PLoS ONE: хеликобактер пилори Содействует Эпителиальные-мезенхимальных Переход в рака желудка по Downregulating Программируемая гибель клеток белка 4 (Pdcd4)

Абстрактный

хеликобактер пилори
, грамотрицательная, Микроаэрофильный бактерии в желудке, предполагается, связаны с канцерогенеза, инвазию и метастазирование в пищеварительных заболеваний. Цитотоксин-ассоциированный ген А (CagA) является онкогенными белок H. пилори
, который кодируется с помощью островка патогенности Cag, связанные с развитием рака желудка. Эпителиальный-мезенхимальных перехода (EMT) является основным биологическим событием в инвазии или метастазирования эпителиальных клеток. H. пилори
может способствовать EMT в желудочном линиях раковых клеток человека, но конкретные механизмы, которые до сих пор неясны. Мы исследовали основной молекулярный механизм EMT индуцированного H. пилори
CagA при раке желудка. В нашей статье мы обнаружили желудочные образцов рака и прилегающих к нераковых образцов с помощью иммуногистохимии и обнаружили повышенную экспрессию ЕМТ, связанных с регуляторным белком TWIST1 и мезенхимальных маркера виментину в раковых тканях, в то время как фактор запрограммированную гибель клеток 4 (Pdcd4) и эпителиальные выражение Е-кадгерин маркер снизился в образцах рака. Эти изменения были связаны со степенью злокачественности ткани. Кроме того, уровни Pdcd4 и TWIST1 были связаны между собой. В раковых клетках желудка сокультивировали с экспрессией CagA плазмиды, CagA активированный TWIST1 и экспрессию виментин и подавлял экспрессию Е-кадгерина по downregulating Pdcd4. CagA также способствует подвижности клеток рака желудка путем регуляции Pdcd4. Таким образом, H. пилори
CagA индуцированный EMT в клетках рака желудка, который показывает новый сигнальный путь ЕМТ в желудочном линиях раковых клеток
<р> Образец цитирования:. Ю. Н, Цзэн J, Лян X, Ван W, Чжоу Y, вс Y, и др. (2014) хеликобактерной
Содействует Эпителиальные-мезенхимальных Переход в рака желудка по Downregulating запрограммированное Cell Death белка 4 (Pdcd4). PLoS ONE 9 (8): e105306. DOI: 10.1371 /journal.pone.0105306
<р> Редактор: Раджив Samant, Университет штата Алабама в Бирмингеме, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 12 февраля 2014 года; Принято: 21 июля, 2014 года; Опубликовано: 21 августа 2014
<р> Copyright: © 2014 Ю. и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национальной программы фундаментальных исследований Китая (без +973 программы 2012CB911202.), Национальный фонд естественных наук Китая (№: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 и 81170514), медицинской науки и Программа развития технологии Шаньдун (нет . 2013WS0209) и инновационный фонд Независимый Шаньдун университета (нет. 2012TS106). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

хеликобактерной
( H. пилори
) является спиралью-образной формы, грамотрицательная бактерия, связанная с заболеваниями органов пищеварения, в том числе хронический гастрит, язвенная болезнь, рак желудка, и слизистых оболочек лимфоидной ткани лимфома. H. пилори
классифицирован как канцероген Всемирной организацией здравоохранения и Международным агентством по изучению рака (WHO /IARC) в 1994 году [1], [2].

H. Pylori
гены обладают цитотоксин-ассоциированный ген А (CagA) остров патогенности, который кодирует основную вирулентности белка CagA и систему секреции IV типа (T4SS). CagA доставляется к клеткам-хозяевам путем T4SS и индуцирует образование рака и прогрессии [3]. H. пилори
может дерегулированию клеточную пролиферацию, влиять на нормальную путь апоптоза, формы влияния клеток, упразднить Junctional активность и способствовать эпителиально-к-мезенхимальных перехода (EMT) фенотип после того, как транслоцируется в клетку-хозяина [4], [5]. H. Pylori
эффектор белок CagA влияет на большинство из этих путей. В естественных условиях
эксперименты показали, что трансгенные экспрессия CagA может вызвать множественные злокачественные опухоли у мышей, в том числе желудочной эпителиальной гиперплазии, миелоидной лейкемии и В-клеточных лимфом, или желудочных полипов и аденокарциномы желудка и тонкой кишки [6]. Однако, молекулярный механизм H. пилори
CagA взаимодействующих на клетки-хозяева до сих пор неясно.
<р> ЕМТ были первоначально признаны в качестве признака эмбриогенеза, жизненно важного процесса для формообразования во время эмбрионального и сердца развития. Тем не менее, это также способствует фиброзных тканей, инвазии и метастазирования опухолей. ЕМТ характеризуется несколькими признаками, различными, такими как потеря клеточной адгезии, повышенной подвижности клеток, устойчивость к апоптозу, а также некоторые свойства стволовых клеток. С EMT, эпителиальные маркеры, такие как E-кадгерина показывают снижение экспрессии и мезенхимальные маркеры, такие как повышенная экспрессия виментин шоу. Другие регуляторные молекулы, такие как улитка, твист и SLUG шоу изменилось выражение [7], [8], [9]. Онкогенные пути, которые могут индуцировать EMT включают трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета), Src, Ets, Рас, Wnt /β-катенин, Notch, ядерный фактор-kB и интегрина [10], [11], [12].
<р> Инфекция с человеческим патогенным фактором H. пилори
предполагается, приведет к ЕМТ, инвазии или метастазирования рака желудка. Например, повышающая регуляция матричной металлопротеиназы 7 патогенными H. пилори
частично зависит от гастрина и может иметь функцию в развитии рака желудка, потенциально через ЕМТ, путем косвенно индуцирующих уровни растворимого гепарин-связывающего эндотелиального фактора роста [13]. H. пилори
CagA участвует в инвазии опухолевых клеток путем дерегулирования с-мет рецептор сигнализации [14]. А также, CagA может увеличить активацию /β-катенина сигнального пути Wnt, нарушая стабилизацию Е-кадгерин-β-катенина комплекса. Таким образом, CagA играет жизненно важную роль в развитии кишечной метаплазии [15]. Кроме того, анализ микрочипов предположил, что статус фосфорилирование CagA может влиять на экспрессию ЕМТ-родственных генов в желудочном раковых клеток [16]. Тем не менее, мало известно о механизмах, лежащих в основе EMT, индуцированный CagA.
<Р> Программируемая гибель клеток белок 4 (Pdcd4) локализуется в ядре в пролиферирующих клетках [17]. В качестве важного пост-транскрипционной мишени микроРНК (MIR) микроРНК-21, Pdcd4 связан с опухолевой прогрессии и прогнозирования в легких человека, ободочной и прямой кишки, молочной железы и рака желудка [18], [19]. Супрессоров опухоли Pdcd4 может связываться с eIF4A или eIF4G и ингибирования трансляции. Pdcd4 может регулировать митоген-активированный протеин киназа 4 1 или экспрессию рецептора урокиназы активатора плазминогена (уАПР) ингибировать инвазию карцинома и intravasation [20], [21]. Pdcd4 может также влиять на транскрипцию генов. Он взаимодействует с ДНК-связывающим доменом TWIST1 и ингибирует Y-бокс-связывающего белка 1 выражение [22]. А также, потеря экспрессии Pdcd4 связано со злокачественной трансформацией в рак желудка [23], [24]. Подавление Pdcd4 связано с дифференцировки опухоли при раке желудочно-кишечного тракта [25]. Тем не менее, является ли Pdcd4 участвует в EMT, вызванной CagA при раке желудка и конкретного механизма до сих пор нуждаются в дальнейшем разъяснении.
<Р> Здесь мы исследовали регулирование EMT-ассоциированных белков и экспрессии Pdcd4 в желудочном ткани рака и CagA активация экспрессии TWIST1 и ингибирование Е-кадгерина и экспрессии Pdcd4 в раковых клетках желудка.

материалы и методы

Пациенты и образцы ткани
<р> исследование было одобрено этике Комитет Шаньдун школы медицины университета, и все образцы и информация были собраны с письменного информированного согласия. Желудочный ткани опухоли и их совпадающая незлокачественные ткани собирали из 30 пациентов во время операции в больнице Квайли, Шаньдун университет (Цзинань, Китай) с 2010 до 2012. Ни один из пациентов получали адъювантной химиотерапии или лучевой терапии до операции. Диагностика рака желудка была подтверждена гистологически гематоксилином и эозином.

Культура клеток и трансфекция
<р> желудка человека линии раковых клеток (AGS, КУП-823 и СГК-7901) были получены из Китая Academia Синица Cell Repository (Шанхай). Клетки инкубировали в рекомендуемых средах и в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2 при температуре 37 ° С без антибиотиков. СГК-7901 клетки и клетки, КУП-823 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и AGS клетки культивировали в среде F12, дополненной 10% FBS. Средства массовой информации и ФБС были приобретены у компании Invitrogen (США). Затем клетки были трансфицированы с плазмидами pCDNA3.1 или пкДНК3.1-CagA (подарок от доктора Yongliang Чжу, Zhejiang University, Китай) и pEGFP-C1 или pEGFP-С1-Pdcd4 (построен и при условии, д-р Чен Youhai Перельман Школа медицины, университет Пенсильвании, Филадельфия, США) с помощью X-Treme GENE HP Реагент (трансфекции Roche Diagnostics, Германия) в соответствии с протоколами производителя.

Выделение РНК, обратной транскрипции и QRT-PCR
<р> Суммарную РНК экстрагировали из клеток с помощью Trizol реагента (Invitrogen, США). Обратную транскрипцию участвует комплект Надстрочные III First Strand Synthesis (Invitrogen). Экспрессия генов была обнаружена с использованием количественных ПЦР в реальном времени SYBR Премикс Ex Taq (Takara, China) и нормализации включал 2 ^{- △△ метод КТ по ​​сравнению с бета-актина. Последовательности праймеров были для Pdcd4, смысл, 5'-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 'и антисмысловой, 5'-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3'; Е-кадгерин, смысл, 5'-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 'и антисмысловой, 5'-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3'; CagA, смысл, 5'-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 'и антисмысловой, 5'-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3'; и TWIST1, смысл, 5'-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 'и антисмысловой, 5'-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3'; виментин, смысл, 5'-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 'и антисмысловой, 5'-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3'; Улитка, смысл, 5'-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 'и антисмысловой, 5'-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3'; β-актина, смысл, 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 'и антисмысловой, 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'.}

Вестерн-блот-анализ
<р> Белки экстрагировали из образцов и разделяли с помощью ДСН-ПААГ , а затем переносили на ПВДФ-мембраны (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), которые были заблокированы сразу с 5% обезжиренным молоком в TBST, содержащем 1% твина-20 в течение 1,5 ч при комнатной температуре. После промывки в фосфатно-солевом буфере (PBS), в 3 раза, мембраны инкубировали с антителами против Pdcd4 (1:500; Cell Signaling Technology, США), TWIST1 (1:2000, Novus биологические препараты, США), улитка (1:1000 , Cell Signaling Technology, США), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-кадгерина (1:1000, Cell Signaling Technology, США), виментин (1:1000, Cell Signaling Technology, США ), и β-актин (1:2000, Sigma-Aldrich, США), в качестве контроля нормализации, при 4 ° с в течение ночи, а затем с конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела, при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывания Иммунореактивные полосы визуализировали усиленной хемилюминесценции (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). Вестерн-блоттинг проводили 3 раза для каждого образца. Белок был загружен 20 до 50 мкг на полосу.

Immunohistochemistry
<р> образцы ткани Парафиновые были де-paraffinized с ксилолом и обезвоженной с градуированных серии спирта. Антиген поиска с помощью термической обработки осуществляют в 0,1 М цитратном буфере. И блокирование эндогенной активности пероксидазы использовали на 3% H <суб> 2O <подразделам> 2. Затем предметные стекла инкубировали с антителами против Pdcd4 (1:200), Twist1 (1:500), виментину (1:100) или E-кадгерина (1:500), а также соответствующие конъюгированного с пероксидазой хрена вторичных антител и ДАБ для ядер. Антитела для иммуногистохимического окрашивания были те, которые используются для вестерн-блоттинга. И, наконец, гематоксилин использовался для counterstaining слайдов. Опухоль дифференциация раковых тканей определяли слепым методом. Первое антитело заменяли фосфатно-солевым буфером в качестве отрицательного контроля. Образцы были просмотрены под Nikon Eclipse E800 (Nikon, Токио, Япония) микроскопом.
<Р> наблюдались Все окрашенные срезы и забил 2 независимых исследователей, ослепленных и горок получили индекс общей окраски (SI) оценка в соответствии с интенсивность окрашивания и процент положительных опухолевых клеток. Окрашивание интенсивность оценивали как 0, не окрашивания; 1, слабое окрашивание; 2, умеренное окрашивание; и 3, сильное окрашивание. Опухолевой клетки доля оценивали как 0, ≤20% положительных опухолевых клеток; 1, 20% -40% положительных опухолевых клеток; 2, 40% -60% положительных опухолевых клеток; 3, 60% -80% положительных опухолевых клеток; и 4, ≥80% положительных опухолевых клеток. Оценивая SI, результаты окрашивания были окончательно записаны как 0-4, низкий уровень экспрессии; 4-6, умеренное выражение; и 6-12, высокий уровень экспрессии. Если интерпретация окрашивания отличались между исследователями, данные для секции были отброшены.

Матригель нашествие анализ
<р> Матригель нашествие анализа участвует в Transwell камеру (Costar, Нью-Йорк, США). СГК-7901 клетки трансфицировали 2 мкг pCDNA3.1, pEGFP-C1; pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; или pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-Pdcd4. Через 48 ч, 1 × 10 5 пост-трансфицированные клетки обрабатывали трипсином и высевали на Transwell камерах с предварительно нанесенным покрытием 20 мкг Матригель. Среду, содержащую 20% FBS, в нижней камере служил хемоаттрактанту, а верхняя камера была заполнена средой, содержащей 10% FBS. Неперемещенных клетки удаляли с ватным тампоном через 24 или 48 ч. Клетки, мигрирующие к нижней стороне фильтра, окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым и подсчитывали на микроскопе. И, наконец, остальные клетки собирали для белка и выделения РНК. Каждую обработку повторяют 3 раза.

Статистический анализ
<р> Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение. Student T
тест или критерий хи-квадрат был использован для сравнения 2 группы. Анализ данных включал SPSS 12.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). P
&л; 0,05 считалось статистически значимым

Результаты

1.. Выражение TWIST1, Е-кадгерин, виментин и Pdcd4 в желудочном
рака

Для того, чтобы исследовать ассоциацию ЕМТ и рака желудка, мы собрали 30 образцов ткани от клинических больных раком желудка. Биопсия были разделены на средней /низкой ткани дифференциации, высокой дифференциации тканей и не-раковой ткани, прилегающей к карциноме гематоксилином и эозином (рис. 1А). На иммуногистохимии, TWIST1 и экспрессия виментин были выше в злокачественной ткани, чем ткани во время операции, в то время как экспрессия Е-кадгерина и Pdcd4 было противоположно TWIST1 (рис. 1А-E). Выражение TWIST1 и Pdcd4 было связано со степенью дифференцировки опухоли, но не пола и возраста (р = 0,021 и р = 0,013, таблица 1). Кроме того, снижение экспрессии Pdcd4 было обратно пропорционально связано с измененным выражением TWIST1 во время рака желудка (р = 0,035, таблица 2). Таким образом, ЕМТ может играть важную роль в желудочном канцерогенезе и развития.

2. TWIST1, виментин или выражение E-кадгерина в желудочном клеточных линиях регулируется CaGa
<р> Далее, мы исследовали ли CagA, как вирулентных фактор H. пилори
, повлияли на EMT и, следовательно, способствовало инвазии и метастазирования при раке желудка. Мы выбрали 3 человека клетку рака желудка линии дифференциации состояний (AGS, хорошо дифференцированной эпители желудка линии клеток; SGC-7901, умеренно дифференцированной клеточной линии и КУП-823 слабо дифференцированы клеточная линия). Плазмиду экспрессии CagA трансфицировали в различных желудочных клеточных линий. Несмотря на то, что морфологические изменения CagA-трансфецированных клеток не наблюдалось (данные не показаны), экспрессию факторов транскрипции и клеточных маркеров были затронуты CagA. Экспрессии мРНК и белка TWIST1 и виментину был повышающей регуляции с CagA трансфекции (рис. 2A-G), и что из Pdcd4 и Е-кадгерина была подавлена ​​(рис. 2A-G), но никаких существенных изменений в экспрессии УЛИТКИ не наблюдалось в CagA трансфекция группа. Таким образом, H. пилори
CagA может повлиять на регуляторы EMT включая TWIST1. К тому же Е-кадгерин, в качестве важного маркера эпителиального и виментину, как мезенхимальных маркер регулируется TWIST1, также под влиянием CagA и EMT связанных генов Pdcd4 была подавлена.

3. Выражение TWIST1, виментину и Е-кадгерина под влиянием Pdcd4

Далее мы проанализировали молекулярный механизм EMT регулируется H. пилори
CagA в желудочном раковых клеток. Pdcd4 подавляет рост клеток посредством прямого взаимодействия с TWIST1 в развитии рака предстательной железы человека [22]. Иммуногистохимия и статистический анализ показал актуальность Pdcd4 и TWIST1 существовали в желудочном карциномы (рис. 1, таблица 2). Однако механизмы, лежащие в основе функции Pdcd4 в желудочном раковых клеток не были ясны. Так что АГС? ГСС-7901, и клетки КУП-823 мы трансфицированных плазмидой с гиперэкспрессией Pdcd4. Pdcd4 мРНК и экспрессию белка повышающей регуляции во всех плазмидных трансфецированные клеточные линии (рис. 3А-G). Кроме того, уровни мРНК и белка из TWIST1 и виментину, но не улитка, уменьшались до различной степени, а также были повышены уровни Е-кадгерин (рис. 3А-G). Поэтому, TWIST1, виментин и экспрессия Е-кадгерина может регулироваться Pdcd4 в эпителиальных клеток желудка.

4. EMT регулируется CagA посредством ингибирования Pdcd4 в эпителиальных клеток желудка
<р> На основании приведенных выше результатов, мы гипотезы о том, что процесс ЕМТ, индуцированное H. пилори
CagA произошел от downregulating Pdcd4, мы котрансфицируют эпителиальных клеток желудка с CagA плазмиды и Pdcd4 сверхэкспрессии плазмиды. Снижение экспрессии Pdcd4 было извлечено с CagA и гиперэкспрессия Pdcd4 трансфекцию. Кроме того, повышенная экспрессия TWIST1 и виментину ингибируется и снижение экспрессии Е-кадгерина был повышающей регуляции в котрансфицируемым группе. Эти изменения произошли как на мРНК и уровня белка (фиг. 4A-G). Миграция человека Линия клеток желудка СГК-7901, трансфицированных плазмид определяли Матригель инвазии анализа. Результаты показывают, что она индуцируется CagA плазмиды. анализа миграции клеток также показали, что избыточная экспрессия Pdcd4 подавляются CagA-индуцированное их инвазию и метастазирование способность (рис. 5А). Инжир. 5B показывает Мигрировавшие число клеток ГЭК-7901 в CagA трансфекция группы, очевидно, больше, чем контрольной группы, в то время как количество мигрировали клетки в Котрансфекция группе значительно меньше, чем трансфекция группы CagA. Биологические явления демонстрируют продвижение ЕМТ по CagA был восстановлен частично за счет повышенной экспрессии Pdcd4. На основании доказательств, сделать вывод, что Pdcd4 может потребоваться для H. Pylori
CagA-опосредованной желудка прогрессии рака

Обсуждение
<р> Основные результаты этого исследования можно резюмировать следующим образом: 1). H. пилори
CagA отвечает за индукцию TWIST1 или виментину и ингибирование Е-кадгерина в клетках рака желудка. 2) CagA-индуцированной эпителиально-мезенхимальных перехода частично зависит от регулирования Pdcd4. 3) TWIST1 и Pdcd4 включает в ЕМТ рака желудка.
<Р> Рак желудка является многоэтапным и постепенное заболевание. Избыток пролиферации эпителиальных клеток является важной частью первоначального ангиогенеза опухоли или раннего роста [5]. Впоследствии вторжение клеток, первоначально отражается через базальную мембрану, считался предсказателем конечной стадии рака; это в конечном счете приводит к метастазирования и смертности [26]. Патогенные инфекция может вызвать tumorgenesis рака и злокачественной трансформации клеток-хозяев. В качестве важного патогенного фактора риска, хеликобактер пилори
были тесно связаны с язвенной болезнью, слизистая-ассоциированной лимфоидной ткани лимфомы желудка и аденокарциномы желудка [20], [27], [28], [29] , CagA, один из самых основных факторов вирулентности H. пилори
, вызывает возникновение и развитие рака желудка. Злокачественная трансформация клеток-хозяев включает в regulationary сети, в том числе многочисленные клеточные белки, РНК, кодирующей не- и других биологических молекул деятельности. Тем не менее, механизм, лежащий эффекты CagA на слизистую оболочку желудка настолько сложна и неясна.
<Р> ЕМТ является высоко консервативен биологический процесс на эмбриональном развитии органов, что позволяет эпителиальные клетки потерять эпителиальный фенотип и получить мезенхимальных фенотипа. Это включает в себя потерю клеточной полярности в эпителиальных клетках, потеря способности к соединению с базальной мембраной, доступ к мезенхимальных фенотипа, такие как более высокая миграция и инвазия, антиапоптоз и способностью разрушать внеклеточный матрикс [8], [30] , ЕМТ играет существенную роль в хронических воспалительных заболеваний, фиброзных заболеваний, прогрессирования опухоли и процесса восстановления тканей, особенно в приобретении миграции и инвазии способность злокачественных эпителиальных клеток. Аномальная активность в ЕМТ epith взрослых эпителиальных клеток заторможенных молекулы клеточной адгезии, вызванное пониженной способностью клеточной адгезии, и тем самым позволило опухолевым клеткам распространение в организме, в конечном счете, продвижение метастазирование опухоли [31], [32], [33]. Поэтому EMT считается началом вторжения и метастаз, а также является признаком сильной способностью инвазию и метастазирование опухолевых клеток. H.pylori
индуцирует эпителиально-мезенхимальных перехода от TNF-alpha, индуцирующего белка [34]. Настоящее исследование указывает на то CagA может привести эпителиальные клетки к морфологическим изменениям. Было высказано предположение, что выражение CagA не только достаточно, чтобы нарушить апикальные перекрестки, но и напоминают эпителиально перехода мезенхимального в клетках почки собаки Madin-Darby [35]. Эпителиальные клетки, зараженные бактериями появились различные геномики изменения, а также влияние на ЕМТ маркеров, индуцированных H. пилори
был, вероятно, на cagPaI связанной форме. Данные показали, что эпителиальные переход мезенхимальных (EMT) гены были о связанных вверх или вниз регулируется CagA-положительными H. пилори
штаммов в AGS [36], [37]. Следует отметить, что нормативная сеть CagA с участием в ЕМТ рака желудка по-прежнему должны быть разъяснены.
<Р> Чтобы исследовать конкретный механизм EMT продвигаемой CagA при раке желудка, мы сравнили гены экспрессию соседнего Non- опухолевые ткани и ткани желудка карциномы с помощью иммуногистохимии. Результаты показали, что экспрессия /виментин Twist1 в тканях карциномы были выше, чем соседние ткани неопухолевыми, и его экспрессия в средних /тканей низкой дифференцировки рака выше, чем высокие ткани дифференцировки. Тем не менее, Е-кадгерин и Pdcd4 уменьшилась в процессе эпителиально-мезенхимальных перехода в рак желудка. Интересно, что она существует на отрицательной корреляции к выражению TWIST1 и Pdcd4. Наше исследование показало, гены, связанные с EMT связаны с процессом развития рака желудка, в соответствии с предыдущими исследования наблюдения потеря эпителиального белка и /или приобретение экспрессии белков мезенхимальных имели место при раке желудка. Кроме того, они были соответственно коррелируют с плохо дифференцированной гистологии, продвинутой стадии и неудовлетворительных результатов для пациентов [38]. Кроме того, Pdcd4 недавно обнаружили молекулу, которая играет важную роль на многих биологических процессах, которые могут вызвать заболевание или возникновение и развитие опухоли. Pdcd4 тормозит процесс перевода путем связывания с фактором инициации трансляции eIF4A или eIF4G. Различные индукторы апоптоза стимулируют клетки и активируют экспрессию Pdcd4, что может дополнительно регламентировать Р21, Cdk4, карбоангидразы II и JNK /с-Jun /AP-1. Pdcd4 может ингибировать инвазию связанных с урокиназы рецептора активатора плазминогена экспрессии, инвазию или инфильтрации кровеносных сосудов, и метастазирование; Таким образом, снижение экспрессии Pdcd4 играет важную роль в возникновении опухолей, развитие и прогноз [17], [33], [39], [40]. Таким образом, мы задавались вопросом, если Twist1 и Pdcd4 участвовал в CagA-индуцированный EMT.
<Р> Затем мы обнаружили EMT-ассоциированные факторы транскрипции и маркеры экспрессии в CagA-трансфицированных желудка линий раковых клеток. Наши данные показали, что H. пилори
CagA может повышающего регулировать экспрессию TWIST1 и виментину, но не улитка, и вниз регулируют Е-кадгерина и Pdcd4 в желудочном клеточных линиях (AGS, SGC-7901 и BGC-823). Результаты не были затронуты состояния дифференцировки трансформированных клеток. Хотя мы не наблюдали морфологические изменения CagA-трансфецированных клеток, инвазии и метастазирования способность клеток рака желудка может быть ускорен путем CagA с помощью Transwell вторжения клеток анализа. Это отчасти вызванное функциональной гетерогенности CagA в различных тканях. Таким образом, эффект EMT, индуцированное H. пилори до сих пор
необходимо дополнительно изучить. MIR-21 способствует TGF-β-индуцированный процесс дифференцировки миофибробластов путем охвата Pdcd4. TGF-β индуцированной экспрессии микроРНК-21 в фибробластах и ​​Mir-183 подавляются Pdcd4 и ингибирует TGF-β-индуцированный апоптоз в клетках человека гепатоцеллюлярной карциномы [41], [42]. В то же время, TGF-β регулируется улитка, твист, или ZEB1 и повлияли на EMT и метастазирование [43]. Кроме того, Pdcd4 было обнаружено, что участие в транскрипции тоже. Действительно, СООН-конец Twist1, содержащий основной домен спираль-петля-спираль высказано предположение, что опосредованное прямое взаимодействие с Pdcd4 белками. Таким образом, Pdcd4 взаимодействует с доменом связывания ДНК Twist1 и ингибирует его ДНК-связывающую способность генов-мишеней в клетках рака простаты человека [22] .Therefore, мы дополнительно протестированы, можно ли регулировать Pdcd4 TWIST1 в раковых клетках желудка. Наше исследование показало, что TWIST1 был подавлен высокой экспрессии плазмиды Pdcd4 с помощью ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга, тогда как экспрессия Е-кадгерин был напротив TWIST1 в AGS, SGC-7901 и BGC-823. Экспрессия мРНК улиток была подавлена ​​в AGS и SGC-7901, в то время как preotein выражение не наблюдалось одни и те же изменения. Это может быть из-за сложности синтеза белка. То есть, белок не только регулируется на уровне транскрипции, но также перевод и переворачивать уровня. Это иногда кажется, что мРНК не является прямым показателем уровня белка в клетках. Наконец, мы провели дальнейшие исследования о роли Pdcd4 в CagA-индуцированной эпителиально-мезенхимальных перехода. Эпителиальных клеток желудка трансфицировали с экспрессией CagA плазмиды и Pdcd4 сверхэкспрессии плазмиды одновременно. Восстановление экспрессии Pdcd4 может ингибировать TWIST1 и виментин, и индуцируют Е-кадгерина, которая регулируется CagA, Pdcd4 также подтвердил, что может повлиять на инвазию и метастазирование способность в клетках желудка путем Матригель вторжения анализа. Хотя дополнительные исследования необходимы, чтобы проверить эту гипотезу, мы пришли к выводу, что в основном CagA-индуцированной эпителиально-мезенхимальных перехода частично зависит от регулирования Pdcd4.
<Р> Таким образом, мы показали, что H. пилори
CagA индуцируют экспрессию TWIST1 и EMT в клетках рака желудка путем регулирования Pdcd4 (рис. 6). Мы предоставляем некоторое представление о молекулярной сети рака желудка, вызванного H. пилори
инфекции, и поставить теоретическую основу для Pdcd4 в качестве биологической мишени для диагностики или лечения рака. Будущие модели исследования с участием мыши может привести к лучшему пониманию роли Pdcd4 в H. пилори
-индуцированное EMT рака желудка.

• PLoS ONE: микроРНК-30b, понижающей регуляции в рак желудка, стимулирует апоптоз и подавляет рост опухоли путем прис…
• PLoS ONE: хеликобактер пилори от рака желудка и двенадцатиперстной кишки Show же филогеографического происхождени…