PLoS ONE: Mikofenolna kiselina inhibira migraciju i invaziju želučane stanica raka preko višestrukih Molecular Pathways

Sažetak pregled

Mikofenolna kiselina (MPA) je metabolizirati proizvod i aktivni element mikofenolat mofetil (MMF), koji se široko koristi za prevenciju akutnog odbacivanja presatka. MPA potencijalno inhibira inozin monofosfat dehidrogenaze (IMPDH), koji je doreguliran u mnogim tumorima i MPA je poznato da inhibira proliferaciju stanica raka, kao i fibroblasta i migraciju endotelnih stanica. U ovom istraživanju, pokazali smo prvi put MPA je antimigratory i anti-invazijska sposobnostima MPA osjetljiv AGS (rak želuca) stanica. Genom-wide izraz analizira pomoću Illumina genoma Microarrays identificirane 50 gena s ≥2 mnogostrukost promjene i 15 gena s > 4 puta preinake i više molekularnih puteva upleten u migraciji stanica. U realnom vremenu RT-PCR analize gena odabranih potvrdio ekspresije razlike. Osim toga, ciljano proteomic analize identificirano je nekoliko proteina promijenjeni od strane MPA liječenja. Naši rezultati pokazuju da MPA modulira migraciju želučane stanica raka kroz nizvodnom regulacijom velikog broja gena ( PRKCA
, DOCK1 Netlogu, info2, HSPA5, LRP8 Netlogu i PDGFRA
) i proteina (PRKCA, Akt, SRC, CD147 i MMP1) s promigratory funkcija kao i up-regulaciji brojnih gena s antimigratory funkcije ( ATF3 pregled, Smad3 pregled, CITED2 pregled i CEAMCAM1 pregled). Međutim, nekoliko gena koji mogu promiču migracije ( CYR61 pregled i NOS3 pregled) su up-regulirana. Prema tome, ukupna antimigratory uloga MPA-a na stanice raka odražava ravnotežu između promigratory i antimigratory signala pod utjecajem MPA tretman pregled

Izvor:. Dun B, Sharma A, Teng Y, Liu H, Purohit S, Xu H, et al , (2013) Mikofenolna kiselina inhibira migraciju i invaziju želučane stanica raka preko višestrukih Molekularna putove. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10,1371 /journal.pone.0081702 pregled

Urednik: Ying Xu, Sveučilište u Georgiji, Sjedinjene Američke Države

Primljeno: 27. srpnja 2013; Prihvaćeno: 15. listopada 2013; Objavljeno: 15. studeni 2013 pregled

Copyright: © 2013 Dun sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Studija je potpomognut sredstvima iz Regents Sveučilišta Georgia. JXS djelomično podržan od strane Georgia Research Alliance kao ugledni znanstvenik. Davatelj financijskih sredstava nije imao ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Većina solidnih tumora su u velikoj mjeri izlječiv ako se dijagnosticira i liječi prije širenje izvan početne primarnom mjestu. Međutim, nakon što su tumori proširio na druge lokacije, oni obično postaju vrlo morbidan i vjerojatno fetusa. Dakle, bitno je da se ograniči početno širenje i spriječiti sekundarne širenje. Invazija i metastaze su dva glavna načina tumora širenje, svaka vođeni različitim mehanizmima i dovode do različitih terapijskih izazove [1]. Međutim, oba oblika širenja zahtijevaju kretanje stanice iz primarnog mjestima na sekundarnom položaju, kao i ponovnog uspostavljanja i preživljavanje tumorskih stanica u sekundarnim lokacijama. Ovi procesi su ostvareni putem kaskade molekulskih promjena u stanicama karcinoma. Iako je molekularni mehanizam migracija osnovna ćelija je opsežno studirao, novi uvid u molekularne događaja može osigurati novih terapijskih pristupa. Doista, inhibicija molekula koje promiču migraciju stanica i up-regulacije molekule koje inhibiraju migraciju stanica kroz farmakoloških intervencija postali su važan dio weaponries za borbu protiv raka. Razvoj ili izmjena svrhe dodatnih lijekova koji inhibiraju migraciju i invaziju je glavni u tijeku napori za terapijskim sredstvima protiv raka. Pregled

Mikofenolat mofetil (MMF) je odobren za prevenciju akutnog odbacivanja transplantata u bubrega, srca i jetre za transplantaciju [ ,,,0],2,3]. MMF je morfolinoetil ester predlijek mikofenolne kiseline (MPA), koji je jak nekompetitivni inhibitor inozin monofosfat dehidrogenaze (IMPDH) je enzim koji ograničava brzinu na de novo pregled sinteza gvanozin nukleotida [4,5 ], koji igraju ključnu ulogu u staničnoj proliferaciji i drugih staničnih funkcija, uključujući replikaciju DNA, sintezu RNA i proteina i stanične signalizacije [6]. Prema tome, MPA blokira T i B limfocita proliferaciju i klonalne ekspanzije, te sprječava nastajanje citotoksičnih T stanica i drugih efektor T stanicama. Drugi mehanizmi također može doprinijeti efikasnosti MPA u sprečavanju odbacivanja transplantata. Kroz osiromašeni gvanozin nukleotida, MPA može suzbiti glikozilacije i ekspresiju nekoliko adhezijskih molekula, čime se smanjuje zapošljavanje limfocita i monocita u mjestima odbacivanja upale i graft [5]. pregled

Budući IMPDH ekspresija značajno je povećana u mnogim tumorskim stanicama [7,8], to je stoga potencijalno meta za terapiju raka uz imunosupresivna kemoterapije. MPA /MMF je izvijestio da inhibira proliferaciju stanica raka i potiče apoptozu u mnogim stanicama raka [9-14]. MPA /MMF također inhibira migraciju stanica fibroblasta [15] i humanih endotelijalnih stanica pupčane vene (HUVEC) [16]. Međutim, to je nepoznato da li MPA može promijeniti migraciju i invaziju sposobnost stanica raka. Nadalje, precizne migracija signalne putove i efektorske molekule temeljne djelatnosti MPA ostaju nedostižan. pregled

U ovoj studiji, prvo smo pokazali da MPA bitno mijenja migraciju i invaziju sposobnost AGS stanica te smo tada koristili ekspresiju gena i proteomsku tehnologije za identifikaciju gena i proteina u pozadini tih funkcija. pregled

Materijali i metode

stanične linije, reagensi i antitijela

Dvije stanične linije raka želučani (AGS i Hs746T) dobivene su od American Type Culture Collection (ATCC). Obje stanične linije uzgojene su u RPMI 1640 mediju koji sadrži 10% fetalni goveđi serum, 100 jedinica /ml penicilina i 100 ug /ml streptomicina, na 37 ° C s 5% CO2. MPA je kupljen od tvrtke VWR. CD147, integrin beta5 antitijelo je kupljen od Abcam, na GAPDH i ICAM-1antibodies iz Santa Cruz; Src, Akt i p-Akt (Ser473) antitijela iz staničnu signalizaciju. pregled

In vitro migracija i invazija testovi trans-i pregled

migracija stanica je izvedena sa transjažice (Costar) sustav, koji omogućava stanicama da migriraju kroz 8 um veličina pora polikarbonatnu membranu. Ukratko, serum izgladnjele AGS ili HS746T stanice su dodani u gornju komoru (5 × 104 stanica po umetku), i DMEM medij s različitom koncentracijom MPA (1 ug /ml, 1.5 ug /ml i 2 ug /ml) korišten je kao kemoatraktant u donje komore. Nakon inkubacije na 37 ° C kroz 8 sati, stanice u donjoj komori su fiksirani u metanolu i oboje sa 0,2% kristalno ljubičastog. Brojevi migracije stanica u devet slučajno odabranih područja iz trostrukih komora broje u svakom eksperimentu pod faznokontrastne mikroskopom. Je invazivni potencijal stanica su analizirani pomoću Matrigelom obložene modificiranog Boyden Chamber (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) kao što je prethodno opisano [17]. DMEM MPA doda se iz donje komore. Nakon inkubacije na 37 ° C tijekom 24 sata, a broj stanica koje su izvršile invaziju na donjoj strani gornje komore je broje. Pregled

Micorarray eksperimenti pregled

Ukupna RNA se ekstrahira iz stanica AGS upotrebom magnatic kuglice RNA ekstrakcija kit (Jinfiniti bioznanosti, Augusta, GA). Ekspresije gena profiliranje izvršena je humani Illumina HumanHT-12 V4 BeadChip (Illumina, San Diego, CA). Alikvot 200ng ukupne RNA se prevede u dvolančane cDNA (ds-cDNA) upotrebom Illumina TargetAmp-Nano kita za označavanje s oligo-dT primera koji sadrži promotor T7 RNA polimeraze (Genset, St. Louis, MO). In vitro pregled transkripcija izvedena na gore ds-cDNA pomoću Enzo RNA prijepis kita za označavanje. Biotinom označen cRNA se pročišćava pomoću afinitetne kolone RNeasy (Qiagen), a fragmentirana nasumično veličina u rasponu od 35-200 baza inkubacijom na 94 ° C tijekom 35 min. Hibridizacijske otopina sadrži 100 mM MES, 1 M Na ^{+, 20 mM EDTA, 0,01% Tween 20. Konačna koncentracija fragmentiranog cRNA je 0,05 ug /ul u otopini za hibridizaciju. Meta za hibridizaciju je proizvedena miješanjem 40 ul fragmentirane transkripta s obrađen ultrazvukom DNA riblje sperme (0,1 mg /ml), BSA i 5nM kontrolni oligonukleotid u puferu koji sadrži 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH7.6), i 0.005 % Triton X-100. Meta hibridizira 16 sati na 45 ° C u Illumina hibridizacijskoj pećnici. Čipovi zatim isprani pri 50 ° C uz strogi otopinom, a zatim ponovno na 30 ° C s ne-strogim ispiranja. Nizovi su zatim obojene sa streptavidin-Cy3. Podaci microarray su MIAME popustljiv i položene u NCBI Gene Expression Omnibus i dostupni su putem pristupnog broja GEO serija GSE46671.}

real-time RT-PCR analiza Netlogu

alikvot ukupne RNA ( 2 ug po uzorku) su odjeveni u 96 jažica, a zatim pretvoriti u cDNA pomoću visokog kapaciteta cDNA reverznom transkripcijom Kit (Applied Biosystems) i PTC-100TM programabilni toplinsku kontroler (MJ Research, Inc). CDNA produkti su korišteni za kvantitativnu real-time PCR koristeći spreman za korištenje TaqMan genske ekspresije analize iz Applied Biosystems. Pet referentni gene s relativno stalnom izraz (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 i MRPL19) korišteni su za normalizaciju koncentracije RNA. Real-time PCR je izvedena s 96x96 Fluidigm Ekspresija čips. Standardna toplinske promjene stanja (10 min na 95 ° C, 40 ciklusa 15 sekundi pri 95 ° C, 1 min na 60 ° C) se koristi za sve gene. Svi uzorci su analizirani na istoj ploči, a svaki uzorak je analiziran u duplikatu. pregled

Western blotting pregled

Stanice su sakupljene i ponovno suspendirane u PBS-u. Nakon centrifugiranja na 2000 okr./min tijekom 5 minuta, talog se liziraju u ledeno hladnu M-PO sisavaca protein ekstrakcije Reagens koji sadrži 1% zastoja proteaze i fosfataze Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific) tijekom 30 minuta. Supernatant je sakupljen nakon 10 min centrifugiranja na 12000rpm, jednaka spektrofotometrijski, denaturiran sa uzorkom pufera za nanošenje tijekom 10 minuta na 95ᵒC i pohranjeni na 4 ° C za buduću uporabu. Proteini su odvojeni od 10% SDS-poliakrilamidnim gelovima i preneseni na PVDF membranu (Bio-Rad) i inkubiraju s primarnim antitijelima od interesa, na 4 ° C preko noći. Odgovarajući hrena-konjugiranih sekundarnih antitijela u razrjeđenju 1: 10000 u puferu za blokiranje (3% BSA-TBST) je dodan i inkubiran tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Svi Antitijela su razrijeđena u 3% BSA-TBST. Imunoblot bile razvijene korištenjem ECL reagensa (hemiluminiscenciju Thermo Scientific). Pregled

Protočna citometrija pregled

Stanice su tripsinizirane i dva puta isprane u PBS. Približno 1x10 ^{6 stanice su inkubirane s 1}

• PLoS ONE: Resveratrol inhibira rast raka želuca by Izazivanje G1 faza boravišta i starenje u Manner
• PLoS ONE: zajednica koja se temelji, case-control studija Ocjenjivanje Smrtnost Smanjenje od raka želuca by endoskopske Screening u Japan