PLoS ONE: Helicobacter pylori Bevordert-mesenchymale transitie bij maagkanker door neerwaarts reguleren van geprogrammeerde celdood Protein 4 (PDCD4)

Abstract

Helicobacter pylori
, een Gram-negatieve, Microaërofiele bacterie gevonden in de maag, wordt in verband gebracht worden met kanker, invasie en metastase in spijsverteringsaandoeningen. Cytotoxine-geassocieerde gen A (CagA) een oncogeen eiwit H. pylori
dat wordt gecodeerd door een pathogeniteit eiland Cag verband met de ontwikkeling van maagkanker. De epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) is de belangrijkste biologische gebeurtenis in invasie of metastase van epitheliale cellen. H. pylori
kan EMT in menselijke maagkanker cellijnen te bevorderen, maar de specifieke mechanismen zijn nog steeds onduidelijk. We verkend het onderliggende moleculaire mechanisme van EMT veroorzaakt door H. pylori
CagA bij maagkanker. In ons artikel, ontdekt we maagkanker exemplaren en de aangrenzende niet-kanker specimens door immunohistochemie en vond verhoogde expressie van de EMT-gerelateerde regulatie-eiwit TWIST1 en de mesenchymale marker vimentine bij kanker weefsels, terwijl de geprogrammeerde celdood factor 4 (PDCD4) en de epitheliale marker E-cadherine afgenomen kanker exemplaren. Deze veranderingen zijn geassocieerd met graad weefsel maligniteit. Bovendien werden PDCD4 en TWIST1 niveaus verwant. In maagkanker cellen gekweekt samen met CagA expressieplasmide, CagA geactiveerd TWIST1 en vimentine expressie, en remde E-cadherine expressie door neerwaarts reguleren PDCD4. CagA bevorderde ook de mobiliteit van maagkanker cellen door het reguleren van PDCD4. Zo, H. pylori
CagA geïnduceerde EMT bij maagkanker cellen, die een nieuwe signaleringsroute van EMT bij maagkanker cellijnen onthult

Visum:. Yu H, Zeng J, Liang X, Wang W, Zhou Y, Zon Y, et al. (2014) Helicobacter pylori
Bevordert-mesenchymale transitie bij maagkanker door neerwaarts reguleren van geprogrammeerde celdood Protein 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10.1371 /journal.pone.0105306

Editor: Rajeev Samant, Universiteit van Alabama in Birmingham, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 12 februari 2014; Aanvaard: 21 juli 2014; Gepubliceerd: 21 augustus 2014

Copyright: © 2014 Yu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de Nationale Basic Research Program van China (geen 973 Program 2012CB911202.), de National Natural Science Foundation of China (nos: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 en 81170514), de Medical Science and Technology Development Program van Shandong (geen . 2013WS0209) en de Onafhankelijke Innovation Foundation van Shandong University (no. 2012TS106). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Helicobacter pylori
( H. pylori
) is een helix-vormig, Gram-negatieve bacterie geassocieerd met maag-en vaatziekten, met inbegrip van chronische gastritis, maagzweer, maagkanker, en mucosa-geassocieerde lymfeweefsel lymphoma. H. pylori
is geclassificeerd als een kankerverwekkende stof door de World Health Organization en het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek (WHO /IARC) in 1994 [1], [2].

H. pylori
genen beschikken over een cytotoxine-geassocieerde gen A (CagA) pathogeniteit eiland dat de belangrijkste virulentie-eiwit CagA en een type IV secretie systeem (T4SS) codeert. CagA afgeleverd aan gastheercellen door T4SS en induceert vorming en progressie van kanker [3]. H. pylori
kunnen celproliferatie dereguleren, invloed op de normale apoptotische route, invloed cel vorm, af te schaffen junctionele activiteit en een epitheliale-to-mesenchymale transitie (EMT) te vergemakkelijken fenotype nadat het verplaatst zich in de gastheercel [4], [5]. De H. pylori
effector eiwit CagA invloed op de meeste van deze routes. In vivo
experimenten toonden aan dat transgene expressie van CagA meerdere tumoren kunnen veroorzaken bij muizen, zoals maag epitheliale hyperplasie, myeloïde leukemie en B-cel lymfomen, of gastrische poliepen en adenocarcinomen van de maag en dunne darm [6]. De moleculaire mechanisme van H. pylori
CagA interactie op gastheercellen, is nog onduidelijk.

De EMT werd aanvankelijk gezien als een kenmerk van embryogenese, een essentieel proces voor het morfogenese tijdens de embryonale ontwikkeling en het hart. Echter zij bovendien tot weefselfibrose, tumorinvasie en metastase. EMT wordt gekenmerkt door een aantal verschillende kenmerken, zoals verlies van celadhesie, cel verhoogde mobiliteit, weerstand tegen apoptose en enkele eigenschappen van stamcellen. Met EMT, epitheliale markers zoals E-cadherine tonen verminderde expressie en mesenchymale merkers zoals vimentine vertonen verhoogde expressie. Andere regulerende moleculen zoals slak, TWIST en SLUG toon veranderde expressie [7], [8], [9]. Oncogene routes die de EMT kunnen veroorzaken omvatten transformerende groeifactor β (TGF-β), Src, Ets, Ras, Wnt /β-catenine, Notch, nucleaire factor-kB en integrine [10], [11], [12].

Infectie met het humane pathogene factor H. pylori
wordt verondersteld te leiden tot EMT, invasie of metastase van maagkanker. Bijvoorbeeld, opregulatie van matrix metalloproteinase 7 door pathogene H. pylori
gedeeltelijk afhankelijk van gastrine en kunnen een functie in de ontwikkeling van maagkanker hebben, eventueel via de EMT door indirect induceren niveaus van oplosbare heparine bindende endotheliale groeifactor [13]. H. pylori
CagA is betrokken bij de invasie van tumorcellen door de deregulering van c-met-receptor signalering [14]. Eveneens, CagA kan de activatie van de Wnt /β-catenine signaleringsroute verhogen door het verstoren van de stabilisering van de E-cadherine-β-catenine complex. Aldus CagA speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van intestinale metaplasie [15]. Bovendien microarray analyse erop dat de fosforylatie toestand van CagA de expressie van EMT-gerelateerde genen kunnen beïnvloeden maagkanker cellen [16]. Er is echter weinig bekend over de mechanismen die de EMT veroorzaakt door CagA ten grondslag liggen.

De geprogrammeerde celdood eiwit 4 (PDCD4) is gelokaliseerd aan de kern in delende cellen [17]. Als een belangrijke post-transcriptioneel doel van microRNA (MIR) miR-21, PDCD4 heeft betrekking op tumorprogressie en prognose bij humane long-, colorectale, borst- en maagkanker [18], [19]. De tumor suppressor PDCD4 kan binden aan eIF4A of eIF4G en remmen vertaling. PDCD4 kunnen reguleren door mitogeen geactiveerde proteïne kinase 4 1 of urokinase plasminogeen activator receptor (uPAR) uitdrukking carcinoom invasie en intravasation [20] remmen [21]. PDCD4 kan ook invloed hebben op de transcriptie van genen. Interactie met het DNA-bindingsdomein van TWIST1 en remt Y-box bindend eiwit 1-expressie [22]. Als goed, is het verlies van PDCD4 expressie geassocieerd met maligne transformatie bij maagkanker [23], [24]. Downregulatie van PDCD4 is gerelateerd aan de tumor differentiatie spijsverteringskanaal kanker [25]. Echter, of PDCD4 is betrokken bij de EMT geïnduceerd door CagA bij maagkanker en het specifieke mechanisme nog nadere toelichting nodig.

Hier hebben we de regulatie van EMT-geassocieerde eiwitten en PDCD4 expressie in maagkanker weefsel en CagA activering van TWIST1 expressie en remming van E-cadherine en PDCD4 expressie bij maagkanker cellen.

Materialen en methoden

Patiënten en weefselmonsters

de studie werd door de Ethics goedgekeurd Comité van Shandong University School of Medicine, en alle monsters en gegevens werden verzameld met schriftelijke informed consent. Maagtumor weefsels en hun geëvenaard non-kankerweefsel werden geoogst van 30 patiënten tijdens de operatie bij Qilu Hospital, Shandong University (Jinan, China) van 2010 tot 2012. Geen van de patiënten had adjuvante chemotherapie of radiotherapie voor de operatie. De diagnose van maagkanker werd histopathologisch bevestigd door hematoxyline en eosine kleuring.

Cel cultuur en transfectie

Human maagkanker cellijnen (AGS, BGC-823 en SGC-7901) werden verkregen van de China Academia Sinica Cell Repository (Shanghai). De cellen werden geïncubeerd in de aanbevolen media en een bevochtigde atmosfeer met 5% CO _{2 bij 37 ° C zonder antibiotica. SGC-7901 cellen en BGC-823 cellen werden gekweekt in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en AGS cellen werden gekweekt in F12 medium aangevuld met 10% FBS. FBS media en werden verkregen van Invitrogen (USA). Vervolgens werden de cellen tijdelijk met plasmiden pCDNA3.1 of pCDNA3.1-CagA (een geschenk van Dr. Yongliang Zhu, Zhejiang University, China) en pEGFP-C1 of pEGFP-C1-PDCD4 (gebouwd en geleverd door Dr. Youhai Chen , Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) met behulp van X-treme GENE HP transfectiereagens (Roche Diagnostics, Duitsland) volgens de protocollen van de fabrikant.}

RNA-isolatie, reverse transcriptie en qRT-PCR

Totaal RNA werd uit cellen geëxtraheerd door het gebruik van Trizol reagens (Invitrogen, USA). Reverse transcriptie betrokken Superscript III First Strand Synthesis Kit (Invitrogen). Expressie van genen werd gedetecteerd met gebruik van kwantitatieve real-time PCR SYBR Premix Ex Taq (Takara, China) en normalisatie omvatte de 2 ^{- △△ ct methode ten opzichte van P-actine. Primersequenties waren voor PDCD4, sense, 5'-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 'en antisense, 5'-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3'; E-cadherine, sense, 5'-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 'en antisense, 5'-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3'; CagA, sense, 5'-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 'en antisense, 5'-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3'; en TWIST1, sense, 5'-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 'en antisense, 5'-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3'; vimentine, sense, 5'-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 'en antisense, 5'-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3'; SNAIL, sense, 5'-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 'en antisense, 5'-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3'; β-actine, sense, 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 'en antisense, 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'.}

Western blotanalyse

Eiwit werd uit de monsters geëxtraheerd en gescheiden door SDS-PAGE , vervolgens overgebracht op PVDF-membranen (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), die onmiddellijk werden geblokkeerd met 5% magere melk in TBST met 1% Tween-20 gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na gewassen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 3 maal, werden membranen geïncubeerd met antilichamen tegen PDCD4 (1:500; Cell Signaling Technology, USA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, USA), slak (1:1000 , Cell Signaling Technology, USA), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-cadherine (1:1000, Cell Signaling Technology, USA), vimentine (1:1000, Cell Signaling Technology, USA ) en β-actine (1:2000, Sigma-Aldrich, USA), als normalisatie controle, bij 4 ° C gedurende de nacht, daarna met mierikswortel peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Na wassen werden de immuunreactieve banden zichtbaar gemaakt met versterkte chemiluminescentie (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). Western blotting werd 3 keer uitgevoerd voor elk monster. Eiwit werd geladen bij 20 tot 50 ug per rijstrook.

Immunohistochemie

paraffine ingebedde weefselmonsters werden de-paraffinized met xyleen en gedehydrateerd met een gegradeerde reeks van alcohol. Antigen herstel door warmtebehandeling uitgevoerd in 0,1 M citraatbuffer. En het blokkeren van de endogene peroxidase-activiteit werd gebruikt door 3% H _{2O 2. Daarna werden dia's geïncubeerd met antilichamen tegen PDCD4 (1:200), TWIST1 (1:500), vimentine (1:100) of E-cadherine (1:500), en de bijbehorende mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en DAB voor de kernen. Antilichamen voor immunohistochemische kleuring werden die gebruikt voor western blot. Tenslotte werd gebruikt voor hematoxyline tegenkleuring dia. Tumordifferentiatie kanker weefsels werd bepaald op een blinde wijze. Het eerste antilichaam werd vervangen met fosfaatgebufferde zoutoplossing als negatieve controle. Monsters werden onder een Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokyo, Japan) microscoop bekeken.}

Alle gekleurde secties werden waargenomen en gescoord door 2 onafhankelijke geblindeerde onderzoekers en objectglaasjes werden een totaal kleuring index (SI) score volgens de kleurintensiteit en het percentage positieve tumorcellen. Kleuring intensiteit werd beoordeeld als 0, geen vlekken; 1, zwakke kleuring; 2, matige kleuring; en 3, sterke kleuring. Tumorcel aandeel werd gescoord als 0, ≤20% positieve tumorcellen; 1, 20% -40% positieve tumorcellen; 2, 40% -60% positieve tumorcellen; 3, 60% -80% positieve tumorcellen; en 4, ≥80% positieve tumorcellen. Bij het beoordelen van de SI, werden de kleuring resultaten definitief als 0-4, lage expressie; 4-6, matige meningsuiting; en 6-12, hoge expressie. Als de vlekken interpretatieverschillen tussen de onderzoekers verschilden, werden de gegevens voor de sectie weggegooid.

Matrigel invasie assay

Matrigel invasie test betrof een transwell kamer (Costar, New York, USA). SGC-7901-cellen werden getransfecteerd met 2 ug pCDNA3.1, pEGFP-C1; pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; of pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-PDCD4. Na 48 uur, 1 x 10 ^{5 achteraf getransfecteerde cellen werden getrypsiniseerd en uitgeplaat op Transwell kamers vooraf bekleed met 20 ug Matrigel. Medium met 20% FBS in de onderste kamer diende als chemoattractant en de bovenste kamer werd gevuld met medium dat 10% FBS. Non-gemigreerde cellen werden verwijderd met wattenstaafjes na 24 of 48 uur. Cellen migreren naar de onderzijde van het filter werden gekleurd met 0,1% kristalviolet en geteld op een microscoop. Tenslotte werden overblijvende cellen geoogst voor eiwitten en RNA-isolatie. Elke behandeling werd 3 maal herhaald.}

Statistische analyse

De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Student t Electronics Test of chi-kwadraat test werd gebruikt om 2 groepen te vergelijken. Data-analyse betrokken SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). P Restaurant < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant

Resultaten

1.. Expressie van TWIST1, E-cadherine, vimentine en PDCD4 bij maagkanker

Om de associatie van EMT en maagkanker te onderzoeken, we geoogst 30 klinische weefselmonsters van maagkanker patiënten. Biopsieën werden verdeeld in midden /laag differentiatie weefsel, hoge differentiatie weefsel en non-kankerweefsel grenzend aan carcinoom door hematoxyline en eosine kleuring (Fig. 1A). Op immunohistochemie, TWIST1 en vimentine expressie was hoger in kwaadaardig weefsel dan niet-cancereus weefsel, terwijl de expressie van E-cadherine en PDCD4 tegengesteld aan die van TWIST1 (fig. 1A-E) was. TWIST1 en PDCD4 expressie werd geassocieerd met de mate van tumordifferentiatie maar niet geslacht of leeftijd (p = 0,021 en p = 0,013, Tabel 1). Eveneens, verlaagde PDCD4 expressie werd omgekeerd geassocieerd met veranderde expressie TWIST1 tijdens maagkanker (p = 0,035, Tabel 2). Daarom kan EMT een belangrijke rol bij maagkanker en ontwikkeling.

2. TWIST1, vimentine of E-cadherine in de maag cellijnen wordt gereguleerd door CagA

Vervolgens hebben we onderzocht of CagA, als een virulente factor van H. pylori
, onder invloed van de EMT en daarom bevorderde de invasie en metastase bij maagkanker. We kozen voor 3 menselijke maagkanker cellijnen van differentiatie statussen (AGS, goed gedifferentieerde maag epitheel cellijn, SGC-7901, matig gedifferentieerde cellijn en BGC-823 slecht gedifferentieerde cellijn). CagA expressieplasmide werd getransfecteerd in verscheidene maag cellijnen. Hoewel de morfologische veranderingen van CagA getransfecteerde cellen niet werden waargenomen (gegevens niet getoond) werd de expressie van transcriptiefactoren en celmerkers beïnvloed door CagA. Het mRNA en eiwitexpressie van TWIST1 en vimentine werd opgereguleerd met CagA transfectie (fig. 2A-G) en die van PDCD4 en E-cadherine werd downgereguleerd (fig. 2A-G), maar geen significante veranderingen in SNAIL expressie waargenomen in CagA transfectie groep. Daarom H. pylori
CagA kunnen beïnvloeden EMT regelgevers waaronder TWIST1. Bovendien E-cadherine een belangrijke epitheliale marker en vimentine, als mesenchymale merker geregeld TWIST1 werden ook beïnvloed door CagA en de EMT-gerelateerde gen PDCD4 downgereguleerd werd.

3. Expressie van TWIST1, vimentine en E-cadherine werd beïnvloed door PDCD4

We naast geanalyseerd het moleculaire mechanisme van de EMT gereguleerd door H. pylori
CagA bij maagkanker cellen. PDCD4 onderdrukt celgroei via een directe interactie met TWIST1 in humane prostaatkanker [22]. Immunohistochemie en statistische analyse toonde het belang van PDCD4 en TWIST1 bestonden maagcarcinoom (fig. 1, Tabel 2). De onderliggende mechanismen PDCD4 functie maagkanker cellen onduidelijk. Dus AGS? GSC-7901 en BGC-823 cellen die we getransfecteerd met een plasmide van overexpressie PDCD4. PDCD4 mRNA en eiwitexpressie werd opgereguleerd in elke plasmide-getransfecteerde cellijnen (Fig. 3A-G). Bovendien, mRNA en eiwitniveaus van TWIST1 en vimentine, maar niet SNAIL, daalden in uiteenlopende mate, en E-cadherine niveau verhoogd (Fig. 3A-G). Daarom kunnen TWIST1, vimentine en E-cadherine-expressie wordt gereguleerd door PDCD4 in maagepitheelcellen.

4. De EMT wordt gereguleerd door CagA via remmen PDCD4 in de maag epitheelcellen

Op basis van bovenstaande bevindingen, hypothesen we dat het EMT proces geïnduceerd door H. pylori
CagA opgetreden door neerwaarts reguleren PDCD4, we gecotransfecteerd maagepitheelcellen met CagA plasmide en PDCD4 overexpressie plasmide. De verminderde expressie van PDCD4 werd teruggevonden met CagA en overexpressie PDCD4 transfectie. Naast de verhoogde expressie van TWIST1 en vimentine werd geremd en de verminderde expressie van E-cadherine werd opgereguleerd in de gecotransfecteerde groep. Die veranderingen op zowel mRNA en eiwitniveaus (Fig. 4A-G). De migratie van menselijke maagkanker cellijn SGC-7901 getransfecteerd met plasmiden werd bepaald door Matrigel invasie assay. Resultaten laten zien dat het werd geïnduceerd door CagA plasmide. Celmigratie test bleek ook dat PDCD4 overexpressie gedownreguleerd CagA-geïnduceerde hun invasie en metastase vermogen (afb. 5A). Fig. 5B toont de gemigreerde cellen aantallen SGC-7901 in CagA transfectie groep duidelijk meer dan de controlegroep, terwijl de hoeveelheid van gemigreerde cellen in co-transfectie groep aanzienlijk minder dan CagA transfectie groep. De biologische verschijnselen demonstreren EMT promotie door CagA werd teruggevonden in een deel door verhoogde PDCD4 expressie. Op basis van het bewijs, dat afgeleid dat PDCD4 nodig kunnen zijn voor de H. pylori
-CagA gemedieerde maagkanker progressie

Discussie

De belangrijkste bevindingen van deze studie zijn als volgt samengevat: 1). H. pylori
CagA is verantwoordelijk voor de inductie van TWIST1 of vimentine en remming van E-cadherine in maagkanker cellen. 2)-CagA geïnduceerde epitheliale-mesenchymale transitie is voor een deel afhankelijk van de regulering van PDCD4. 3) TWIST1 en PDCD4 omvat het EMT maagkanker.

Maagkanker is een meerstaps en geleidelijke ziekte. Overmaat proliferatie van epitheliale cellen is een belangrijk onderdeel van de oorspronkelijke tumor angiogenese of vroege groei [5]. Vervolgens celinvasie, aanvankelijk gereflecteerd door het basaal membraan, werd beschouwd als een voorspeller van de eindfase; uiteindelijk leidt tot metastase en sterfte [26]. Pathogene infectie kan kanker tumorgenese en maligne transformatie van gastheercellen leiden. Als belangrijke pathogene risicofactor Helicobacter pylori
waren nauw gerelateerd aan maagzweer, mucosa-geassocieerde lymfeweefsel lymfoom van de maag en maagdarmkanker [20], [27], [28], [29] . CagA, een van de meest principe virulentiefactoren van H. pylori
, induceert optreden en de ontwikkeling van maagkanker. Maligne transformatie van gastheercellen omvat in regulationary netwerk, waaronder talrijke celeiwitten, niet-coderende RNA en andere biologische activiteit moleculen. Het mechanisme onderliggende CagA effecten op het maagslijmvlies zo complex en onduidelijk.

De EMT is een sterk geconserveerd biologisch taak op embryonale orgaanontwikkeling, waardoor epitheelcellen epitheliaal fenotype verliezen en mesenchymale fenotype te verkrijgen. Dit omvat het verlies van cel polariteit epitheelcellen, verlies van het vermogen om te verbinden met basaalmembraan, toegang tot mesenchymale fenotype zoals hogere migratie en invasie, anti-apoptose, en de mogelijkheid om de extracellulaire matrix [8] degraderen, [30] . EMT speelt een essentiële rol bij chronische ontstekingsziekten, fibrotische ziekten, tumorprogressie en weefsel wederopbouw, vooral bij het verwerven van migratie en invasie mogelijkheid voor kwaadaardige epitheelcellen. Abnormale activiteit in de EMT epith volwassen epitheelcellen geremd celadhesiemoleculen, veroorzaakt verminderde capaciteit celadhesie en aldus de mogelijkheid tumorcellen te spreiden door het lichaam uiteindelijk bevorderen tumormetastase [31], [32], [33]. EMT wordt daarom beschouwd als het begin van de invasie en metastase en is ook een teken van sterke vermogen van invasie en metastase van tumorcellen. H. pylori
induceert epitheliale-mesenchymale transitie door TNF-α-inducerende eiwit [34]. De huidige studie geeft CagA kan epitheelcellen leiden tot morfologische veranderingen. Er is voorgesteld dat expressie CagA niet alleen voldoende apicale knooppunten verstoren maar ook lijken epitheliale naar mesenchymale transitie in Madin-Darby niercellen van een hond [35]. Epitheliale cellen geïnfecteerd door de bacterie verschenen verschillende genomics veranderingen en de zou bewerkstelligen markers geïnduceerd door H. pylori
was waarschijnlijk op een cagPaI-gerelateerde manier. Gegevens bleek dat epitheliale mesenchymale transitie (EMT) gerelateerde genen waren up- of down-gereguleerd door CagA-positieve H. pylori
stammen in AGS [36], [37]. Van de nota, de regulerende netwerk van CagA betrekken in de EMT van maagkanker is nog moeten worden verduidelijkt.

Om de specifieke mechanisme van de EMT gepromoot door CagA bij maagkanker te onderzoeken, vergeleken we genen expressie van aangrenzende niet- tumor weefsels en maagcarcinoom weefsels door immunohistochemie. De resultaten gaven aan dat TWIST1 /vimentine expressie in carcinoma weefsels waren hoger dan naburige niet-tumor weefsel, en de uitdrukking in het midden /laag differentiatie carcinoma weefsels hoger dan een hoge differentiatie weefsels. Echter, E-cadherine en PDCD4 daalde in het proces van epitheliale-mesenchymale overgang bij maagkanker. Interessant is dat het bestaat op een negatieve correlatie met de uitdrukking van TWIST1 en PDCD4. Onze studie suggereerde EMT-gerelateerde genen zijn geassocieerd met de verwerking van maagkanker, in overeenstemming met eerdere onderzoeken observeren verlies van epitheliale eiwit en /of verkrijgen van de expressie van mesenchymale eiwitten zich in maagcarcinoom. Daarnaast werden ze respectievelijk gecorreleerd aan slecht gedifferentieerde histologie, vergevorderd stadium en een slechte prognose van de patiënt [38]. Daarnaast PDCD4 een nieuw gevonden molecuul dat een belangrijke rol in vele biologische processen die ziekte of gebeurtenis en ontwikkeling van tumor kan veroorzaken speelt. PDCD4 remt het vertaalproces door te binden aan translatie-initiatie factor eIF4A of eIF4G. Verschillende inductoren van apoptose stimuleren cellen en upregulate de expressie van PDCD4, die verder P21, Cdk4, koolzuuranhydrase II en JNK /c-Jun /AP-1 kan regelen. PDCD4 kan invasie-gerelateerde urokinase plasminogeen activator receptor expressie, invasie of infiltratie van bloedvaten en metastase remmen; derhalve verminderde expressie van PDCD4 speelt een belangrijke rol bij tumor ontstaan, ontwikkeling en prognose [17], [33], [39], [40]. Dus vroegen we als TWIST1 en PDCD4 deelgenomen aan de CagA geïnduceerde EMT.

Dan hebben we ontdekt EMT-geassocieerde transcriptiefactoren en markers expressie in CagA getransfecteerde maagkanker cellijnen. Onze gegevens toonden aan dat H. pylori
CagA kon reguleren expressie van TWIST1 en vimentine, maar niet SLAK, en neer te regelen E-cadherine en PDCD4 in de maag cellijnen (AGS, SGC-7901 en BGC-823). De resultaten werden niet beïnvloed door de differentiatie status van getransfecteerde cel. Hoewel we niet de morfologische veranderingen van CagA getransfecteerde cellen heeft gehouden, kan invasie en metastase vermogen van maagkanker cellen worden versneld door CagA via Transwell invasie assay. Dit is mede veroorzaakt door de functionele heterogeniteit van CagA in verschillende weefsels. Dus het effect van EMT geïnduceerd door H. pylori
nog steeds nodig verder worden onderzocht. MiR-21 bevorderd TGF-β-geïnduceerde myofibroblast differentiatie proces door zich te richten PDCD4. TGF-β geïnduceerde miR-21 expressie in fibroblasten en mir-183 neerwaarts gereguleerd PDCD4 en remde TGF-β-geïnduceerde apoptose in humane hepatocellulaire carcinoomcellen [41], [42]. Ondertussen, TGF-β gereguleerd SLAK, TWIST of ZEB1 en invloed op de EMT en metastase [43]. Bovendien PDCD4 bleek betrokken te zijn bij de transcriptie ook. Inderdaad, de COOH terminus van TWIST1 met de basis helix-loop-helix domein werd gesuggereerd dat de directe interactie met PDCD4 eiwitten bemiddeld. Dus, PDCD4 interactie met het DNA bindende domein van TWIST1 en remt het DNA bindende vermogen om genen in humane prostaatkanker doelwitcellen [22] .Daarom we verder getest of PDCD4 TWIST1 kan regelen bij maagkanker cellen. Onze studie toonde aan dat TWIST1 beneden werd geregeld door PDCD4 hoge expressie plasmide door real-time PCR en western blotting, terwijl de E-cadherine tegenover TWIST1 in AGS, SGC-7901 en BGC-823 was. De mRNA expressie van Snail werd neerwaarts gereguleerd in AGS en SGC-7901, terwijl preotein expressie werd niet hetzelfde waargenomen veranderingen. Het kan te wijten aan de complexiteit van eiwitsynthese. Dat wil zeggen, eiwit niet alleen geregeld op transcriptieniveau ook vertaling en omdraaien niveau. Het blijkt soms dat mRNA is niet een directe aanwijzing van eiwitgehalte in cellen. Tot slot voerden we verder onderzoek naar de rol van PDCD4 in-CagA geïnduceerde epitheliale-mesenchymale transitie. Maagepitheelcellen werden getransfecteerd met expressieplasmide CagA en PDCD4 overexpressie plasmide gelijktijdig. Restauratie van PDCD4 meningsuiting kon TWIST1 en vimentine remt, en induceren E-cadherine, die gereguleerd door CagA, werd PDCD4 ook gecertificeerd die van invloed kunnen de invasie en metastase vermogen in het maag-cellen door Matrigel invasie assay. Hoewel aanvullende studies nodig zijn om deze hypothese te testen, hebben we geconcludeerd dat in principe-CagA geïnduceerde epitheliale-mesenchymale transitie is voor een deel afhankelijk van de regulering van PDCD4.

In het kort, tonen we aan dat H. pylori
CagA induceren TWIST1 expressie en EMT bij maagkanker cellen door het reguleren van PDCD4 (fig. 6). Wij bieden enig inzicht in de moleculaire netwerk van maagkanker veroorzaakt door H.
pylori infectie, en leveren een theoretische basis voor PDCD4 als een biologisch doelwit voor diagnose of behandeling van kanker. Toekomstig onderzoek met muismodellen kan leiden tot een beter begrip van de rol van PDCD4 in de H. pylori
geïnduceerde EMT van maagkanker.

• PLoS ONE: miR-30b, stads Geregeld bij maagkanker, Bevordert apoptose en onderdrukt tumorgroei door zich te richten plasminogeenactivatorremmer-1
• PLoS ONE: Helicobacter pylori van maagkanker en darmzweren Show Zelfde fylogeografische Origin in het Andesgebied in Colombia