF &kgr; B wurde festgestellt, gleichzeitig in Melanomen [27] aktiviert werden. Zusätzlich Polymorphismen des Trefoil Factor 3 ( TFF3
) -Promotor mit Magenkrebsanfälligkeit assoziiert waren [28] und TFF3 wurde sowohl HIF-1 reguliert und NFKB [29]. Die Überexpression von TFF3 war ein unabhängiger Indikator für die Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit Magenkrebs [30]. Auch hier (auch bekannt als TNFSF6 /CD95 /APO-1), FAS-Rezeptor-Superfamilie Tumornekrosefaktor gehört (member 6) und spielt bei der Regulierung der extrinsischen Apoptoseweg eine wesentliche Rolle [31]. Reduziert FAS-Expression wurde mit dem erhöhten Risiko von Krebs durch Herunterregulieren der FAS-vermittelte Apoptose [32] verbunden. Aber unsere aktuellen Daten zeigten eine widersprüchliche hohe Expression von FAS im Magenkrebsgewebe ad weitere Untersuchungen notwendig, um es zu bestätigen. Insgesamt muss veränderte Expression dieser Gene in Magenkrebsgewebe eine weitere Überprüfung als Biomarker für Magenkrebs Diagnose und Prognose. Diese Gene sind von entscheidender Bedeutung bei der Entzündung und Immun verwandten Krankheit, die weiter auf die Bedeutung hinweisen kann von Helicobacter-pylori-Infektion
bei Magenkrebs Entwicklung und Progression.

Materialien und Methoden

Tissue Proben

insgesamt wurden 15 Patienten mit Magenkrebs für Krebs und der fernen normalen Gewebesammlung aus dem ersten Krankenhaus der Universität Jilin, Changchun, China rekrutiert. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Hochschule für Medizinische Grundlagenwissenschaften, Universität Jilin genehmigt wurde, wurde jeder Patient in einer schriftlichen Einwilligungserklärung zugestimmt. Die Daten wurden anonym ausgewertet. Alle Gewebe wurden aus Operationssaal und schockgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert innerhalb von 10 Minuten nach der Resektion genommen. Die TNM und histologischen Klassifikation wurden nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) Kriterien.

RNA-Isolierung und Microarray-Hybridisierung und Scannen

Tissue RNA wurde mit Trizol (Invitrogen, CA, USA) isoliert und unter Verwendung des RNeasy Mini Kit (Qiagen, Düsseldorf, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers weiter gereinigt. RNA-Konzentration wurde dann das UV2800 Ultraviolettspektralphotometer bestimmt unter Verwendung von (UNIC, NY, USA) mit A260 /A280-Verhältnis zwischen 1.8~2.0 und RNA-Konzentration wurde aus 100 ng reichten /ul bis 1 ug /ul.

GenChip Menschen Exon 1,0 ST (Affymetrix, CA, USA) wurde nach der von Affymetrix (P /N 900223) bereitgestellt Protokoll differentiell exprimierten Gene in Magenkrebsgewebe gegen die normalen zum Profil verwendet. Kurz gesagt, wurde 1 &mgr; g RNA-Matrize verwendet, um umgekehrt in cDNA transkribiert und cDNA-Proben wurden in cDNA-Fragmente mit Endonukleasen verdaut und dann mit dem DNA-Markierungsreagenz von Affymetrix bereitgestellt gekennzeichnet. Danach wurden die markierten cDNA-Proben als Sonden für 17 h bei 60 rpm auf die Array-Chips durch Inkubation bei 45 ° C und gedreht zu hybridisieren. Nach dem Waschen und die Chips nach der Hybridisierung gefärbt wurden die Chips mit GenChip Scanner3000 mit GenChip Betriebssoftware (GCOS) gescannt. Alle Instrumente, Chips und Reagenzien wurden alle von Affymetrix gekauft.

Analyse von differentiell exprimierten Genen bei Krebs im Vergleich zu normalen Geweben

GenChip Betriebssoftware angewendet wurde, um die Chips zu analysieren und zu extrahieren die Rohbilder Signal Daten. Die GEO Datasets von NCBI-Zugangsnummer unserer Studie ist: GSE56807. Raw Signaldaten wurden dann importiert und mit Limma Algorithmus analysiert die differentiell exprimierten Gene zu identifizieren. Die linearen Modelle und empirische Bayes-Methoden waren die Daten zu analysieren. Dies verhindert ein Gen mit einer sehr kleinen Falte Wechsel von als differentiell nur wegen einer versehentlich kleine Rest SD ausgedrückt beurteilt. Die resultierenden P-Werte wurden unter Verwendung des BH FDR-Algorithmus angepasst. Gene wurden als signifikant unterschiedlich exprimiert werden, wenn beide die FDR Werte war < 0,05 (Steuerung der erwarteten FDR auf nicht mehr als 5%) und die Genexpression mindestens 2-fach Änderungen zwischen Krebs zeigten und ihre entsprechenden normalen Geweben mit Log2FC > 1 oder log2FC < -1, P-Wert < 0,05.

Quantitative real-time RT-PCR

Für qRT-PCR-Analyse weniger als 5 &mgr; g Gesamt-RNA umgekehrt wurde mit 1 ^{st Strang cDNA Synthsis Kit zu cDNA transkribiert (Takara , Dalian, China); die Expression von mRNA für den menschlichen HIF-1α, TIMP1 und TFF3 wurden durch qRT-PCR mit SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, China) und Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR-System untersucht. Die relative Expression von mRNA wurden normalisiert ß-Aktin-Expression durch vergleichende Ct Methode (2 -ΔΔCt, ACt = Ct _{Ziel-Ct β-Actin, ΔΔCt = ACt Tumor-ACt normal). Alle Primer wurden mit Primer Premier 6 Software, Primersequenzen für die Amplifikation in der Tabelle aufgeführt wurden 2. Daten von qRT-PCR mit GraphPad Prism Version analysiert wurden 5,0, Unterschiede zwischen den Gruppen wurden statistisch durch Probe ein-tailed Student-t-Test mit p ausgewertet Wert < 0,05 als signifikant betrachtet}}

Western-Blot-Analyse

Über 1 mm ^{3 von Gewebeproben wurden mit flüssigem Stickstoff poliert dann in Zell-Lyse-Puffer homogenisiert (Beyotime, China) in. 4 ° C für 30 min entfernt, die Zelltrümmer durch bei 10000 Upm für 20 min in 4 ° C zentrifugiert. Die Proteinkonzentration wurde durch Bradford-Protein-Assay (Bio-Rad, USA) analysiert. Das gesamte Protein wurde mit 10% SDS-PAGE aufgetrennt und dann 2 h auf eine PVDF-Membran (0,45 um) übertragen wird. Nach 2 h in TBST mit 5% Milch blockiert, inkubiert, um die Membran mit Maus-anti-HIF-1α (Santa Cruz, CA, USA) bei 1:200 Verdünnung und Maus-anti-β-Actin (Proteintech, USA) bei 1: 2000-Verdünnung in 4 ° C für 12 h und anschließend 2 h mit Ziege Inkubieren anti-Maus-IgG (Proteintech, USA) bei 1:2000 Verdünnung. Nach dem Waschen mit TBST, erfasst die Membran Signale ECL-Verwendung (Beyotime, China). Das Bild J Software wurde für die quantitative Analyse von HIF-1α Signalintensitäten mit normalisierten mit β-Actin-Ebenen angewendet. Die Daten wurden mit GraphPad Prism Version analysiert 5.0 Unterschiede zwischen den Gruppen wurden statistisch durch Probe ein-tailed Student-t-Test mit p-Wert <ausgewertet; 0,05 als signifikant angesehen}

Bau von Transkriptionsfaktor-Gen-Netzwerk basierend auf Genexpression. Profil und Transkriptionsregulationselement Datenbank

der Transkriptionsfaktor (TF) Gen-Netzwerk wurde auf Genexpressionsprofil und Transkriptionsregulationselement-Datenbank (TRED) unter Verwendung von Cytoscape Software entsprechend dem regulatorischen Interaktion und die unterschiedliche Expression Werte jedes TF aufgebaut basierend und Gen. Die Adjazenzmatrix von TFs und Gene wurde durch die Attributbeziehungen zwischen allen Genen und TFs gemacht. Die Ellipse in TF-Gen-Netzwerk repräsentiert Gene mit roten (hochreguliert) und Grün (nach unten reguliert), die Dreiecke Transkriptionsfaktoren darstellt. Die Beziehung zwischen TF und ihre Ziele durch Pfeile dargestellt wurden, Pfeilrichtung war von der Quelle zum Ziel.

Die Analyse der Krankheit assoziierten Gene und Gen Weg Annotation

Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung (DAVID) Funktionsannotation Software wurde angewendet, um die funktionalen Anreicherung von veränderten Genen zu analysieren. "GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS" Option vorgesehen, um die Informationen über die Krankheitsassoziation Anreicherung von Gen-Clustern. Wir wählten "GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS" für Krankheit Klasse Anreicherung zu identifizieren und "KEGG_PATHWAY" für Weg Anreicherung mit Benjamini Methode, um die signifikante Anreicherung score≥1.3 zu bestimmen.

Hintergrundinformationen
Abbildung S1.
Western-Blot-Analyse von HIF-1α in 10 Paare von Magenkrebs und normalen Geweben
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s001
(DOC)
Tabelle S1.
Patienten Daten
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s002
(DOC)
Tabelle S2.
Zusammenfassung der 2546 differentiell exprimierten Gene in Magenkrebsgewebe im Vergleich zu den fernen normalen Geweben. Genexpressionsniveaus in Magenkrebsgewebe im Vergleich zu den weit entfernten normalen Geweben waren mindestens 2-fach anders mit einem p-Wert < 0,05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s003
(XLSX)
Tabelle S3.
Zusammenfassung der these82 differentiell exprimierten Gene in der TF-regulatorisches Netzwerk im Magenkrebsgewebe
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s004
(XLSX)
Tabelle S4. , Die 95 Regelungsarten um 82 differentielle Gene in TF-Genregulationsnetz gebildet. Alle Regelinformation wurde von Transkriptionsregulationselement-Datenbank (TRED) abgeleitet
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s005
(XLSX)

Acknowledgments

Wir danken auch die Medjaden Bioscience Limited (Hong Kong, China) für die Bearbeitung und Korrektur des Manuskripts.

• PLoS ONE: Simulation von Swansons Literatur-basierte Entdeckung: Anandamid Behandlung hemmt das Wachstum von Magenkarzinomzellen in vitro und in Silico
• PLoS ONE: Interleukin 17A fördert Magenkrebs Tumorinvasivität über NF-kappaB Mediated Matrixmetalloproteinasen 2 und 9 Expression