PLoS ONE: Mycophenolsäure Hemmt Migration und Invasion von Magenkrebszellen über mehrere Molecular Pathways

Abstrakt

Mycophenolsäure (MPA) ist das Produkt metabolisiert und aktive Element von Mycophenolatmofetil (MMF), die zur Verhinderung der akuten Transplantatabstoßung wurde weit verbreitet. MPA hemmt potent Inosinmonophosphatdehydrogenase (IMPDH), die in vielen Tumoren und MPA hochreguliert ist ist bekannt, dass Krebszellproliferation sowie Fibroblasten und Endothelzellen-Migration hemmen. In dieser Studie haben wir gezeigt, zum ersten Mal die MPA antimigratory und Anti-Invasion Fähigkeiten von MPA empfindlichen AGS (Magenkrebs) Zellen. Genomweite Expressionsanalysen unter Verwendung von Illumina gesamten Genoms identifiziert Microarrays 50 Gene mit ≥2-fach Änderungen und 15 Gene mit > 4-fach Änderungen und mehrere in der Zellmigration beteiligt molekularen Wege. Real-time RT-PCR ausgewählter Gene analysiert bestätigt auch die Expressionsunterschiede. Darüber hinaus analysiert gezielte Proteomik wurden mehrere Proteine, die durch MPA Behandlung verändert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass MPA Magenkrebs Zellmigration durch Herunterregulierung von einer großen Anzahl von Genen ( PRKCA
, DOCK1
, INF2, HSPA5, LRP8
und moduliert PDGFRA
) und Proteine ​​(PRKCA, AKT, SRC, CD147 und MMP1) mit promigratory Funktionen sowie hoch~~POS=TRUNC von einer Reihe von Genen, die mit antimigratory Funktionen ( ATF3
, SMAD3
, CITED2
und CEAMCAM1
). Doch ein paar Gene, die Migration fördern kann ( CYR61
und NOS3
) wurden hochreguliert. Daher insgesamt antimigratory Rolle der MPA auf Krebszellen spiegelt eine Balance zwischen promigratory und antimigratory durch MPA Behandlung beeinflusst Signale

Citation. Dun B, Sharma A, Teng Y, Liu H, Purohit S, Xu H, et al . (2013) Mycophenolsäure Hemmt Migration und Invasion von Magenkrebszellen über mehrere Molecular Pathways. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10.1371 /journal.pone.0081702

Editor: Ying Xu, University of Georgia, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 27. Juli 2013; Akzeptiert: 15. Oktober 2013; Veröffentlicht: 15. November 2013

Copyright: © 2013 Dun et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Studie wurde durch Mittel aus der Georgia Regents Universität unterstützt. JXS wird teilweise von der Georgia Research Alliance als hervorragenden Gelehrten unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

die meisten soliden Tumoren sind weitgehend heilbar, wenn sie diagnostiziert werden und vor ihrer Verbreitung über den ursprünglichen primären Standort behandelt. Sobald jedoch Tumore auf andere Standorte verteilt, sie in der Regel sehr morbide und wahrscheinlich fötalen werden. Daher ist es wichtig, die anfängliche Verbreitung und verhindern sekundäre Ausbreitung zu begrenzen. Invasion und Metastasierung sind zwei Hauptarten von Tumorverbreitung, jeweils angetrieben durch unterschiedliche Mechanismen und führt zu deutlichen therapeutischen Herausforderungen [1]. Jedoch erfordern beide Formen der Verbreitung Zellbewegung von den primären Seiten an den sekundären Standort sowie Wiederherstellung und das Überleben der Tumorzellen in den sekundären Positionen. Diese Prozesse werden über eine Kaskade von molekularen Veränderungen innerhalb der Krebszellen durchgeführt. Obwohl die molekulare Migration zugrunde liegenden Zellmechanismus hat neue therapeutische Ansätze können ausgiebig untersucht worden bieten, neue Einblicke in die molekularen Ereignisse. Tatsächlich Hemmung der Moleküle, die die Zellmigration und Hochregulierung von Molekülen fördern die Zellmigration durch pharmakologische Interventionen inhibieren, ein wichtiger Bestandteil der weaponries werden, Krebs zu bekämpfen. Entwicklung oder Umnutzung von zusätzlichen Medikamenten, die Migration zu inhibieren und Invasion ist ein wichtiger laufenden Bemühungen für Krebstherapeutika.

Mycophenolatmofetil (MMF) hat sich für die Verhinderung der akuten Transplantatabstoßung in Niere, Herz und Leber-Transplantation [genehmigt ,,,0],2,3]. MMF ist der Morpholinoethylester Prodrug von Mycophenolsäure (MPA), die ein potenter Inhibitor von uncompetitive Inosinmonophosphatdehydrogenase ist (IMPDH), die geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym für die De-novo-Synthese von
Guanosinnukleotiden [4,5 ], die eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation und andere Zellfunktionen einschließlich der DNA-Replikation, RNA und Proteinsynthese und zelluläre Signal [6] spielen. Folglich MPA Blöcke T und B-Lymphozyten-Proliferation und klonaler Expansion und verhindert die Erzeugung von zytotoxischen T-Zellen und anderen Effektor-T-Zellen. Andere Mechanismen können auch bei der Verhinderung von Allotransplantat-Abstoßung auf die Wirksamkeit von MPA bei. Durch Abbau von Guanosinnukleotiden, MPA kann Glykosylierung und die Expression verschiedener Adhäsionsmoleküle unterdrücken, wodurch die Rekrutierung von Lymphozyten und Monozyten in Entzündungsstellen und Transplantatabstoßung abnimmt [5].

Da IMPDH-Expression signifikant hochreguliert in vielen Tumorzellen [7,8], es ist daher potentiell ein Ziel für die Krebstherapie zusätzlich Chemotherapie immunsuppressive. MPA /MMF wurde berichtet Krebszellproliferation zu inhibieren und Apoptose in vielen Krebszellen [9-14]. MPA /MMF hat auch zur Hemmung der Migration von Fibroblasten-Zellen berichtet worden [15] und menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) [16]. Es ist jedoch nicht bekannt, ob MPA, die Migration und Invasion von Krebszellen Kapazität verändern können. Darüber hinaus bleiben die genauen Migration Signalwege und Effektormoleküle MPA-Aktivitäten zugrunde liegenden schwer fassbar.

In dieser Studie haben wir erstmals gezeigt, dass MPA signifikant die Migration und Invasion Fähigkeit von AGS-Zellen ändert und wir dann die Genexpression und Proteomik-Technologien verwendet, um Gene und Proteine ​​zu identifizieren, diese Funktionen zu Grunde liegen.

Werkstoffe und Methoden

die Zelllinien, Reagenzien und Antikörper

Zwei Magenkrebszelllinien (AGS und Hs746T) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten. Beide Zelllinien wurden in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten /ml Penicillin und 100 ug /ml Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO2 gezüchtet. MPA wurde von VWR gekauft. Die CD147 wurde das Integrin beta5 Antikörper aus Abcam, die GAPDH und ICAM-1antibodies von Santa Cruz erworben; Src, Akt und p-Akt (Ser473) Antikörper von Cell Signaling.

In-vitro-Trans gut Migration und Invasion Assays

Die Zellmigration mit dem Transwell (Costar) System durchgeführt wurde, die Zellen durch 8-um Porengröße Polycarbonatmembran wandern können. Kurz gesagt, wurden die Serum-ausgehungert AGS oder HS746T Zellen in die obere Kammer zugegeben (5 × 104 Zellen pro Einsatz) und DMEM Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen von MPA (1 ug /ml, 1,5 ug /ml und 2 ug /ml) wurde als ein benutztes chemische Lockstoffe in der unteren Kammer. Nach Inkubation bei 37 ° C für 8 Stunden wurden die Zellen in der unteren Kammer wurden in Methanol und gefärbt mit 0,2% Kristallviolett fixiert. Nummern der wandernden Zellen in neun zufällig ausgewählten Feldern aus Dreifachkammern wurden in jedem Experiment unter einem Phasenkontrastmikroskop gezählt. Das invasive Potential der Zellen wurde eine Matrigel-beschichteten modifizierten Boyden-Kammer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) analysiert, wie zuvor beschrieben [17]. DMEM MPA enthielt, wurde in die untere Kammer gegeben. Nach Inkubation bei 37 ° C für 24 Stunden wurde die Anzahl der Zellen, die an der unteren Seite der oberen Kammer eingedrungen gezählt.

Micorarray Experimente

Gesamt-RNA aus Zellen extrahiert AGS wurde unter Verwendung eines magnatic Perlen RNA-Extraktions-Kits (Jinfiniti Biosciences, Augusta, GA). Genexpressionsprofile wurde mit der menschlichen ausgeführt Illumina HumanHT-12 v4 BeadChip (Illumina, San Diego, CA). Ein Aliquot von 200 ng Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Illumina TargetAmp-Nano-Markierungskits mit einem Oligo-dT-Primers in doppelsträngige cDNA (ds-cDNA) umgewandelt, um eine T7-RNA-Polymerase-Promotor (Genset, St. Louis, MO) enthielt. In vitro
Transkription wurde auf den obigen ds-cDNA durchgeführt, die Enzo RNA Transkript Labeling Kit verwendet wird. Biotin-markierte cRNA wurde unter Verwendung eines RNeasy-Affinitätssäule (Qiagen) gereinigt und fragmentierten zufällig Größen im Bereich von 35 bis 200 Basen für 35 min bei 94 ° C inkubiert. Die Hybridisierungslösungen enthielten 100 mM MES, 1 M Na ^{+, 20 mM EDTA und 0,01% Tween 20. Die Endkonzentration von fragmentierten cRNA betrug 0,05 ug /ul in Hybridisierungslösung. Target für die Hybridisierung wurde durch Vereinigen von 40 ul fragmentierten Transkript die mit beschallter Heringssperma-DNA (0,1 mg /ml) hergestellt, BSA und 5 nM Kontroll-Oligonukleotid in einem Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl, 10 mM Tris.HCl (pH 7,6) und 0,005 % Triton X-100. Target wurde in einem Illumina Hybridisierungsofen bei 45 ° C für 16h hybridisiert. Chips wurden dann bei 50 ° C mit strengen Lösung, dann wieder bei 30 ° C mit nicht-stringenten Waschungen gewaschen. Die Arrays wurden dann mit Streptavidin-Cy3 gefärbt. Die Microarray-Daten sind MIAME konform und haben in NCBI Gene Expression Omnibus und sind über GEO Serie Zugangsnummer GSE46671.}

Real-time RT-PCR-Analyse

Eine aliquote Menge von Gesamt-RNA hinterlegt worden ( 2 ug pro Probe) wurden in 96-Well-Platten angeordnet und dann umgewandelt in cDNA eine High Capacity cDNA Reverse Transkription-Kit (Applied Biosystems) und einen PTC-100TM programmierbaren Thermoregler (MJ Research, Inc.) verwendet wird. Die cDNA-Produkte wurden für die quantitative Echtzeit-PCR unter Verwendung von ready-to-use TaqMan Genexpression Assays von Applied Biosystems verwendet. Fünf Referenzgene mit relativ konstanten Ausdruck (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 und MRPL19) wurden zur Normalisierung der RNA-Konzentration verwendet. Real-time PCR wurde mit 96x96 Fluidigm Expression Chips durchgeführt. Standard thermischen Wechselzustand (10 min bei 95 ° C, 40 Zyklen für 15 Sekunden bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C) wurde für alle Gene verwendet. Alle Proben wurden auf der gleichen Platte analysiert, und jede Probe wurde in Doppelbestimmung analysiert.

Western-Blot

Die Zellen wurden in PBS geerntet und erneut suspendiert. Nach Zentrifugation bei 2000 Upm für 5 min wurde das Pellet für 30 min in eiskaltem M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent enthaltend 1% Halt Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Thermo Scientific) lysiert. Der Überstand wurde nach 10 min Zentrifugation bei 12000rpm gesammelt, erreicht durch Spektrophotometrie mit Probenladepuffer für 10 min bei 95ᵒC denaturiert und für die zukünftige Verwendung bei 4 ° C gelagert. Proteine ​​wurden durch 10% SDS-Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt und auf PVDF-Membran überführt (Bio-Rad), und mit primärem Antikörper von Interesse bei 4 ° C über Nacht inkubiert. Die geeignete Meerrettich-konjugiertem sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 10000 in Blockierungspuffer (3% BSA-TBST) wurde zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Antikörper wurden in 3% BSA-TBST verdünnt. Immunoblots wurden unter Verwendung von ECL Chemilumineszenzreagenz (Thermo Scientific) entwickelt.

Durchflusszytometrie

Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt und zweimal in PBS gewaschen. Etwa 1x10 ^{6 Zellen mit 1 ug anti-CD147, anti-ICAM-1- und anti-Integrin beta 5-Antikörper für 30 Minuten inkubiert, gewaschen mit PBST zweimal, dann mit einem sekundären Antikörper inkubiert, konjugiert mit TRITC oder APC für 30min, und zweimal mit PBST gewaschen. Die durchflusszytometrische Analysen wurden auf einem FACScaliburTM ausgeführt Durchflusszytometer mit CELLQuestTM Software (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).}

Luminex Assay

MMP-Proteine ​​in Kulturmedium wurden unter Verwendung gemessen Luminex-Kits von Millipore Company (Billerica, MA, USA) nach der Empfehlung des Herstellers. Zellkulturmedium (1:10 Verdünnung) wurde mit dem Antikörper-gekoppelten Mikrokügelchen inkubiert und dann mit biotinylierter Detektionsantikörper vor der Zugabe von Streptavidin-Phycoerythrin. Die erfassten bead-Komplexe wurden mit dem FLEXMAP 3D-System (Luminex, Austin, TX) gemessen. Median der Fluoreszenzintensität (MFI) wurde für die Berechnung der Proteinkonzentrationen gesammelt und verwendet werden.

Die statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung der R Sprache und Umgebung für statistische Berechnungen (www.r-Projekt durchgeführt. org). Die Vergleiche zwischen den Gruppenmittel wurden durch ANOVA gemacht (für ≥ 3 Gruppen), gefolgt von paarweise Vergleiche mit Bonferroni Post-hoc-Tests. Die statistische Signifikanz der Unterschiede wurde bei P <gesetzt; 0,05.

Die Lumi-Paket wurde auf Vorprozess Microarray-Daten verwendet. Differentielle Expression Analysen wurden unter Verwendung des limma Paket aus dem Bioconductor Projekt durchgeführt [18]. Wir benutzten die falsche Entdeckung Rate (FDR) für mehrere Tests einzustellen [19]. Eine Kombination aus eingestellt p-Wert und Absolutwert-fache Veränderung (FC) wurden für die Auswahl der differentiell exprimierten Gene verwendet.

Die Clusteranalyse wurde für die Gruppierung der differentiell exprimierten Gene aufweisen, ähnliche Expressionsmuster mit dem HPCluster Programm durchgeführt [20]. Die Bioconductor Paket "GoStats" wurde zum Testen der Vereinigung der Gene Ontology Begriffe (biologische Prozesse) zu den differentiell exprimierten Genen verwendet [21] Ein p-Wert auf dem hypergeometric Test auf der Grundlage berechnet wurde, ob die Anzahl von Genen, die mit dem Begriff verbunden sind, bewerten als größer erwartet. Die p-Werte wurden erhalten für mehrere Tests eingestellt, um den FDR verwenden. Die Liste Gen wurde auch vorkompilierte KEGG Wege analysiert. Wir haben das "spia" (Signalweg Wirkungsanalyse) Paket Wege durch die beobachteten Veränderungen in der Genexpression [22] beeinflusst zu identifizieren. Netzwerkanalyse wurde durchgeführt, molekulare Interaktion Netzwerke unter Verwendung der STRING-Datenbank zu erstellen [23]. Die Netze wurden in einfache Interaktion Format Cytoscape zur Visualisierung [24] eingeführt.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Resveratrol das Wachstum von Magenkrebs Hemmt durch Induzierung G1 Phase Arrest und Seneszenz in einer Sirt1 Abhängiger Manner
• PLoS ONE: eine Community-basierte, Fall-Kontroll-Studie zur Bewertung Mortalitätsreduktion von Magenkrebs durch endoskopische Screening in Japan