PLoS ONE: Helicobacter pylori Fördert Epithelial-mesenchymale Transition in Magenkrebs durch Herunterregulieren Programmierter Zelltod Protein 4 (Pdcd4)

Abstrakt

Helicobacter pylori
, eine Gram-negative, microaerophilic Bakterium im Magen gefunden wird, wird davon ausgegangen, mit der Karzinogenese, Invasion und Metastasierung in Erkrankungen des Verdauungssystems verbunden zu sein. Cytotoxin-assoziierte Gen A (CagA) ist ein onkogenen Protein von H. pylori
, die zur Entwicklung von Magenkrebs im Zusammenhang mit einer Cag Pathogenitätsinsel codiert wird. Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist die wichtigste biologische Ereignis in Invasion oder Metastasierung von Epithelzellen. H. pylori
kann EMT in menschlichen Magenkrebszelllinien zu fördern, aber die spezifischen Mechanismen sind noch unklar. Wir untersuchten die zugrunde liegenden molekularen Mechanismus der EMT induziert durch H. pylori
bei Magenkrebs CagA. In unserem Artikel entdeckten wir Magenkrebs Proben und benachbarten nicht kanzerösen Proben durch Immunhistochemie und fanden eine erhöhte Expression des EMT-bezogenen regulatorisches Protein TWIST1 und mesenchymalen Marker Vimentin in Krebsgeweben, während programmierten Zelltod Faktor 4 (Pdcd4) und der epithelialen Marker E-Cadherin-Expression verringerte sich in Krebsproben. Diese Veränderungen waren mit dem Grad der Malignität assoziiert Gewebe. Zusätzlich wurden Pdcd4 und TWIST1 Ebenen zusammen. In Magenkrebszellen cokultiviert mit CagA-Expressionsplasmid, aktiviert CagA TWIST1 und Vimentinexpression und gehemmt E-Cadherin-Expression durch Pdcd4 Herunterregulieren. CagA förderte auch die Mobilität von Magenkrebszellen durch Pdcd4 regulieren. So H. pylori
CagA induzierte EMT in Zellen Magenkrebs, die bei Magenkrebs-Zelllinien einen neuen Signalweg von EMT zeigt

Citation:. Yu H, Zeng J, Liang X, Wang W, Zhou Y, Sun Y, et al. (2014) Helicobacter pylori
Fördert Epithelial-mesenchymale Transition in Magenkrebs durch Herunterregulieren Programmierter Zelltod Protein 4 (Pdcd4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10.1371 /journal.pone.0105306

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama in Birmingham, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 12. Februar 2014; Akzeptiert: 21. Juli 2014; Veröffentlicht: 21. August 2014

Copyright: © 2014 Yu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit von der nationalen Grundlagenforschung Programm von China unterstützt wurde (kein 973-Programm 2012CB911202.), der National Natural Science Foundation of China (Nr: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 und 81170514), der Medizinischen Wissenschaft und Technologie Development Program von Shandong (kein 2013WS0209.) und der unabhängige Innovationsstiftung der Shandong-Universität (Nr. 2012TS106). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Helicobacter pylori
( H. pylori
) ist eine wendelförmige, Gram-negative Bakterium mit Erkrankungen des Verdauungssystems verbunden sind, einschließlich chronische Gastritis, Magengeschwür, Magenkrebs, und Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe-Lymphom. H. pylori
hat als Karzinogen von der Weltgesundheitsorganisation und der Internationalen Agentur für Krebsforschung (WHO /IARC) im Jahr 1994 eingestuft worden [1], [2].

H. pylori
Gene besitzen ein Cytotoxin-assoziierte Gen A (CagA) Pathogenität Insel, die die großen Virulenz Protein CagA und eine Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) kodiert. CagA wird geliefert Zellen durch T4SS Gastgeber und induziert Krebsentstehung und Progression [3]. H. pylori
kann die Zellproliferation zu deregulieren, den normalen apoptotischen Weg, Einfluss Zellform beeinflussen, junctional Aktivität abschaffen und eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) Phänotyp erleichtern, nachdem es der Wirtszelle transloziert in [4], [5]. Die H. pylori
Effektor-Protein CagA betrifft die meisten dieser Wege. In vivo
Experimente zeigten, dass transgene Expression CagA multiple Malignitäten in Mäusen verursachen könnte, einschließlich Magen-epitheliale Hyperplasie, myeloischer Leukämie und B-Zell-Lymphomen oder Magenpolypen und Adenokarzinomen des Magens und des Dünndarms [6]. Jedoch ist der molekulare Mechanismus der H. pylori
CagA auf Wirtszellen interagieren, ist noch unklar.

Die EMT zunächst als Merkmal der Embryonalentwicklung ein lebenswichtiger Vorgang für die Morphogenese während der embryonalen und Herzentwicklung erkannt wurde. Jedoch ist es trägt auch zur Gewebefibrose, Tumorinvasion und Metastasierung. EMT wird durch mehrere verschiedene Merkmale, wie Verlust der Zelladhäsion, erhöhte Zellmobilität, Resistenz gegen Apoptose, und einige Eigenschaften von Stammzellen aus. Mit EMT, epithelialen Marker wie E-Cadherin zeigen verminderte Expression und mesenchymalen Marker wie Vimentin zeigen eine erhöhte Expression. Andere regulatorische Moleküle wie SCHNECKE, TWIST und SLUG Show verändert Ausdruck [7], [8], [9]. Onkogene Wege, die die EMT induzieren können, umfassen Wachstumsfaktor β Transformation (TGF-β), Src, Ets, Ras, Wnt /β-Catenin, Notch, nuclear factor-kappaB und Integrin [10], [11], [12].

die Infektion mit dem humanen pathogenen Faktor H. pylori
wird angenommen, EMT, Invasion oder Metastasen von Magenkrebs führen. Zum Beispiel Hochregulation von Matrix-Metalloproteinase-7 durch pathogene H. pylori
Gastrin teilweise abhängt und eine Funktion bei der Entwicklung von Magenkrebs haben können, möglicherweise durch die EMT, durch indirektes induzierende Niveaus von löslichem Heparin-bindenden endothelialen Wachstumsfaktor [13]. H. pylori
CagA wird von deregulieren c-Met-Rezeptor in Invasion von Tumorzellen beteiligt Signalisierung [14]. Wie gut, um die Aktivierung des Wnt /β-Catenin-Signalweg erhöhen durch Aufbrechen der Stabilisierung des E-Cadherin-β-Catenin-Komplexes CagA könnte. Somit spielt CagA eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der intestinalen Metaplasie [15]. Darüber hinaus schlug Microarray-Analyse, dass die Phosphorylierung von CagA die Expression von EMT-verwandten Genen in Magenkrebszellen beeinflussen können [16]. Jedoch wenig über die Mechanismen bekannt, die die EMT induziert durch CagA zugrunde liegen.

Programmierter Zelltod protein 4 (Pdcd4) in proliferierenden Zellen in den Zellkern lokalisiert [17]. Als wichtiger posttranskriptionales Ziel von microRNA (miR) miR-21, ist Pdcd4 bis zur Tumorprogression und Prognose in der menschlichen Lunge, Dickdarm-, Brust- und Magenkrebs im Zusammenhang mit [18], [19]. Der Tumorsuppressor Pdcd4 kann eIF4A oder eIF4G binden und Translation hemmen. Pdcd4 kann Mitogen-aktivierte Protein-Kinase 4 1 oder Urokinase-Plasminogen-Aktivator-Rezeptor (uPAR) Expression regulieren Karzinom Invasion und intravasation [20], [21] hemmen. Pdcd4 könnte auch Einfluss auf die Transkription von Genen. Es interagiert mit der DNA-Bindungsdomäne von TWIST1 und hemmt die Y-Box-Protein 1-Expression Bindung [22]. Wie gut, Verlust von Pdcd4 Expression mit malignen Transformation in Magenkrebs assoziiert [23], [24]. Das Herunterregulieren von Pdcd4 ist in Verdauungskanalgeschwülsten zur Tumor-Differenzierung im Zusammenhang mit [25]. Doch ob Pdcd4 in der EMT von CagA in Magenkrebs und den speziellen Mechanismus noch weiteren Erläuterung bedürfen induziert beteiligt ist.

Hier erkundeten wir die Regulation der EMT-assoziierten Proteinen und Pdcd4 Expression in Magenkrebsgewebe und CagA Aktivierung von TWIST1 Expression und Hemmung von E-Cadherin und Pdcd4 Expression in Magenkrebszellen.

Materialien und Methoden

Patienten und Gewebeproben

die Studie wurde von der Ethik genehmigt wurde Ausschuss der Shandong University School of Medicine, und alle Proben und Informationen wurden mit schriftlicher Einwilligung gesammelt. Magentumorgewebe und ihre ausgeglichenen Nicht-Krebsgewebe wurden von 30 Patienten während der Operation bei Qilu Hospital, Shandong University (Jinan, China) geerntet von 2010 bis 2012. Keiner der Patienten hatte eine adjuvante Chemotherapie oder Strahlentherapie vor der Operation erhalten. Diagnose von Magenkrebs wurde histologisch durch Hämatoxylin und Eosin-Färbung bestätigt.

Zellkultur und Transfektion

Humankrebs Magen-Zelllinien (AGS, BGC-823 und SGC-7901) von der China erhalten Academia Sinica Handy Repository (Shanghai). Zellen wurden in der empfohlenen Medien und einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO _{2 bei 37 ° C ohne Antibiotika inkubiert. SGC-7901-Zellen und HGF-823-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, und AGS-Zellen wurden in F12-Medium mit 10% FBS ergänzt. Medien und FBS wurden von Invitrogen (USA) erworben. Dann wurden die Zellen transient mit Plasmiden pCDNA3.1 oder pCDNA3.1-CagA (ein Geschenk von Dr. Yongliang Zhu, Zhejiang University, China) und pEGFP-C1 oder pEGFP-C1-Pdcd4 (gebaut und zur Verfügung gestellt von Dr. Youhai Chen , Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) unter Verwendung von X-treme GENE HP Transfektionsreagenz (Roche Diagnostics, Deutschland) gemäß den Angaben des Herstellers Protokolle.}

RNA-Isolierung, reverse Transkription und qRT-PCR

Gesamt-RNA wurde aus Zellen unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen, USA) extrahiert. Die reverse Transkription beteiligt die Hochgestellte III First Strand Synthesis Kit (Invitrogen). Die Expression von Genen wurde durch die Verwendung von Quantitative real-time PCR SYBR Premix Ex Taq (Takara, China) erkannt und Normalisierung ging es um die 2 ^{- △△ ct Methode relativ zu ß-Aktin. Primersequenzen waren für Pdcd4, Sinn 5'-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 'und Antisense, 5'-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3'; E-Cadherin, Sinn 5'-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 'und Antisense, 5'-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3'; CagA, Sinn 5'-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 'und Antisense, 5'-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3'; und TWIST1, Sinn, 5'-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 'und Antisense, 5'-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3'; Vimentin, Sinn 5'-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 'und Antisense, 5'-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3'; SNAIL, Sinn, 5'-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 'und Antisense, 5'-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3'; β-Actin, Sinn 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 'und Antisense, 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'.}

Western blot analysis

Protein wurde aus den Proben extrahiert und durch SDS-PAGE , dann auf PVDF-Membranen (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) überführt, die sofort mit 5% Magermilch in TBST blockiert, das 1% Tween-20 für 1,5 h bei Raumtemperatur. Nach 3-mal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen wurden die Membranen mit Antikörpern gegen Pdcd4 inkubiert (1:500; Cell Signaling Technology, USA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, USA), SNAIL (1:1000 , Cell Signaling Technology, USA), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-Cadherin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA), Vimentin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA ) und β-Aktin (1:2000, Sigma-Aldrich, USA), als Normalisierungskontrolle, über Nacht bei 4 ° C und anschließend mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem für 1 h Sekundärantikörper bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen wurden die immunreaktiven Banden durch verstärkte Chemilumineszenz (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) sichtbar gemacht. Western-Blotting wurde für jede Probe 3 mal durchgeführt. Das Protein wurde bei 20 bis 50 &mgr; g pro Spur geladen.

Immunhistochemie

Paraffin eingebettete Gewebeproben wurden de-paraffinized mit Xylol und dehydriert mit einer abgestuften Reihe von Alkohol. Antigen Retrieval durch Wärmebehandlung in 0,1 M Citrat-Puffer durchgeführt. Und die endogene Peroxidase-Aktivität blockiert wurde um 3% H _{2 O 2 verwendet. Dann wurden die Objektträger mit Antikörpern gegen Pdcd4 (1:200), TWIST1 (1:500), Vimentin (1:100) oder E-Cadherin (1:500) inkubiert und entsprechenden Meerrettich-Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörpern und DAB für Kerne. Antikörper für die immunhistochemische Färbung wurden die für Western-Blot verwendet. Schließlich wurde Hämatoxylin Zur Gegen Folien verwendet. Tumor Differenzierung von Krebsgewebe wurde in einer verblindeten Weise bestimmt. Der erste Antikörper wurde mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung als negative Kontrolle ersetzt. Die Proben angesehen wurden unter einem Nikon Eclipse-E800 (Nikon, Tokio, Japan) Mikroskop.}

Alle gefärbten Schnitte wurden durch zwei unabhängige verblindet Forschern beobachtet und bewertet, und Dias insgesamt Färbungsindex (SI) gegeben wurden punkten nach die Färbungsintensität und der Prozentsatz positiver Tumorzellen. Färbeintensität wurde als 0, keine Färbung abgestuft; 1, schwache Färbung; 2, moderate Färbung; und 3, eine starke Färbung. Tumorzellanteil wurde als 0, ≤20% positive Tumorzellen erzielt; 1, 20% -40% positive Tumorzellen; 2, 40% -60% positive Tumorzellen; 3, 60% -80% positive Tumorzellen; und 4 ≥80% positive Tumorzellen. Durch die SI-Beurteilung wurden die Färbungsergebnisse schließlich als 0-4, niedrige Expression aufgezeichnet; 4-6, moderate Ausdruck; und 6-12, hohe Expression. Wenn die Auswertung der Färbung zwischen den Forschern unterschieden, wurden die Daten für den Abschnitt verworfen.

Matrigel Invasionstest

Matrigel Invasionstest umfasste eine Transwell-Kammer (Costar, New York, USA). SGC-7901-Zellen wurden mit 2 ug pCDNA3.1 transfiziert, pEGFP-C1; pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; oder pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-Pdcd4. Nach 48 h, 1 x 10 ^{5 post-transfizierten Zellen wurden auf Transwell Kammern mit 20 ug Matrigel vorbeschichtet trypsinisiert und plattiert. Medium 20% FBS in der unteren Kammer enthalten, dienten als chemische Lockstoffe, und die obere Kammer wurde mit Medium, das 10% FBS gefüllt. Nicht-migrierten Zellen wurden nach 24 oder 48 h mit Wattestäbchen entfernt. Zellen an der Unterseite des Filter Migration wurden auf einem Mikroskop mit 0,1% Kristallviolett gefärbt und gezählt. Schließlich wurden die verbleibenden Zellen für Protein- und RNA-Isolierung abgeerntet. Jede Behandlung wurde 3 mal wiederholt.}

Statistical analysis

Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Student t
Test oder Chi-Quadrat-Test wurde verwendet, zwei Gruppen zu vergleichen. Die Datenanalyse beteiligt SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). P
< 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: miR-30b, nach unten reguliert bei Magenkrebs, fördert die Apoptose und Unterdrückt Tumorwachstum durch Targeting-Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1
• PLoS ONE: Helicobacter pylori von Magenkrebs und Zwölffingerdarmgeschwür anzeigen Same phylogeographische Herkunft in der Andenregion in Colombia