PLoS ONE: Mycofenolzuur Remt Migratie en invasie van maagkanker cellen via Multiple Molecular Pathways

Abstract

Mycofenolzuur (MPA) is de gemetaboliseerd product en actieve element van mycofenolaatmofetil (MMF), die op grote schaal is gebruikt voor de preventie van acute transplantaatafstoting. MPA krachtige remmer van inosine monofosfaat dehydrogenase (IMPDH) dat opwaarts gereguleerd in veel tumoren en MPA is die kanker celproliferatie en fibroblasten en endotheliale celmigratie remmen. In deze studie hebben we aangetoond voor het eerst MPA antimigratory en anti-invasie mogelijkheden van MPA-gevoelige AGS (maagkanker) cellen. Genoom-brede expressie analyse met behulp van Illumina hele genoom microarrays geïdentificeerd 50 genen met ≥2 fold veranderingen en 15 genen met > 4-voudige wijzigingen en meerdere moleculaire pathways betrokken bij celmigratie. Real-time RT-PCR-analyses van geselecteerde genen bevestigde ook de verschillen expressie. Bovendien gerichte proteomics analyses identificeerden verschillende eiwitten veranderd door MPA behandeling. Onze resultaten geven aan dat MPA moduleert maagkanker cel migratie door middel van down-regulatie van een groot aantal genen ( PRKCA
, DOCK1
, INF 2, HSPA5, LRP8 Kopen en PDGFRA
) en eiwitten (PRKCA, AKT, SRC, CD147 en MMP1) met promigratory functies en up-regulatie van een aantal genen met antimigratory functies ( ATF3
, Smad3
, CITED2 Kopen en CEAMCAM1
). Echter, een paar genen die de migratie kunnen bevorderen ( CYR61 Kopen en NOS3
) werden up-gereguleerd. Daarom is de totale antimigratory rol MPA op kankercellen weerspiegelt een balans tussen promigratory en antimigratory signalen beïnvloed door MPA behandeling

Visum:. Dun B, A Sharma, Teng Y, Liu H, Purohit S, Xu H, et al . (2013) Mycofenolzuur Remt Migratie en invasie van maagkanker cellen via meerdere moleculaire pathways. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10.1371 /journal.pone.0081702

Editor: Ying Xu, Universiteit van Georgia, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 27 juli 2013; Aanvaard: 15 oktober 2013; Gepubliceerd: 15 november 2013

Copyright: © 2013 Dun et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Het onderzoek werd ondersteund door fondsen van de Georgia Regents University. JXS wordt gedeeltelijk ondersteund door de Georgia Research Alliance als een eminent geleerde. De financier had geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

de meeste solide tumoren zijn grotendeels genezen als ze worden gediagnosticeerd en behandeld voordat verspreiding na de eerste primaire site. Echter, zodra tumoren die verspreid naar andere locaties, zijn ze meestal worden zeer morbide en waarschijnlijk de foetus. Daarom is het essentieel om de eerste verspreiding beperken en te voorkomen secundaire verspreiding. Invasie en metastase zijn twee belangrijke vormen van tumor disseminatie, elk aangedreven door verschillende mechanismen en leiden tot verschillende therapeutische uitdagingen [1]. Zowel vormen van verspreiding vereist cel beweging van de primaire locaties aan de secundaire locatie en herstel en de overleving van tumorcellen in de secundaire locaties. Deze processen worden uitgevoerd via een cascade van moleculaire veranderingen in de kankercellen. Hoewel het moleculaire mechanisme dat ten grondslag celmigratie uitgebreid onderzocht kunnen nieuwe inzichten in de moleculaire gebeurtenissen nieuwe therapeutische benaderingen. Inderdaad, remming van de moleculen die celmigratie up-regulatie van moleculen die celmigratie verminderen door farmacologische middelen te bevorderen, zijn een belangrijk onderdeel van de weaponries voor kankerbestrijding worden. Ontwikkeling of herbestemming van de extra middelen die de migratie te remmen en invasie is een belangrijke voortdurende inspanning voor kanker geneeswijze.

mycofenolaatmofetil (MMF) is goedgekeurd voor de preventie van acute afstoting in de nieren, het hart en de lever transplantatie [ ,,,0],2,3]. MMF is de prodrug morfolino-ethylester van mycofenolzuur (MPA), dat een krachtige concurrerende remmer van inosine monofosfaat dehydrogenase (IMPDH), de snelheidsbeperkende enzym voor
de novo synthese van guanosinenucleotiden [4,5- ], die een cruciale rol spelen in celproliferatie en andere cellulaire functies, waaronder DNA-replicatie, RNA en eiwitsynthese en cellulaire-signalering [6]. Bijgevolg MPA blokken T en B lymfocyten proliferatie en klonale expansie en voorkomt de vorming van cytotoxische T-cellen en andere effector T cellen. Andere mechanismen kunnen ook bijdragen aan de effectiviteit van MPA in het voorkomen transplantaatafstoting. Door depletie van guanosine nucleotiden, kunnen MPA glycosylering en de expressie van verschillende adhesiemoleculen onderdrukken, waardoor de rekrutering van lymfocyten en monocyten in afnemende ontstekingsplaatsen en transplantaatafstoting [5].

Omdat IMPDH expressie aanzienlijk opwaarts gereguleerd in vele tumorcellen [7,8] Het is derhalve mogelijk een doelwit voor kankertherapie naast chemo immunosuppressieve. MPA /MMF gerapporteerd kankercel proliferatie inhiberen en induceert apoptose in vele kankercellen [9-14]. MPA /MMF is ook gemeld migratie van fibroblasten [15] en humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) [16] te remmen. Het is echter niet bekend of MPA de migratie en invasie aantal kankercellen kan veranderen. Bovendien is de precieze migratie signaalwegen en effector-moleculen onderliggende activiteiten van MPA's blijven ongrijpbaar.

In deze studie hebben we voor het eerst aangetoond dat MPA significant verandert de migratie en invasie vermogen van AGS cellen en we vervolgens gebruikt genexpressie en proteomics technologie om genen en eiwitten die ten grondslag liggen aan deze functies te identificeren.

Materials en werkwijzen

cellijnen, reagentia en antilichamen

Twee maagkanker cellijnen (AGS en Hs746T) werden verkregen van de American Type Culture Collection (ATCC). Beide cellijnen werden gekweekt in RPMI 1640 medium dat 10% foetaal runderserum, 100 eenheden /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine bij 37 ° C met 5% CO2. MPA werd gekocht van VWR. De CD147, de integrine beta5 antilichaam werd gekocht van Abcam, de GAPDH en ICAM-1antibodies van Santa Cruz; Src, Akt en p-Akt (Ser473) antilichamen van Cel Signaling.

In vitro trans-well migratie en invasie assays

Celmigratie werd met het Transwell (Costar) systeem, waardoor cellen migreren door 8 urn poriegrootte polycarbonaatmembraan. Kortom, het serum onthouden AGS of HS746T cellen werden toegevoegd aan de bovenste kamer (5 x 104 cellen per insert) en DMEM-medium met verschillende concentraties van MPA (1 ug /ml, 1.5μg /ml en 2 ug /ml) werd als een chemoattractant in de Tweede kamer. Na incubatie bij 37 ° C gedurende 8 uur werden de cellen in de onderste kamer gefixeerd in methanol en gekleurd met 0,2% kristalviolet. Nummers van de migrerende cellen in negen willekeurig gekozen velden drievoud kamers werden geteld in elk experiment onder een fasecontrastmicroscoop. Het invasieve vermogen van de cellen werd geanalyseerd met een Matrigel-beklede gemodificeerde Boyden kamer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) zoals eerder beschreven [17]. DMEM met MPA werd aan de onderste kamer toegevoegd. Na incubatie bij 37 ° C gedurende 24 uur werd het aantal cellen die binnengevallen aan de onderzijde van de bovenste kamer geteld.

Micorarray experimenten

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellen met een AGS magnatic kralen RNA-extractie kit (Jinfiniti Biosciences, Augusta, GA). Genexpressie werd uitgevoerd met het menselijke Illumina HumanHT-12 v4 BeadChip (Illumina, San Diego, CA). Een hoeveelheid van 200 ng totaal RNA werd omgezet in dubbelstrengs cDNA (ds-cDNA) met de Illumina TargetAmp Nano-labeling kit met een oligo-dT primer die een T7 RNA polymerase promoter (Genset, St. Louis, MO). In vitro transcriptie werd
Op genoemde ds cDNA met de Enzo RNA transcript labeling kit. -Biotine gemerkte cRNA werd gezuiverd met behulp van een RNeasy affiniteitskolom (Qiagen), en willekeurig gefragmenteerd tot groottes variërend 35-200 basen door incubatie bij 94 ° C gedurende 35 minuten. De hybridisatie-oplossingen bevatten 100 mM MES, 1 M Na ^{+, 20 mM EDTA en 0,01% Tween 20. De eindconcentratie van gefragmenteerd cRNA was 0,05 pg /pl in hybridisatieoplossing. Doel voor hybridisatie werd bereid door 40 pl gefragmenteerde transcript met gesoniceerde haring sperma DNA (0,1 mg /ml), BSA en 5 nM controle-oligonucleotide in een buffer die 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), en 0,005 % Triton X-100. Doelstelling werd gehybridiseerd gedurende 16 uur bij 45 ° C per Illumina hybridisatieoven. Chips werden vervolgens bij 50 ° C gewassen met oplossingen mogelijk, opnieuw bij 30 ° C met niet-stringente wassingen. Arrays werden daarna gekleurd met streptavidine-Cy3. De microarray gegevens MIAME compliant en hebben in NCBI Gene Expression Omnibus gedeponeerd en zijn toegankelijk via GEO Series toegangsnummer GSE46671.}

Real-time RT-PCR-analyse

Een hoeveelheid van totaal RNA ( 2 ug per monster) werden bekleed met 96 putjes en vervolgens omgezet in cDNA met een hoge capaciteit cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) en een PTC-100TM programmeerbare thermische controller (MJ Research, Inc.). De cDNA-producten werden gebruikt voor kwantitatieve real-time PCR met behulp van kant-en-klare TaqMan genexpressie testen van de Applied Biosystems. Vijf referentie genen relatief constante uitdrukking (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 en MRPL19) werden gebruikt voor het normaliseren RNA-concentratie. Real-time PCR werd uitgevoerd met 96x96 Fluidigm Expression chips. Standaard thermale cycli voorwaarde (10 min bij 95 ° C, 40 cycli van 15 sec bij 95 ° C, 1 min bij 60 ° C) werd voor alle genen. Alle monsters werden geanalyseerd op dezelfde plaat en elk monster werd in duplo geanalyseerd.

Western blotting

De cellen werden geoogst en opnieuw gesuspendeerd in PBS. Na centrifugeren bij 2000 tpm gedurende 5 minuten werd de pellet gelyseerd in ijskoude M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent bevattende 1% Halt Protease Inhibitor Cocktail en fosfatase (Thermo Scientific) gedurende 30 min. Het supernatant werd na 10 minuten centrifugeren bij 12000rpm, geëvenaard door spectrofotometrie, gedenatureerd met monster laadbuffer gedurende 10 min bij 95ᵒC en voor toekomstig gebruik bewaard bij 4 ° C. Eiwitten werden gescheiden door 10% SDS-polyacrylamidegels en overgebracht naar PVDF-membraan (Bio-Rad) en geïncubeerd met primaire antilichamen plaats bij 4 ° C overnacht. De geschikte mierikswortel-geconjugeerd tweede antilichaam bij een verdunning van 1: 10.000 in blokkerende buffer (3% BSA-TBST) werd toegevoegd en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Alle antilichamen werden verdund in 3% BSA-TBST. Immunoblots werden ontwikkeld met behulp van ECL chemiluminescentie reagens (Thermo Scientific).

Flowcytometrie

De cellen werden getrypsiniseerd en tweemaal in PBS gewassen. Ongeveer 1x10 ^{6 cellen werden geïncubeerd met 1 ug van anti-CD147, anti-ICAM-1 en anti-integrine beta 5 antilichamen gedurende 30 minuten, gewassen met PBST maal, vervolgens geïncubeerd met een secundair antilichaam geconjugeerd met TRITC of APC 30 min en tweemaal gewassen met PBST. Flowcytometrische analyses werden uitgevoerd op een FACScaliburTM flowcytometer met CELLQuestTM software (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).}

Luminex test

MMP eiwitten in het kweekmedium werden gemeten met behulp van Luminex kits Millipore Company (Billerica, MA, USA) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Celkweekmedium (1:10 verdunning) werd geïncubeerd met het antilichaam gekoppelde microsferen en vervolgens met gebiotinyleerd detectie-antilichaam vóór de toevoeging van streptavidine-fycoerythrine. De gemaakte bead-complexen werden met de FLEXMAP 3D-systeem (Luminex, Austin, TX). Mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) werd verzameld en gebruikt voor de berekening van eiwit concentraties.

Statistische analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de R taal en omgeving voor statistische berekeningen (www.r-project. org). De vergelijkingen tussen de groep middelen werden gemaakt door ANOVA (voor ≥ 3 groepen), gevolgd door paarsgewijze vergelijkingen met behulp van Bonferroni post-hoc testen. De statistische significantie van verschillen werd bepaald op P < 0,05.

Het lumi pakket werd gebruikt voor te verwerken microarray data. Differentiële expressie analyses werden uitgevoerd met de limma pakket van de Bioconductor project [18]. We gebruikten de valse ontdekking rate (FDR) te corrigeren voor meervoudige tests [19]. Een combinatie van de gecorrigeerde p-waarde en absolute waarde van veelvoudverandering (FC) werden gebruikt voor het selecteren van de differentieel tot expressie gebrachte genen.

Cluster analyse werd uitgevoerd voor het groeperen van differentieel tot expressie van genen vertonen vergelijkbare expressie patronen met behulp van het HPCluster-programma [20]. De Bioconductor pakket "GoStats" werd gebruikt voor het testen van de associatie van Gene Ontology termen (biologische processen) om het differentieel tot expressie van genen [21] A gebaseerd op de hypergeometrische-test p-waarde werd berekend om te beoordelen of het aantal genen geassocieerd met de term groter dan verwacht. De p-waarden die verkregen werden aangepast voor meerdere testen met behulp van de FDR. Het gen lijst werd ook geanalyseerd met behulp van voorgebouwde KEGG paden. We gebruikten de "spia" (signaleringsroute impactanalyse) pakket trajecten beïnvloed door de waargenomen veranderingen in de genexpressie [22] te identificeren. Netwerk analyse werd uitgevoerd om moleculaire interactie netwerken die op STRING gegevensbank [23] te construeren. De netwerken zijn geïmporteerd in eenvoudige interactie formaat Cytoscape voor het zichtbaar maken [24].

Resultaten

MPA remt AGS cel migratie en invasie

Het vermogen tot migratie van twee maagkanker cellijnen (AGS en Hs746T) met en zonder MPA-behandeling werd bepaald met behulp van 8 pm porie Transwell kamers zonder matrigel. Zoals getoond in figuur 1A, de percentages migrerende AGS cellen afgenomen MPA een dosisafhankelijke wijze verminderen tot minder dan 50% van de controle AGS cellen bij concentraties van > 1.5μg /ml. Echter, het vermogen tot migratie van Hs746T-cellen niet beïnvloed door MPA bij soortgelijke concentraties. Evenzo werd celinvasie getest middels 8 urn poriën Biocoat Matrigel 8 micron invasie kamers (Figuur 1B). MPA-behandeling ook aanzienlijk gedaald de binnenvallende vermogen van AGS cellen, maar niet Hs746T cellen.

MPA-geïnduceerde genexpressie veranderingen in verband met kanker celmigratie

Om de genen veranderd door MPA-behandeling te identificeren, voerden we een wereldwijde transcriptomics profilering experiment met AGS cellen behandeld met MPA. Met behulp van de gehele genexpressie dataset, identificeerden we KEGG trajecten die aanzienlijk zijn veranderd door MPA. Acht van de tien significant veranderd trajecten (p53 signalering, celcyclus pathways in kanker, PPAR signalering, blaaskanker, verwerking eiwit in ER, kleincellige longkanker en MAPK signalering) zijn welbekend kankergerelateerde zijn. De differentieel tot expressie gebrachte genen werden in kaart gebracht naar Gene Ontology biologische processen en hypergeometische test werd uitgevoerd om de significantie van verrijking voor elke evaluatie. Onze analyse gaf aan dat het aanzienlijk verrijkt genen zijn betrokken bij de celcyclus (1,6-voudige verrijking, p < 10 ^{-5), celdood (1,7-voudige verrijking, p < 10 -7), celproliferatie (1,8-voudige verrijking, p < 10 -7), en celmigratie (1,5-voudige verrijking, p < 0,005). De globale genexpressie gegevens komen overeen met de activiteit MPA in het remmen van kanker celproliferatie, inductie van apoptose en remming van migratie.}

Sinds de belangrijkste focus van deze studie is om de moleculaire mechanisme dat ten grondslag invloed MPA op kankercel migratie toe te lichten, analyseerden we in detail de 50-migratie gerelateerde genen met 2-4 voudige verschillen en 15-migratie gerelateerde genen met > 4-voudige verschillen tussen behandelde en onbehandelde cellen AGS (figuur 2). Vier verschillende clusters van genen worden erkend. Het cluster 1 genen snel up-gereguleerd op het 12u tijdstip en piekte op de 24u tijdstip, maar een beetje down-gereguleerd later. Het cluster 2 genen zijn iets toegenomen ten 24u tijdstip, maar dan steeds meer up-gereguleerd in de 48u en 72 uur tijdstippen. Het cluster 3 genen snel down-gereguleerd in de 12u en 24u tijdstippen maar down-regulering wordt het veel minder op latere tijdstippen, terwijl de cluster 4 genen worden down-gereguleerd in de 24u en latere tijdstippen. De functionele relaties tussen deze genen worden weergegeven in een gen regelgevingsnetwerk (figuur 3). Vervolgens onderzochten we ook de geldigheid van de expressie gegevens door het analyseren van een kandidaat-genen met behulp van real-time RT-PCR (figuur 4). Een andere groep RNA-monsters werden verkregen op verschillende tijdstippen behandeling (0, 12, 24 en 48 uur na behandeling) vanaf de MPA-gevoelige cellen en AGS MPA-ongevoelige Hs746T cellen.
Behandeling

MPA ernstig down- gereglementeerde twee celoppervlak receptor genen ( PDGFRA Kopen en LRP8
), een proteïne kinase gen ( PRKCA
), en vijf andere genen ( INF 2
DOCK1
, HSPA5
, ARRB1
en IGFBP5
) (figuur 2). Zes van deze genen werden geselecteerd voor RT-PCR bevestiging en de zes genen werden bevestigd significant neerwaarts gereguleerd door MPA in AGS cellen die gevoelig zijn voor MPA (figuur 4). Interessant is dat deze genen waren niet significant neerwaarts gereguleerd door MPA behandeling in de Hs746T cellen die ongevoelig MPA-behandeling (figuur 4) zijn.

Verder MPA behandeling van AGS cellen aanzienlijk opgereguleerd expressie van een groot aantal genen die celmigratie. Zeven genen ( ATF3
, Smad3
, CITED2
, CEAMCAM1
, CYR61
, NOS3
en CDH10
) hebben meer dan vier-voudig verschil en worden gemarkeerd in de microarray heatmap (figuur 2). Real-time RT-PCR bevestigde dat ATF3
verhoogd met 10-20 plooien in de AGS cellen na MPA-behandeling, terwijl slechts verlengd met 2-3 plooien in de Hs746T-cellen (Figuur 4). Evenzo MPA behandeling significant verhoogd CDH10
AGS expressie in cellen, maar niet in Hs746T-cellen (Figuur 4).

We hebben ook uitgevoerd pathway verrijking analyse van de 65 celmigratie genen differentieel tot expressie na MPA-behandeling. De top vijf KEGG trajecten die significant veranderd door MPA zijn weergegeven in Tabel 1. De focal adhesion, actine cytoskelet en axon guidance trajecten zijn sterk gerelateerd aan celmigratie aanzienlijk geremd door MPA behandeling, in overeenstemming met de waargenomen vermindering van het migratievermogen MPA-behandelde cellen AGS. Bovendien is de route bij kanker ook significant geremd verschillende genen een belangrijke rol bij de proliferatie en apoptose cel. De TGF-beta route significant geactiveerd door MPA behandeling en deze bevinding is consistent met de onderdrukking werking van TGF-bèta-activiteit en MPA in het remmen celmigratie en proliferatie.
Pathway Naam
ID
pFDR
Status
Focal adhesion45101.46E-06InhibitedRegulation van actine cytoskeleton48101.22E-05InhibitedPathways in cancer52002.21E-05InhibitedAxon guidance43600.00016InhibitedTGF-beta signalering pathway43500.00021ActivatedTable 1. Top vijf KEGG-paden van de 65 celmigratie genen significant veranderd door MPA behandeling.
CSV Download CSV

MPA-geïnduceerde signalering veranderingen in verband met migratie

AKT
is een belangrijke gen dat verbindt met een groot aantal genen die differentieel tot expressie migratie in de microarray data. Echter, de uitdrukking van de AKT
genen wordt niet afgedaan door MPA behandeling. Bovendien mag de totale AKT vertoonde slechts geringe verandering op latere tijdstippen (figuur 5A). Interessant, fosfo-Akt (Ser 473) werd zwaar daalde met MPA-behandeling (Figuur 5A). Deze resultaten suggereren dat MPA ook kunnen veranderen het migratievermogen van AGS cel via invloed op de activatie status van de belangrijkste signalerende proteïnen zoals AKT, naast de expressie van genen.

De expressie van de genen die voor de src tyrosine kinase is slechts marginaal down-gereguleerd in de microarray data. Aangezien Src functioneel samenhangt met een groot aantal genen die differentieel tot expressie migratie in de microarray data (figuur 3), hebben we de eiwit expressie van Src en vonden dat het eiwit sterk neerwaarts gereguleerd door MPA-behandeling (Figuur 5A). De precieze reden voor de waargenomen gen- en eiwitexpressie discrepanties is onduidelijk en nog nader worden onderzocht.

MPA-geïnduceerde CD147 vermindering

De Src tyrosine kinase zendt ook integrine-afhankelijke signalen centraal in de cel verkeer en de proliferatie. Verschillende differentieel tot expressie van genen ( CEACAM1 Kopen en CYR61
) zijn ook betrokken bij de integrine signaleringsroute. Derhalve analyseerden we de expressie van integrines op verschillende AGS en Hs746T celoppervlak middels FACS-analyse. Hoewel de expressie van de CD147
gen werd niet veranderd door MPA-behandeling (figuur 4), de CD147 oppervlakte-eiwit expressie werd drastisch omlaag gereguleerd na MPA-behandeling (Figuur 5B). Bovendien Western blot analyse bevestigde eveneens dat het totale CD147 eiwit significant neerwaarts gereguleerd door MPA-behandeling (Figuur 5A). Interessant, MPA behandeling van Hs746T cellen niet significant gewijzigd CD147 oppervlakte-expressie. De expressie van ICAM-1 en beta integrine 5 werd niet veranderd door MPA-behandeling (Figuur 5B).

MPA vermindert matrix metalloproteinase 1 (MMP-1)

Drie MMP eiwitten werden gemeten in de kweekmedium AGS en Hs746T cellen na behandeling met MPA Luminex assays (figuur 6). De eiwitniveaus van MMP2 en MMP9 waren zeer laag AGS celkweekmedium (gegevens niet getoond). MMP1 werd significant verminderd door MPA behandeling in een dosis-afhankelijke wijze AGS celkweekmedium (figuur 6A), terwijl geen significante verandering in Hs746T-cellen (Figuur 6B) waargenomen.

Discussie

MPA is bekend dat specifieke wijze IMPDH, de snelheidsbeperkende enzym voor
de novo synthese van nucleotiden guanosine, die essentieel zijn voor DNA-replicatie en RNA en eiwitsynthese. MPA is ook bekend om de proliferatie van kankercellen te remmen en apoptose. In deze studie hebben we aangetoond voor de eerste keer dat MPA significant de migratie en invasie mogelijkheden van AGS cellen kan verminderen. Aangezien metastase is een groot probleem kankerpatiënten vermogen MPA kankercel migratie en invasie, remmen naast zijn vermogen om celproliferatie te remmen en apoptose, maakt MPA een uitstekende anti-kanker geneesmiddel kandidaat.

In deze studie ook gebruik van moleculaire technieken om de moleculaire mechanismen van MPA functie kankercelmigratie remmen helderen. We eerst gebruikt globale transcriptoom analyse migratie kandidaatgenen veranderd door MPA behandeling identificeren. Deze studies gesuggereerd 50 genen met 2-4 voudige verschillen en 15 genen met > 4-voudige verschillen (figuur 2). Deze genen omvatten celoppervlakreceptoren, proteïnekinasen, en andere genen die betrokken zijn bij de regulering van migratie. De geldigheid van de microarray gegevens werd bevestigd door real-time RT-PCR voor geselecteerde genen met > 4-voudige verschillen (figuur 4). In aanvulling op transcriptoom analyse, gebruikten we ook een aantal proteomics en functionele technologieën om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de anti-migratie activiteit van MPA te helderen. Transcriptomische profilering is een krachtige technologie om de wereldwijde moleculaire veranderingen te beoordelen. Het grote voordeel van genexpressie microarray is de mogelijkheid om het expressiepatroon van bijna alle genen tot expressie gebracht in de cellen van belang snel en economisch te evalueren. Ondanks de kracht van deze klasse van technologieën, zijn er een aantal problemen die microarray hoofdzakelijk als hypothese genererend instrument beperken. De meest ernstige beperking is de onvolmaakte correlatie of het gebrek aan correlatie tussen genexpressie en eiwit expressie /functie. Deze tekortkoming wordt goed geïllustreerd in deze studie als belangrijke verschillen in eiwit expressie van activeringsstatus werden veranderd door MPA terwijl de genexpressie niveaus waren onveranderd. Daarom is het essentieel om transcriptoom als proteoom technieken combineren globale karakterisatie van biologische functies.

Ten minste drie genen waarvan bekend is dat celmigratie ( INF 2
, DOCK1
en HSPA5
) zijn sterk neerwaarts gereguleerd (> 4-voudig) van MPA-behandeling (Figuur 2). INF 2
codeert de geïnverteerde formin 2 eiwit, die de vorming van microtubuli detyrosinated noodzakelijk centromeer heroriëntatie migrerende cellen [25] bevordert. De Dedicator van cytokinese 1 (DOCK1) eiwit interageert met HER2 en bevordert HER2-geïnduceerde activatie en Rac celmigratie [26]. HSPA5 is een reactie op stress-eiwit geïnduceerd door agenten of omstandigheden die een negatieve invloed hebben endoplasmatisch reticulum-functie. Het regelt actief verschillende kwaadaardige fenotypes waaronder celgroei, migratie en invasie. Down-regulatie van deze genen door MPA is met de verminderde trekkende capaciteit van AGS cellen na MPA-behandeling. In tegenstelling tot overexpressie van β-arrestin-1 ( ARRB1
) verminderde de trekkende neiging van borstkankercellen lijnen, terwijl zwijgen toegenomen migratie [27]. In een meer recente studie [28], ARRB1
bleek het vermogen tot migratie van de migratie longkanker te promoten. Daarom is het onduidelijk op dit moment of de ARRB1
remt of bevordert migratie in AGS-cellen. Een ander drastisch down-gereguleerd gen, IGFBP5
, induceert cel adhesie en verhoogt de cel overleving in MCF-7 menselijke borstkankercellen [29]. IGFBP5 lijkt migratie van MCF7-cellen [29] inhiberen maar bevordert de migratie van perifere mononucleaire cellen [30]. Daarom blijft de rol van IGFBP5 AGS op celmigratie te bepalen.

MPA behandeling van AGS cellen ook aanzienlijk opgereguleerd de expressie van een aantal genen die celmigratie. Onder deze zeven genen ( ATF3
, Smad3
, CITED2
, CEAMCAM1
, CYR61
, NOS3 Kopen en CDH10
) zijn van groot belang omdat ze tonen meer dan verviervoudigd verschillen in de microarray heatmap (figuur 2). Twee van de zeven genen ( ATF3 Kopen en CDH10
) werden geselecteerd en bevestigd door real-time RT-PCR. ATF3
expressie wordt verhoogd met 11-voudig 12 uur na de MPA-behandeling en met 19-voudig bij 48 uur. CDH10
expressie wordt gewijzigd AGS cellen, maar niet in Hs746T-cellen (Figuur 4). ATF3 is onlangs aangetoond dat metastase van blaaskanker onderdrukken door middel van het reguleren Gelson gemedieerde hermodellering van het actine cytoskelet. Overexpressie van ATF3
in sterk uitgezaaide blaaskanker cellen vermindert migratie In vitro Kopen en In vivo
[31]. De TGF-β /Smad signaling pathway speelt een cruciale rol in pancreatische ductale adenocarcinoom groei, migratie en metastase. SiRNA gemedieerde silencing van Smad3 verhoogt TGF-β-geïnduceerde kankercelmigratie [32]. Consistent met de verminderde vermogen tot migratie van AGS cellen na MPA-behandeling, Smad3 aanzienlijk opgereguleerd door MPA-behandeling (Figuur 2). CITED2
codeert voor het CBP /p300-interactie transactivator 2-eiwit, dat positief reguleert TGF-β signalering via de associatie met de SMAD /p300 /CBP-gemedieerde transcriptie coactivator complex en stimuleert diverse andere transcriptie-activiteiten. Aangetoond of Cited2
knockout muizen toegenomen gonadale celmigratie [33]. Daarom opgereguleerd CITED2
genexpressie kan bijdragen aan het verminderde vermogen tot migratie van AGS cellen behandeld met MPA. CEACAM1
codeert voor het carcino-antigeen gerelateerde celadhesie molecuul (CD66a), die integrine-afhankelijke signalering beïnvloedt en reguleert extracellulaire matrix eiwit-specifieke morfologie en migratie van endotheelcellen [34]. Hoewel de meeste studies aangetoond dat CEACAM1 promigratory een rol, de interactie van CEACAM1 en filamin Een drastisch verminderd migratie en cel verstrooiing [35] alleen speelt. Daarom kan de rol van CEACAM1 bij celmigratie afhankelijk van de cellulaire context.

Twee van de genen sterk up-gereguleerd door MPA ( CYR61 Kopen en NOS3
) daadwerkelijk te bevorderen migratie. CYR61
codeert de cysteïnerijke eiwitten 61 die celmigratie bevordert via wijziging van de functies van integrine [36]. De up-regulatie van CYR61
door MPA-behandeling kan de anti-trekkende rol van MPA te verminderen. Stikstofoxide bevordert mammaire migratie van tumorcellen door middel van sequentiële activering van stikstofoxide synthase, guanylaatcyclase en door mitogeen geactiveerde proteïne kinase [37]. NOS3
codeert de stikstofmonoxide synthase 3 en is zeer up-gereguleerd door MPA behandeling. Nogmaals, up-regulatie van NOS3
kan de antimigratory functie van MPA te verminderen. De CDH10
gen codeert voor een van de cadherine eiwitten die cruciale rol in cel-cel adhesie te spelen. Er werd geconcludeerd dat CDH10 een cruciale rol in mesendodermal celmigratie kunnen spelen maar deze afgeleide relatie niet experimenteel getest. CDH10
drastisch verhoogd MPA behandeling van AGS cellen maar niet in Hs746T cellen en zijn rol in de migratie moet experimenteel worden getest.

PDGFRA
codeert voor een celoppervlak receptor tyrosine kinase lid van de van bloedplaatjes afkomstige groeifactor familie en is bekend in nauw verband met celmigratie [38]. Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 (LRP8), ook bekend als apolipoproteïne E receptor 2 (ApoER2), is een celoppervlak receptor met een EGF-achtig domein. Deze receptoren functioneren in signaaltransductie en endocytose van specifieke liganden. LRP8 speelt een belangrijke rol in embryonale neuronale migratie [39]. Extracellulair ligand binding aan LRP8 en een verwante receptor, VLDLR, op het migreren van neuronen activeert intracellulaire processen die beginnen met DAB1 fosforylering [39]. DAB1, een tyrosine kinase gefosforyleerd eiwit kan worden gefosforyleerd door tyrosinekinasen twee (Src en Fyn) en gefosforyleerd DAB1 induceert verdere activering van beide kinasen en andere kinases zoals PI3K. Gefosforyleerd PI3K kan leiden tot inhiberende fosforylatie van het tau-kinase glycogeensynthasekinase 3 beta (GSK3B), die de activiteit van tau-eiwit dat betrokken is bij microtubuli stabiliseren verandert. PI3K kan fosforyleren eiwitten proteïnekinase C (PKC), dat een breed scala van eiwitdoelen fosforyleren en staan ​​bekend te zijn betrokken bij diverse cellulaire signaalroutes.

• PLoS ONE: Resveratrol remt de groei van maagkanker door het induceren G1 Phase Arrestatie en afsterven in een Sirt1-afhankelijke manier
• PLoS ONE: A Community-Based, case-control studie evalueren Sterfte Reduction van maagkanker door Endoscopische Screening in Japan