PLOS ONE: Förändrad Expression av hypoxi-inducerbara faktor-1α (HIF-1α) och dess reglerande gener i Gastric Cancer Tissues

Abstrakt

hypoxi inducerar omprogrammering av cellmetabolism och kan resultera i normal celltransformation och cancer progression. Hypoxi-inducerbara faktorn 1-alfa (HIF-1α), nyckeln transkriptionsfaktorn, spelar en viktig roll vid gastrisk cancerutveckling och progression. Denna studie syftade till att undersöka den underliggande reglerande signalväg i magcancer med hjälp av magcancer vävnadsprover. Integrationen av genuttryck profil och transkriptionsregulatoriskt element databas (TRED) fortsatte att identifiera HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 gen vägar och deras reglerade gener. Data visade att det fanns 82 differentiellt uttryckta gener som kan regleras av dessa fem transkriptionsfaktorer i magcancer vävnader och dessa gener bildade 95 reglerlägen, varav sju gener (MMP1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, och TFF3 ) var nav molekyler som regleras åtminstone två av dessa fem transkriptionsfaktorer samtidigt och var förknippade med hypoxi, inflammation och immunstörning. Real-Time PCR och Western blöt visade ökningen av HIF-1α i mRNA och proteinnivåer samt TIMP1, TFF3 i mRNA-nivåer i magcancer vävnader. Uppgifterna är den första studien att visa HIF-1a-reglerade transkriptionsfaktorer och deras motsvarande nätverks gener i magcancer. Det behövs ytterligare studier med en större provstorlek och mer funktionella experiment för att bekräfta dessa uppgifter och sedan översätta till kliniska biomarkörer och behandlingsstrategi för magcancer

Citation. Wang J, Ni Z, Duan Z, Wang G Li F (2014) Förändrad Expression av hypoxi-inducerbara faktor-1α (HIF-1α) och dess reglerande gener i Gastric cancervävnader. PLoS ONE 9 (6): e99835. doi: 10.1371 /journal.pone.0099835

Redaktör: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA

Mottagna: 10 januari, 2014. Accepteras: 19 Maj 2014; Publicerad: 13 juni 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes delvis av anslag från National Natural Science Foundation i Kina (̭20108025 ochQ.271.897), Specialized forskningsfonden Doktorsprogrammet för högre utbildning i Kina (É10061120093), Kina Forskar Science Foundation (É10491311 ochÉ2T50285) Stiftelsen Jilin Provincial Health Department (É1Z049), Stiftelsen för Jilin-provinsen vetenskap och teknik Institutionen (É30522013JH ochÉ40414048GH) och Norman Bethune Program för Jilin University (.012.219). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är den fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen, som drabbar cirka 800.000 personer och 65.000 cancerrelaterade dödsfall årligen [1]. Tidigare studier har visat att avvikande cellulär metabolism är ett viktigt inslag under tumörbildning och cancer progression [2], [3]. Speciellt har omprogrammering av energimetabolism tagits upp som en framväxande kännetecken för cancer [4] och onormal energiomsättning kan detekteras i olika mänskliga cancer, det vill säga, kommer cancerceller programmera deras ämnesomsättning genom ökad glykolys i stället för den mitokondriella oxidativ fosforylering att generera cell energi [5]. Vävnadshypoxi är en avgörande drivkraft som leder till cellmetabolism reprograming [6]. Under hypoxi miljö, är cell glykolys induceras och leder till ökad celltillväxt och i sin tur bildar en ond cirkel av hypoxi-spridning ökande hypoxi som främjar celltransformation och cancer progression [7]. På gennivå är hypoxi-inducerbara faktorn-1 (HIF-1) den primära syrekänsliga transkriptionsaktivator och hjälper cellerna att anpassa den låga syrgastryck (hypoxi) [8]. HIF-1 är sammansatt av en konstitutivt uttryckt β-subenheten och en hypoxi-inducerbar α-subenheten. Den senare (HIF-1α) är endast stabiliseras under hypoxiska betingelser och reglerar HIF-1 transkriptionsaktivitet [9]. Hittills är HIF-1α visat sig aktivera flera målgener som involverar i viktiga aspekter av cancerbiologi, inklusive erytropoes angiogenes, glukosmetabolism, celltillväxt /överlevnad och apoptos [10]. HIF-1α kan interagera med olika andra cancerrelaterade transkriptionsfaktorer (TF) och bildar en komplex TF-gentranskription reglerande nätverk under cancerutveckling och progression. Således är en föreställning inte överraskande höjt att cancerceller har differential och patologiska transkriptionsmönster jämfört med normala celler [11]. Tidigare studier visade uppreglering av HIF-1α uttryck i magcancer vävnader och celler [12], [13], medan exakt underliggande regleringsmekanismer återstår att fastställa. Således, i denna studie, vi utnyttjade Affymatrix Exon matriser för att identifiera differential genuttryck profil i magcancer vävnader, och utförde realtids-PCR och Western blot analyser för att validera data. Vi konstruerade ytterligare det avvikande TF-gentranskription reglerande nätverk associerat med HIF-1α-expression genom integrering av transkriptionsregulatoriskt element databas (TRED) [14] och genuttryck profil med hjälp cytoscape programvara. Denna studie kunde identifiera en systematisk genomgång av de associerade transkriptionsreglering lägen i samband med hypoxi och ger värdefull information för framtida biomarkörer och ny behandlingsstrategi för magsäckscancer.

Resultat och Diskussion

Profilering av differentiellt uttryckta gener i magcancer kontra normala vävnader

för att identifiera de differentiellt uttryckta generna i magcancer, vi utnyttjade Affymatrix Exon arrayer som innehåller 17.800 mänskliga gener att profilera fem par magcancer och normala vävnader (patienternas uppgifter var visade i tabell S1). Vi hittade totalt 2546 differentiellt uttryckta gener, varav 2422 var upp-reglerade och 124 var ned-reglerade (Tabell S2). Specifikt HIF-1α avsevärt mycket uttryckt i magcancer vävnader jämfört med närliggande normala vävnader (P < 0,01). Vi validerade vidare microarray uppgifter genom att utföra kvantitativ realtids-RT-PCR och Western blöt i ytterligare 10 par magcancer kontra normala vävnader (patienternas uppgifter var visade i tabell S1). HIF-1α mRNA-uttryck visade 2,55 ± 0,56 vika uppreglering i tumörvävnad jämfört med normala ettor (p < 0,01); Western blot-analys visade en tydlig åtskillnad mellan den relativa protein densitet HIF-1α i cancervävnader (0,41 ± 0,24) jämfört med normala ettor (0,17 ± 0,15) med p < 0,01, kan resultatet ses i figur 1 och figur S1. I själva verket visade en tidigare studie som HIF-1α ubiquitously uttrycktes i humana och mus vävnader enligt hypoxi [15] och i magcancer vävnader [12], [13], överuttryck av som var förknippad med dålig prognos för patienter med ventrikelcancer [12 ], [13]. Därför analyserade vi ytterligare HIF-1α uttryck associerade TF och deras potentiella inriktnings gener i magcancer vävnader.

Identifiering av HIF-1α uttryck associerade TF och deras potentiella inriktnings gener i magcancer vävnader

för att identifiera HIF-1α uttryck associerade TF och deras potentiella inriktnings gener, transkriptionsregulatoriskt element databas (TRED) ger ett unikt verktyg för att analysera både cis
- och trans
- regulatoriska element hos däggdjur, vilket bidrar till att bättre förstå de omfattande gen regler och regleringsnätverk, särskilt på nivån för transkriptions regler. Således, med hjälp av integration genuttryck profil och reglerande information från TRED, analyserade vi HIF-1α och andra fyra HIF-1α-relaterade transkriptionsfaktorer (dvs NFκB1, BRCA1, STAT3 och STAT1) som var alla upp-regleras i magcancer vävnader och fann att de bildade dessa TF-gen reglerande nätverk med 82 gener, varav 79 var upp-reglerade och 3 nedregleras (Tabell S3). Figur 2 visar den dubbelkluster analys av dessa 82 differentiellt uttryckta gener i magcancer vävnader kontra normala vävnader.

Efter att databasen för Notering, visualisering och integrerade Discovery (David) [16] tillämpades för funktionell annotering av dessa 82 differentiellt uttryckta gener. Vi listade topp fyra sjukdomsklasser som är förknippade med dessa 82 avvikande gener (tabell 1) och fann att den mest signifikanta klassen är cancer med 29 gener följt av infektion (18 gener), Cardiovascular (25 gener) och immunsjukdom (26 gener) .

Identifiering av magcancer relaterade transkriptionsfaktorgenen (TF-gen) nätverk

Baserat på transkriptionsregulatoriskt element databas och genuttryck profil, konstruerade vi transkriptionsreglerande nätverk i samband med HIF- 1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 med dessa 82 gener i magcancer vävnader. Våra data visar att dessa 82 gener kan bilda 95 olika reglerlägen (figur 3a) och den detaljerade TF-genreglering lägen listas i tabell S4.

För att bättre förstå den rättsliga nätverket, byggde vi en kortfattad ramen för nätverket (figur 3B). Transkriptionsfaktorer HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 kunde bilda ramen för det föreskrivande nätverk genom vilka direkt regleras 21, 45, 2, 12 och 10 gener, respektive. NFκB1 direkt regleras av HIF-1α och det var sant att majoriteten av regleringsnätet var direkt regleras av HIF-1α (21/82) och NFκB1 (45/82), de viktigaste regulatorerna kopplade till hypoxi och inflammation i cancer [ ,,,0],17]. Magsäckscancer kännetecknas av hypoxi och kronisk inflammation (t.ex. Helicobacter
pylori-infektion). I vår aktuella studien, HIF-1α var signifikant uppreglerat i magcancer jämfört med de närliggande normala vävnader (P < 0,01). Dessutom vår nuvarande data visade att uttryck av mer än 20 gener som direkt regleras av HIF-1α ändrades i magcancer vävnader, däribland NFκB1, nyckeln regulator molekylen i inflammation och cancer [18] och inriktning av NFkB kan vara användbara i kemoprevention av olika humana cancerformer [19].

nedströms regleringsvägen nätet regleras huvudsakligen av STAT3 (12/82) och STAT1 (10/82), medlemmar av signalomvandlare och aktivator av transkription familj ( Stats). Stats signal med Jak är en kanonisk reaktionsväg för att reglera gener som är involverade i många fysiologiska processer genom att överföra signaler från cellmembranet till kärnan [20]. För att reglera parakrina cytokinsignalering och förändringar i metastaser, utövar STAT3 både tumör inre och yttre effekter [21]. Inriktning Jak-STAT3 signalväg betraktas som en potentiell terapeutisk strategi, särskilt i samband med tumör inflammation och immunitet [21]. Kontinuerlig avreglering av gener genom ständigt aktiverad NFkB och STAT3 i tumörmikro är två viktiga aspekter för inflammation och malign progression [17]. En tidigare studie visade en samverkande effekt av STAT3 och HIF-1α vid aktivering av gener under hypoxi miljö njurcellscancerceller [22]. Den specifika mekanism för Jak-STAT aktivering förblir särskilt STAT3 i magcancer som skall fastställas, även om våra aktuella data visade signifikant högre JAK1, STAT3 och STAT1 uttryck i magcancer vävnader.

Funktion analys av navet -genes

En given transkriptionsfaktor kan reglera dussintals, om inte hundratals, av målgener, medan en gen kan regleras av flera olika TF i gen regleringsnätverk. Därför antog vi att nav gener regleras av flera transkriptionsfaktorer samtidigt i magcancer, som kan ha synergistiska effekter på människors cancer. I den aktuella studien har vi identifierat sju gener (inklusive MMP1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, och TFF3) som direkt kan regleras av åtminstone två viktiga transkriptionsfaktorer, de flesta av dem är hubnoder som förbinder med NFκB1 och STATS vägen (fig 4). Eftersom transkriptionsfaktorer reglerar målgener genom en transkriptions beroende sätt att modulera deras mRNA-uttryck, här genomförde vi QRT-PCR för att undersöka uttryck av TIMP1 och TFF3 mRNA, två målgener av HIF-a Den relativa uttrycket av TIMP1 och TFF3 mRNA 1,58 ± 0,25 och 2,16 ± 0,59 vik upp-regleras i tio tumör jämfört med normala vävnader, respektive (Figur 1).

Dessutom är familjen matrismetalloproteinaser (MMP) huvud extracellulärmatrix ombyggnad enzymer, aktivitet som är ett resultat av interaktionen mellan tumörceller och tumörmikroomgivningen och är hårt kontrollerad av transkriptionell aktivering, inklusive en komplex proteolytisk aktiveringskaskad samt endogent system av vävnadshämmare av metalloproteinaser (TIMP) [23]. MMP1 har rapporterats vara inblandad i magcancer cellinvasion [24]. Dessutom är TLR2 medlem av avgifts liknande receptorer och spelar en viktig roll i patogen erkännande och aktivering av medfödd immunitet genom aktivering av NFkB. TLR2 kan fungera som en initiator för att ge de infekterade eller skadade celler en andra chans att utvecklas till cancerceller och okontrollerad celltillväxt [25]. Samtidigt tillhör Fc-fragmentet av IgG, låg affinitet IIIa-receptorn (FCGR3A, även känd som CD16a) till Fc-gamma-receptorfamiljen (FCGR). FCGR3A
polymorfism var associerad med känslighet för vissa autoimmuna sjukdomar och FCGR3A har en viktig roll i att ta bort immunkomplexen från kroppen och deltar även i cytotoxiska svar mot tumörceller och infektiösa medel [26]. Interferon reglerande faktor (IRF) -1 är också ett immun aktiv molekyl och inflammatorisk processregulatorn ades aktivering av IRF-1 och NF-kB visade sig vara samtidigt aktiveras i melanom [27]. Dessutom polymorfismer av trebladingen faktor 3 ( TFF3
) promotorn var associerade med gastrisk cancerbenägenhet [28] och TFF3 reglerades genom både HIF-1 och NFkB [29]. Överuttryck av TFF3 var en oberoende indikator för total överlevnad av patienter med ventrikelcancer [30]. Återigen, FAS (även känd som TNFSF6 /CD95 /APO-1) tillhör tumor necrosis factor receptor super (medlem 6) och spelar en viktig roll i regleringen av yttre apoptos väg [31]. Minskad FAS uttryck i samband med den ökade risken för cancer genom nedreglering av FAS-medierad apoptos [32]. Det krävs dock, våra nuvarande data visade ett motsägelsefullt hög uttrycksnivå av FAS i magcancer vävnader ad ytterligare studier för att bekräfta det. Sammantaget förändrat uttryck av dessa gener i magcancer vävnader behöver ytterligare kontroll som biomarkörer för magcancer diagnos och prognos. Dessa gener är avgörande för inflammation och immunrelaterad sjukdom, vilket ytterligare kan indikera vikten av Helicobacter
pylori-infektion i magcancer utveckling och progression.

Material och metoder

Tissue exemplar

totalt 15 gastric cancerpatienter rekryterades för cancer och avlägsna normal vävnad samling från det första sjukhuset i Jilin University, Changchun, Kina. Studien godkändes av den etiska kommittén i College of Grundläggande medicinska vetenskaper, Jilin University, varje patient samtyckt i ett skriftligt informerat samtycke formulär. Data analyserades anonymt. Alla vävnader togs från kirurgi rummet och snabbfrystes och lagrades i flytande kväve inom 10 minuter efter resektion. TNM och histologiska klassificering utfördes enligt Världshälsoorganisationen (WHO) kriterier.

RNA isolering och microarray-hybridisering och skanning

Tissue RNA isolerades med användning av Trizol (Invitrogen, CA, USA) och renas ytterligare med hjälp av RNeasy Mini kit (Qiagen, Düsseldorf, Tyskland) i enlighet med tillverkarens instruktioner. RNA-koncentration bestämdes sedan med användning av UV2800 UV-spektrofotometer (UNIC, NY, USA) med A260 /A280-förhållande mellan 1.8~2.0 och RNA-koncentrationen varierade från 100 ng /| j, l till 1 mikrogram /l.

Genechip Human exon 1,0 ST (Affymetrix, CA, USA) användes för att profilera differentiellt uttryckta gener i magcancer vävnader kontra de normala enligt protokollet från Affymetrix (P /N 900.223). I korthet var 1 ng RNA-mall som används för att omvänt transkriberas till cDNA och cDNA prover rötas till cDNA-fragment med endonukleaser och sedan märkt med DNA märkningsreagens som tillhandahålls av Affymetrix. Efter det, var de märkta cDNA-prover användes som prober för att hybridisera till de arraychippen genom inkubation vid 45 ° C och roterades med 60 rpm under 17 timmar. Efter tvättas och färgas marker efter hybridisering var markerna skannas med hjälp av Genechip Scanner3000 med Genechip Operating Software (GCOS). Alla instrument, chips och reagens var alla köptes från Affymetrix.

Analys av differentiellt uttryckta gener i cancer jämfört med normala vävnader

Genechip Operating Software tillämpats för att analysera chips och extrahera råbilder signal data. Geo datamängder NCBI anslutning antalet vår studie är: GSE56807. Råsignaldata sedan importeras och analyseras med limma algoritm för att identifiera differentiellt uttryckta gener. De linjära modeller och empiriska Bayes metoderna var att analysera data. Detta hindrade en gen med en mycket liten faldig förändring från att bedömas som differentiellt uttryckt bara på grund av en oavsiktlig liten rest SD. De resulterande P-värden justerades med hjälp av BH FDR algoritmen. Gener ansågs vara signifikant differentiellt uttryckt om båda FDR värdena var < 0,05 (styr förväntas FDR till högst 5%) och genuttryck visade åtminstone två-faldiga förändringar mellan cancer och deras motsvarande normala vävnader med Log2FC > 1 eller log2FC < -1, P-värde < 0,05.

Kvantitativ realtids-RT-PCR

För QRT-PCR-analys, var mindre än 5 | j, g totalt RNA transkriberades omvänt till cDNA med en ^{st sträng-cDNA Synthsis Kit (Takara , Dalian, Kina); uttrycket av mRNA för humant HIF-1α, TIMP1 och TFF3 undersöktes av QRT-PCR med SYBR förblandning Ex Taq (Takara, Dalian, Kina) och Applied Biosystems 7300 Snabb realtids-PCR System. Den relativa uttrycket av mRNA normaliserades till p-aktin uttryck genom jämförande Ct-metoden (2 -ΔΔCt, ΔCt = Ct _{mål-Ct β-aktin, ΔΔCt = ΔCt tumör ΔCt normal). Alla primers utformades med Primer Premier 6 Software har primersekvenser för förstärkning listade i Tabell 2. Data från QRT-PCR analyserades med GraphPad Prism version 5.0, var skillnaderna mellan grupperna statistiskt utvärderas av prov ensidigt t-test med p värde < 0,05 betraktas som betydande}}

Western blot-analys

om en mm ^{3 av vävnadsprover polerades med flytande kväve homogeniseras därefter i cellysbuffert (Beyotime, Kina) i. 4 ° C under 30 min, avlägsnades celldebris genom centrifugering vid 10000 rpm under 20 min i 4 ° C. Proteinkoncentrationen analyserades med Bradford-proteinanalys (Bio-Rad, USA). Hela proteinet separerades med 10% SDS-PAGE och överfördes sedan till ett PVDF-membran (0,45 | im) under 2 timmar. Efter 2 h av blockering med 5% mjölk i TBST, inkuberades membranet med mus-anti-HIF-1α (Santa Cruz, CA, USA) vid 1:200 utspädning och mus-anti-β-aktin (proteintech, USA) vid 1: 2000 spädning i 4 ° C i 12 h och följt av 2 h inkubering med get-anti-mus-IgG (proteintech, USA) vid 1:2000 utspädning. Efter tvättning av TBST upptäckte membran signaler med hjälp av förstärkt kemiluminescens ECL (Beyotime, Kina). Image J programvara tillämpades för kvantitativ analys av HIF-1α signalintensitet med normaliserad med p-aktin nivåer. Data analyserades med GraphPad Prism version 5.0, var skillnaderna mellan grupperna statistiskt utvärderas av prov ensidigt t-test med p-värde < 0,05 betraktas som betydande}

Konstruktion av transkriptionsfaktorgenen nät baserat på genuttryck. profil och transkriptionsregulatoriskt element databas

Transkription faktor (TF) genen nätverk konstruerades baserat på genuttryck profil och transkriptionsregulatoriskt element databas (TRED) med hjälp av cytoscape programvara enligt det föreskrivande interaktion och det differentiella uttrycket värdena för varje TF och genen. Den grannmatris av TF och gener gjordes av attribut relationer mellan alla gener och TF. Ellipsen i TF-gen nätverk representerade gener med röd (upp-reglerade) och grön (nedregleras), trianglarna representerar transkriptionsfaktorer. Förhållandet mellan TF och deras mål var representerade av pilar, pilens riktning var från källan till målet.

Analys av sjukdomsassocierade gener och gen väg anteckning

Databas för Notering, visualisering och integrerade Discovery (David) funktionell anteckning mjukvara tillämpas för att analysera den funktionella anrikning av avvikande gener. "GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS" alternativet, förutsatt att information om sjukdomen förening anrikning av genkluster. Vi valde "GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS" för att identifiera sjukdomsklass anrikning och "KEGG_PATHWAY" för väg berikning med Benja metod att fastställa betydande anrikning score≥1.3.

Bakgrundsinformation
figur S1.
Western blot-analys av HIF-1α i 10 par magcancer och normala vävnader
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s001
(DOC) Review tabell S1.
Patienter uppgifter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s002
(DOC) Review tabell S2.
Sammanfattning av 2546 differentiellt uttryckta gener i gastric cancervävnader jämfört med de avlägsna normala vävnader. Genuttryck nivåer i magcancer vävnader jämfört avlägsna normala vävnader var åtminstone två gånger annorlunda med ett p-värde < 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s003
(XLSX)
Tabell S3.
Sammanfattning av these82 differentiellt uttryckta gener i TF reglerande nätverk i magcancer vävnader
doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s004
(XLSX) Review tabell S4. sälja The 95 reglerlägen som bildas av 82 differential gener i TF-gen reglerande nätverk. All information förordningen härrör från transkriptionsregulatoriskt element databas (TRED) Review doi:. 10,1371 /journal.pone.0099835.s005
(XLSX) Review

Tack till

Vi tackar också den Medjaden Bioscience Limited (Hongkong, Kina) för redigering och korrekturläsning detta manuskript.

• PLOS ONE: Simulering av Swansons litteratur Discovery: Anandamide hämmar tillväxten av Gastric cancerceller in vitro och in silico
• PLOS ONE: Interleukin 17A Främjar Gastric Cancer invasions via NF-kB medierade matrismetalloproteinaser 2 och 9 Expression