PLoS One: Helicobacter pylori Edistää epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon mahalaukun syövän downregulating ohjelmoidun solukuoleman Protein 4 (PDCD4)

tiivistelmä

Helicobacter pylori
, gram-negatiivinen, mikroaerofiiliset bakteeri havaittu vatsassa, oletetaan liittyvän karsinogeneesin, invaasion ja metastaasin in ruoansulatuskanavan sairaudet. Sytotoksiini liittyvä geeni A (CagA) on onkogeenisessä proteiini H. pylori
joka koodaa Cag patogeenisyyssaarekkeen kehittämiseen liittyvät mahasyövän. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkein biologinen tapahtuma invaasion tai etäpesäkkeen epiteelisolujen. H. pylori
voi edistää EMT ihmisen mahasyövän solulinjoissa, mutta erityinen mekanismit ovat vielä epäselviä. Selvitimme taustalla molekyylitason mekanismi EMT aiheuttamien H. pylori
CagA mahasyövän. Meidän artikkeli, havaitsimme mahasyövän yksilöitä ja viereisen ei-syöpä yksilöitä immunohistokemiallisesti ja todettu lisääntyneen ekspression EMT liittyvien säätelijäproteiinin TWIST1 ja mesenkymaaliset markkeri vimentiinista syövän kudoksissa, kun taas ohjelmoidun solukuoleman tekijä 4 (PDCD4) ja epiteelin merkki E-kadheriinin ilmentymisen pienentynyt syövän yksilöitä. Nämä muutokset liittyivät verran kudoksen maligniteetin. Lisäksi PDCD4 ja TWIST1 tasot liittyivät. Mahalaukun syöpäsolut viljellään kanssa CagA ekspressioplasmidin, CagA aktivoitu TWIST1 ja vimentiinista ilmaisun, ja se esti E-kadheriinin ilmentymisen vähen- tämisessä PDCD4. CagA myös edistänyt liikkuvuutta mahalaukun syöpäsolujen säätelemällä PDCD4. Siten H. pylori
CagA aiheuttama EMT mahalaukun syöpäsoluissa, joka paljastaa uuden signalointireitiksi EMT mahasyövän solulinjoissa.

Citation: Yu H, Zeng J, Liang X, Wang W, Zhou Y, Sun Y, et ai. (2014) Helicobacter pylori
Edistää epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon mahasyövän by downregulating ohjelmoidun solukuoleman Protein 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10,1371 /journal.pone.0105306

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 helmikuu 2014; Hyväksytty: 21 heinäkuu 2014; Julkaistu: 21 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Basic Research Program of China (no. 973 Program 2012CB911202), National Natural Science Foundation of China (nos: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 ja 81170514), Medical Technology Development Program Shandong (ei . 2013WS0209) ja Independent Innovation Foundation Shandongin yliopistossa (no. 2012TS106). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Helicobacter pylori
( H. pylori
) on helix-muotoinen, gram-negatiivinen bakteeri, joka liittyy ruoansulatuskanavan sairaudet, mukaan lukien krooninen gastriitti, mahahaava, mahasyöpä, ja limakalvojen-liittyvässä imukudoksessa lymfooma. H. pylori
on luokiteltu syöpää Maailman terveysjärjestön ja International Agency for Research Cancer (WHO /IARC) vuonna 1994 [1], [2].

H. pylori
geenit hallussaan sytotoksiiniin liittyvän geenin A (CagA) patogeenisuus saari, joka koodaa suuria virulenssin proteiinin CagA ja tyypin IV eritystä järjestelmä (T4SS). CagA toimitetaan isäntä soluihin T4SS ja aiheuttaa syövän muodostumisen ja etenemisen [3]. H. pylori
voi vapauttaa solujen lisääntymistä, vaikuttaa normaaliin apoptoottisen reitin, vaikuttaa solun muoto, poistaa junktionaalinen toimintaa ja helpottaa epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi jälkeen se translokoituu isäntäsolun [4], [5]. H. pylori
efektoriproteiini CagA vaikuttaa useimmat näistä reiteistä. In vivo
kokeet osoittivat, että siirtogeeninen ilmentymä CagA voi aiheuttaa useita pahanlaatuisia kasvaimia hiirissä, mukaan lukien mahalaukun epiteeli- liikakasvu, myelooisen leukemian ja B-solu- lymfoomat, tai mahalaukun polyypit ja adenokarsinoomat mahalaukun ja ohutsuolen [6]. Kuitenkin, molekyylimekanismi H. pylori
CagA vuorovaikutuksessa isännän soluissa on vielä epäselvä.

EMT alun perin tunnustettu piirre alkionkehityksen elintärkeä prosessi morphogenesis alkionkehityksen aikana ja sydämen kehitystä. Kuitenkin, se myötävaikuttaa myös kudosfibroosi, kasvaimen invaasion ja metastaasin. EMT on ominaista useita erillisiä ominaisuuksia, kuten menetys soluadheesion, lisääntynyt solujen liikkuvuuden, resistenssin apoptoosia, ja jotkut ominaisuudet kantasoluja. EMT: n kanssa, epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin määrä aleni ilmaisua ja mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista osoittavat lisääntynyt ilmentyminen. Muita säätelymolekyyleja kuten SNAIL, TWIST ja SLUG osoittavat muuttunut ilme [7], [8], [9]. Onkogeeniset polkuja, jotka voivat aiheuttaa EMT ovat transformoivan kasvutekijän β (TGF-β), Src, Ets, Ras, Wnt /β-kateniinin, Notch, Nukleaaritekijä-KB ja integriini [10], [11], [12].

Infektio ihmisen patogeeninen tekijä H. pylori
oletetaan johtavan EMT, invaasio tai etäpesäke mahasyövän. Esimerkiksi säätelyä matriksimetalloproteinaasi 7 taudinaiheuttajaorganismien H. pylori
osittain riippuvainen gastriinin ja voi olla funktio kehittämisessä mahasyövän, mahdollisesti kautta EMT, jonka välillisesti indusoimalla tasoja liukoista hepariinia sitovat endoteelikasvutekijä [13]. H. pylori
CagA on mukana hyökkäys kasvainsoluja vapauttamalla c-met-reseptori-signalointireitin [14]. Samoin, CagA voi lisätä aktivointi Wnt /β-kateniinin signalointireitin häiritsemällä vakauttamiseen E-kadheriinin-β-kateniinin monimutkainen. Siten CagA on tärkeä rooli kehityksessä suoliston metaplasiaa [15]. Lisäksi, microarray-analyysi viittasi siihen, että fosforylaatio asema CagA voi vaikuttaa ilmentämiseen EMT liittyvien geenien mahasyövän soluihin [16]. Kuitenkin tiedetään vähän mekanismeista, jotka ovat Euroopan EMT aiheuttama CagA.

ohjelmoidun solukuoleman proteiini 4 (PDCD4) paikantuu tumaan lisääntyvissä soluissa [17]. Koska merkittävä transkription jälkeisen kohde mikroRNA (MIR) miR-21, PDCD4 liittyy kasvaimen etenemisen ja ennusteen ihmisen keuhkojen, paksusuolen ja peräsuolen, rinta- ja mahasyövän [18], [19]. Tuumorisuppressorigeenin PDCD4 voivat sitoutua eIF4A tai eIF4G ja translaation inhiboimiseksi. PDCD4 voi säädellä mitogeeniaktivoidun proteiini 4 kinaasi 1 tai urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin reseptorin (uPAR) ilmentyminen estää karsinooma invaasion ja intravasation [20], [21]. PDCD4 voi vaikuttaa myös geenien transkriptiota. Se on vuorovaikutuksessa DNA: ta sitovan domeenin TWIST1 ja estää Y-box sitovan proteiinin 1 ilme [22]. Samoin menetys PDCD4 ilmentyminen liittyy pahanlaatuisiin mahasyövän [23], [24]. Downregulation PDCD4 liittyy kasvaimen erilaistumiseen ruuansulatuskanavassa syöpien [25]. Kuitenkin onko PDCD4 osallistuu EMT aiheuttama CagA mahasyövän ja erityinen mekanismi tarvitaan vielä selventämiseksi.

Täällä selvitimme sääntely EMT liittyvien proteiinien ja PDCD4 ilmentymistä mahasyövässä kudosten ja CagA aktivointi TWIST1 ilmaisun ja estäminen E-kadheriinin ja PDCD4 ilmaisun mahalaukun syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudosnäytteiden

tutkimus hyväksynyt eettinen komitean Shandong University School of Medicine, ja kaikki näytteet ja tiedot kerättiin kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Mahakasvaimen kudokset ja niiden yhteensovitettujen kuin syöpäkudokset kerättiin 30 leikkauksen aikana Qilu sairaalan Shandong University (Jinan, Kiina) vuodesta 2010 vuoteen 2012. Kukaan potilaista ei ollut saanut adjuvanttihoitoa tai sädehoidon ennen leikkausta. Diagnoosi mahasyöpä oli histopatologisesti vahvistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä.

Soluviljely ja transfektio

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat (AGS, BGC-823 ja SGC-7901) saatiin Kiinasta Academia Sinica Cell Repository (Shanghai). Soluja inkuboitiin suositellun median ja kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO _{2 37 ° C: ssa ilman antibiootteja. SGC-7901-soluja ja BGC-823-soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ja AGS soluja viljeltiin F12-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Media ja FBS ostettiin Invitrogen (USA). Sitten solut transfektoitiin lyhytaikaisesti plasmideilla pCDNA3.1 tai pCDNA3.1-CagA (lahja tri Yongliang Zhu, Zhejiangin yliopisto, Kiina) ja pEGFP-C1 tai pEGFP-C1-PDCD4 (rakennettu ja saatiin tri Youhai Chen , Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) käyttäen X-treme GENE HP transfektioreagenssia (Roche Diagnostics, Saksa) mukaan valmistajan protokollia.}

RNA: n eristys, käänteinen transkriptio ja qRT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, USA). Käänteinen transkriptio mukana Superscript III First Strand Synthesis Kit (Invitrogen). Geenien ilmentymistä havaittiin käyttämällä Quantitative real-time PCR SYBR Esiseos Ex Taq (Takara, Kiina) ja normalisointi mukana 2 ^{- △△ ct menetelmä suhteessa P-aktiini. Alukesekvenssit olivat PDCD4, sense, 5'-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 'ja antisense, 5'-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3'; E-kadheriinin, sense, 5'-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 'ja antisense, 5'-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3'; CagA, sense, 5'-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 'ja antisense, 5'-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3'; ja TWIST1, sense, 5'-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 'ja antisense, 5'-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3'; vimentiinin, sense, 5'-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 'ja antisense, 5'-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3'; SNAIL, sense, 5'-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 'ja antisense, 5'-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3'; β-aktiini, sense, 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 'ja antisense, 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'.}

Western blot-analyysi

Proteiini uutettiin näytteistä ja erotettiin SDS-PAGE , sitten siirrettiin PVDF-membraaneille (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), joka oli estetty välittömästi 5% rasvatonta maitoa TBST, joka sisälsi 1% Tween-20: ssa 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen, kun on pesty fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) 3 kertaa, membraaneja inkuboitiin vasta-aineiden PDCD4 (1:500; Cell Signaling Technology, USA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, USA), SNAIL (1:

• PLoS ONE: miR-30b, alassäädetty mahasyövän, Edistää Apoptoosi ja vaimentaa tuumorikasvun Targeting plasminogeeniaktivaattori estäjä-1
• PLoS ONE: Helicobacter pylori mahalaukun syövän ja pohjukaissuolihaava Näytä Sama Phylogeographic Alkuperä Andien alueella Kolumbia