PLoS ONE: micofenolico acido inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule cancro gastrico tramite diversi percorsi molecolari

Astratto

L'acido micofenolico (MPA) è il prodotto metabolizzato ed elemento attivo di micofenolato mofetile (MMF), che è stato ampiamente utilizzato per la prevenzione del rigetto del trapianto acuto. MPA inibisce potentemente inosina monofosfato deidrogenasi (IMPDH), che è up-regolato in molti tumori e MPA è noto per inibire la proliferazione delle cellule del cancro così come fibroblasti e la migrazione delle cellule endoteliali. In questo studio, abbiamo dimostrato per le abilità antimigratory e anti-invasione del MPA di MPA-sensibili AGS (cancro gastrico), le cellule per la prima volta. espressione genome-wide analisi mediante microarray Illumina intero genoma individuati 50 geni con ≥2 modifiche piega e 15 geni con > 4 alterazioni piega e molecolare percorsi multipli implicati nella migrazione delle cellule. Real-time RT-PCR analisi dei geni selezionati anche confermato le differenze di espressione. Inoltre, proteomica mirata analisi ha identificato diverse proteine ​​alterate dal trattamento MPA. I nostri risultati indicano che MPA modula la migrazione delle cellule di cancro gastrico attraverso il down-regolazione di un gran numero di geni ( PRKCA
, DOCK1
, INF 2, HSPA5, LRP8
e PDGFRA
) e proteine ​​(PRKCA, AKT, SRC, CD147 e MMP1) con funzioni promigratory così come up-regolazione di una serie di geni con funzioni antimigratory ( ATF3
, SMAD3
, CITED2
e CEAMCAM1
). Tuttavia, alcuni geni che possono favorire la migrazione ( Cyr61
e NOS3
) sono stati up-regolati. Pertanto, il ruolo antimigratory complessiva del MPA sulle cellule tumorali riflette un equilibrio tra promigratory e segnali antimigratory influenzati dal trattamento MPA

Visto:. Dun B, Sharma A, Teng Y, Liu H, S Purohit, Xu H, et al . (2013) micofenolico inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule cancro gastrico tramite diversi percorsi molecolari. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10.1371 /journal.pone.0081702

Editor: Ying Xu, Università della Georgia, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 27 Luglio, 2013; Accettato: 15 Ottobre 2013; Pubblicato: 15 novembre 2013

Copyright: © 2013 Dun et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Lo studio è stato sostenuto da fondi della Georgia Regents dell'Università. JXS è parzialmente supportato dalla Georgia Research Alliance come un eminente studioso. Il finanziatore ha avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

I tumori più solidi sono in gran parte curabili se vengono diagnosticati e trattati prima di diffusione al di là del sito primario iniziale. Tuttavia, una volta tumori diffondersi ad altre posizioni, di solito diventano altamente morbosa e probabilmente fetale. Pertanto, è essenziale per limitare la diffusione iniziale e prevenire la diffusione secondaria. Invasione e metastasi sono due principali modalità di diffusione del tumore, ciascuno guidato da meccanismi diversi e che portano alle sfide terapeutiche distinte [1]. Tuttavia, entrambe le forme di diffusione richiedono dai siti primari alla località secondaria per il movimento delle cellule così come ristabilimento e la sopravvivenza delle cellule tumorali nelle posizioni secondarie. Questi processi sono raggiunti attraverso una cascata di cambiamenti molecolari all'interno delle cellule tumorali. Anche se la migrazione delle cellule sottostante meccanismo molecolare è stato ampiamente studiato, nuove intuizioni gli eventi molecolari possono fornire nuovi approcci terapeutici. Infatti, l'inibizione delle molecole che promuovono la migrazione cellulare e up-regolazione di molecole che inibiscono la migrazione delle cellule attraverso interventi farmacologici sono diventati una parte importante delle weaponries per combattere il cancro. Sviluppo o riutilizzo dei farmaci aggiuntivi che inibiscono la migrazione e l'invasione è un grande sforzo continuo per terapie contro il cancro.

Micofenolato Mofetile (MMF) è stato approvato per la prevenzione del rigetto del trapianto acuta nel rene, cuore, fegato e trapianti [ ,,,0],2,3]. MMF è il profarmaco morfolinoetilico estere dell'acido micofenolico (MPA), che è un potente inibitore non competitivo di inosina monofosfato deidrogenasi (IMPDH), l'enzima limitante per il de novo
sintesi dei nucleotidi guanosina [4,5 ], che svolgono un ruolo cruciale nella proliferazione cellulare e di altre funzioni cellulari, tra cui la replicazione del DNA, la sintesi di RNA e proteine ​​e di segnalazione cellulare [6]. Di conseguenza, i blocchi MPA T e B proliferazione dei linfociti e l'espansione clonale, e impedisce la generazione di cellule T citotossiche e di altre cellule T effettrici. Altri meccanismi possono anche contribuire alla efficacia di MPA nel prevenire rigetto. Attraverso l'esaurimento dei nucleotidi guanosina, MPA può sopprimere glicosilazione e l'espressione di diverse molecole di adesione, diminuendo in tal modo il reclutamento di linfociti e monociti in siti di infiammazione e di rigetto [5].

Poiché espressione IMPDH è significativamente up-regolato in molte cellule tumorali [7,8], è, quindi, potenzialmente un bersaglio per la terapia del cancro in aggiunta a immunosoppressiva chemioterapia. MPA /MMF è stato segnalato per inibire la proliferazione delle cellule tumorali e induce l'apoptosi in molte cellule tumorali [9-14]. MPA /MMF è stata riportata anche di inibire la migrazione di cellule di fibroblasti [15] e la vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) [16]. Tuttavia, non è noto se MPA può alterare la capacità di migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Inoltre, le precise vie di segnalazione di migrazione e molecole effettrici sottostanti attività di MPA rimangono sfuggente.

In questo studio, in primo luogo abbiamo dimostrato che MPA cambia in modo significativo la capacità di migrazione e l'invasione delle cellule AGS e poi abbiamo usato l'espressione genica e le tecnologie di proteomica per identificare i geni e le proteine ​​alla base di tali funzioni.

Materiali e Metodi

le linee cellulari, reagenti e anticorpi

Due linee di cellule di cancro gastrico (AGS e Hs746T) sono stati ottenuti dalla American Type Culture Collection (ATCC). Entrambe le linee cellulari sono state coltivate in terreno RPMI 1640 contenente siero bovino fetale al 10%, 100 unità /ml di penicillina e 100 microgrammi /ml di streptomicina a 37 ° C con 5% CO2. MPA è stato acquistato da VWR. Il CD147, l'anticorpo integrina beta5 è stato acquistato da Abcam, la GAPDH e ICAM-1antibodies da Santa Cruz; Src, Akt e p-Akt (ser473) anticorpi da Cell Signaling.

In vitro migrazione e l'invasione saggi trans-well

La migrazione cellulare è stato eseguito con il sistema Transwell (Costar), che permette alle cellule di migrare a 8 micron membrana di policarbonato dimensione dei pori. In breve, sono stati aggiunti siero starved AGS o cellule HS746T alla camera superiore (5 × 104 cellule per inserto) e terreno DMEM con diversa concentrazione di MPA (1 ug /ml, 1.5μg /ml e 2μg /ml) è stato usato come chemiotattico nella camera inferiore. Dopo incubazione a 37 ° C per 8 ore, le cellule nella camera inferiore sono state fissate in metanolo e colorate con cristalvioletto 0,2%. Numeri delle cellule migrano in nove campi scelti a caso da camere triplicato sono stati contati in ciascun esperimento al microscopio a contrasto di fase. Il potenziale invasivo delle cellule è stata analizzata utilizzando una camera Matrigel rivestite modificato Boyden (Biosciences BD, San Jose, CA, USA), come descritto in precedenza [17]. DMEM contenente MPA è stato aggiunto alla camera inferiore. Dopo incubazione a 37 ° C per 24 ore, il numero di cellule che invase al lato inferiore della camera superiore è stato contato.

Micorarray esperimenti

L'RNA totale è stato estratto da cellule AGS utilizzando una magnatic kit di estrazione perline RNA (Jinfiniti Biosciences, Augusta, GA). profilo di espressione genica è stata effettuata utilizzando l'umano Illumina HumanHT-12 v4 BeadChip (Illumina, San Diego, CA). Un'aliquota di 200 ng di RNA totale è stato convertito in cDNA a doppio filamento (ds-cDNA) utilizzando il kit di etichettatura Illumina TargetAmp-Nano con un primer oligo-dT contenente un promotore T7 RNA polimerasi (Genset, St. Louis, MO). In vitro
trascrizione è stata eseguita su quanto sopra ds-cDNA utilizzando il kit di etichettatura trascrizione Enzo RNA. Biotina marcata cRNA è stato purificato utilizzando una colonna di affinità RNeasy (Qiagen), e frammentata in modo casuale a dimensioni che vanno da 35-200 basi incubando a 94 ° C per 35 min. Le soluzioni di ibridazione contenevano 100mm MES, 1 M Na ^{+, 20 mM EDTA, e 0,01% Tween 20. La concentrazione finale di cRNA frammentato è stato 0,05 mg /mL in soluzione di ibridazione. Obiettivo per ibridazione è stato preparato combinando 40 ml di trascrizione frammentato con sonicato DNA aringhe spermatozoi (0,1 mg /ml), BSA e 5nm di controllo oligonucleotide in un tampone contenente 1,0 M NaCl, 10 mM Tris.HCl (pH7.6), e 0,005 % Triton X-100. Obiettivo è stato ibridato per 16h a 45 ° C in un forno di ibridazione Illumina. Chips sono stati quindi lavati a 50 ° C con una soluzione severi, poi di nuovo a 30 ° C con lavaggi non stringenti. Gli array sono stati poi colorati con streptavidina-Cy3. I dati microarray sono MIAME conformi e sono stati depositati in NCBI Gene Expression Omnibus e sono accessibili attraverso GEO serie numero adesione GSE46671.}

Real-time RT-PCR analisi

Un'aliquota di RNA totale ( 2μg per campione) sono stati schierati in piastre da 96 pozzetti e poi convertito in cDNA utilizzando una ad alta capacità cDNA trascrizione inversa Kit (Applied Biosystems) e un PTC-100TM programmabile di controllo termico (MJ Research, Inc). I prodotti di cDNA sono stati utilizzati per quantitativa PCR in tempo reale utilizzando saggi di espressione genica TaqMan pronti per l'uso dei Applied Biosystems. Cinque geni di riferimento con l'espressione relativamente costante (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 e MRPL19) sono stati utilizzati per normalizzare la concentrazione di RNA. Real-time PCR è stata eseguita con 96x96 Fluidigm chip di espressione. Standard condizione cicli termici (10 min a 95 ° C, 40 cicli di 15 secondi a 95 ° C, 1 min a 60 ° C) è stato usato per tutti i geni. Tutti i campioni sono stati analizzati sulla stessa piastra e ciascun campione è stato analizzato in duplicato.

Western blotting

Le cellule sono state raccolte e risospese in PBS. Dopo centrifugazione a 2000rpm per 5 minuti, il pellet è stato lisati in ghiaccio freddo M-PER mammiferi proteine ​​reagente di estrazione contenente 1% proteasi Halt e fosfatasi Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific) per 30 minuti. Il supernatante è stato raccolto dopo 10 min di centrifugazione a 12000rpm, eguagliato per spettrofotometria, denaturato con tampone di caricamento del campione per 10 minuti a 95ᵒC e conservati a 4 ° C per un uso futuro. Le proteine ​​sono state separate da 10% gel SDS-poliacrilammide e trasferiti PVDF membrana (Bio-Rad), e incubate con anticorpi primari di interesse a 4 ° C durante la notte. L'appropriato anticorpo secondario rafano coniugato alla diluizione di 1: 10.000 in tampone di bloccaggio (3% BSA-TBST) viene aggiunto e incubato per 1 ora a temperatura ambiente. Tutti gli anticorpi sono stati diluiti in 3% BSA-TBST. Immunoblot sono stati sviluppati utilizzando ECL chemiluminescenza reagente (Thermo Scientific).

citometria a flusso

Le cellule sono state tripsinizzate e lavate due volte in PBS. Circa 1x10 ^{6 cellule sono state incubate con 1 ug di anti-CD147, anti-ICAM-1 e anti-integrina beta 5 anticorpi per 30min, lavato con PBST due volte, poi incubate con un anticorpo secondario coniugato con TRITC o APC per 30min, e lavato due volte con PBST. analisi di flusso citometria sono state eseguite su un FACScaliburTM citofluorimetro con il software CELLQuestTM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).}

Luminex test

MMP proteine ​​nel terreno di coltura sono stati misurati utilizzando i kit Luminex da Millipore Company (Billerica, MA, USA) secondo le raccomandazioni del fabbricante. terreno di coltura cellulare (diluizione 1:10) è stato incubato con le microsfere anticorpi accoppiati e poi con l'anticorpo biotinilato rilevamento prima dell'aggiunta di streptavidina-ficoeritrina. Il tallone complessi catturati sono stati misurati con il sistema FLEXMAP 3D (Luminex, Austin, TX). intensità di fluorescenza mediana (MFI) è stata raccolta e utilizzata per calcolare le concentrazioni di proteine.

Analisi statistica

Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il linguaggio R e l'ambiente per il calcolo statistico (www.r-progetto. org). I confronti tra i mezzi di gruppo sono state fatte da ANOVA (per ≥ 3 gruppi), seguite da raffronti pair-wise utilizzando test Bonferroni post-hoc. La significatività statistica delle differenze è stato fissato a P < 0.05.

Il pacchetto Lumi è stato utilizzato per i dati di pre-elaborazione di microarray. espressione differenziale sono state condotte analisi utilizzando il pacchetto limma dal progetto Bioconductor [18]. Abbiamo usato il tasso di scoperta di false (FDR) per regolare per le prove multiple [19]. Una combinazione di regolazione p-value e il valore assoluto della variazione volte (FC) sono stati utilizzati per la selezione dei geni differenzialmente espressi.

La cluster analysis è stata effettuata per il raggruppamento di geni espressi in modo differenziale che espongono modelli di espressione simili utilizzando il programma HPCluster [20]. Il pacchetto Bioconductor "GOstats" è stato utilizzato per testare l'associazione dei termini Gene Ontology (processi biologici) per i geni espressi in modo differenziale [21] A p basato sul test ipergeometrica è stato calcolato per valutare se il numero di geni associati con il termine è più grande del previsto. I valori di p ottenuti sono stati aggiustati per test multipli utilizzando il FDR. L'elenco gene è stato anche analizzato utilizzando percorsi KEGG precompilati. Abbiamo usato il "Spia" (segnalazione di analisi di impatto pathway) del pacchetto di individuare percorsi influenzato dai cambiamenti osservati nell'espressione genica [22]. L'analisi di rete è stata eseguita per la costruzione di reti di interazione molecolare che utilizzano il database STRING [23]. Le reti sono state importate in formato semplice interazione di Cytoscape per la visualizzazione [24].

Risultati

MPA inibisce la migrazione delle cellule AGS e l'invasione

La capacità migratoria delle due linee di cellule di cancro gastrico (AGS e Hs746T) con e senza trattamento MPA è stata valutata utilizzando pori 8μm transwell camere senza matrigel. Come mostrato in figura 1A, le percentuali di migrazione delle cellule AGS diminuiti in modo dose-dipendente MPA, riducendo a meno del 50% delle cellule AGS controllo a concentrazioni > 1.5μg /ml. Tuttavia, la capacità migratoria delle cellule Hs746T non è stata influenzata dalla MPA alle concentrazioni simili. Allo stesso modo, l'invasione delle cellule è stato analizzato poro 8μm utilizzando Biocoat Matrigel camere di 8 micron invasione (Figura 1B). trattamento MPA inoltre ridotto significativamente la capacità d'invasione delle cellule AGS, ma non le cellule Hs746T.

MPA-indotta espressione genica modifiche relative alla migrazione delle cellule del cancro

Per identificare i geni alterati dal trattamento MPA, abbiamo condotto un esperimento profilatura trascrittomica globale con le cellule trattate con AGS MPA. Utilizzando l'intero set di dati di espressione genica, abbiamo identificato percorsi KEGG che risultano significativamente modificati da MPA. Otto dei dieci percorsi significativamente modificato (segnalazione p53, ciclo cellulare, percorsi di cancro, di segnalazione PPAR, cancro della vescica, l'elaborazione di proteine ​​in ER, carcinoma polmonare a piccole cellule e la segnalazione MAPK) sono ben noti per essere correlate al cancro. I geni differenzialmente espressi sono stati mappati i processi biologici Gene Ontology e un test ipergeometrica è stata effettuata per valutare il significato di arricchimento per ogni categoria. La nostra analisi ha indicato che i geni significativamente arricchite sono implicati nel ciclo cellulare (1,6 arricchimento volte, p < 10 ^{-5), la morte cellulare (arricchimento di 1,7 volte, p < 10 -7), la proliferazione cellulare (arricchimento 1,8 volte, p < 10 -7), e la migrazione delle cellule (1,5 arricchimento volte, p < 0,005). I dati di espressione genica a livello mondiale sono in linea con l'attività di MPA nell'inibire la proliferazione delle cellule tumorali, induzione di apoptosi e l'inibizione della migrazione.}

Dato che l'obiettivo principale di questo studio è quello di chiarire il meccanismo molecolare alla base l'impatto della MPA sulla migrazione delle cellule di cancro, abbiamo analizzato nel dettaglio i 50 geni connesse alla migrazione con 2-4 differenze piega e 15 geni relativi alla migrazione con > differenze 4 volte tra cellule AGS trattati e non trattati (Figura 2). Quattro gruppi distinti di geni vengono riconosciuti. I geni gruppo 1 sono rapidamente up-regolato al punto 12h e ha raggiunto la posizione del punto di tempo 24 ore, ma un po 'down-regolato in seguito. Il cluster 2 geni sono leggermente aumentati al punto di tempo 24 ore, ma poi diventano più up-regolati alle 48h e 72h punti di tempo. Il cluster 3 geni sono rapidamente down-regolato alle 12h e 24h punti di tempo, ma sotto-regolazione diventa molto meno in momenti successivi, mentre i cluster di 4 geni sono down-regolati a 24h e momenti successivi. Le relazioni funzionali tra questi geni sono raffigurati in una rete di regolazione genica (Figura 3). Successivamente, abbiamo anche valutato la validità dei dati di espressione analizzando un sottoinsieme di geni candidati utilizzando real-time RT-PCR (Figura 4). Una diversa serie di campioni di RNA sono stati ottenuti in diversi momenti trattamento (0, 12, 24 e 48 ore dopo il trattamento) dalle cellule AGS MPA-sensibili e cellule Hs746T MPA-insensitive.
Trattamento

MPA gravemente il basso regolamentati due geni dei recettori della superficie cellulare ( PDGFRA
e LRP8
), un gene della proteina chinasi ( PRKCA
), e altri cinque geni ( INF 2
, DOCK1
, HSPA5
, ARRB1
, e IGFBP5
) (Figura 2). Sei di questi geni sono stati selezionati per la conferma RT-PCR e tutti i sei geni sono stati confermati essere significativamente down-regolato da MPA in cellule AGS sensibili alla MPA (Figura 4). È interessante notare che la maggior parte di questi geni non erano significativamente down-regolato mediante trattamento MPA nelle cellule Hs746T che sono insensibili al trattamento MPA (Figura 4).

Inoltre, il trattamento di cellule MPA AGS significativamente up-regolata l'espressione di un gran numero di geni implicati nella migrazione cellulare. Sette geni ( ATF3
, SMAD3
, CITED2
, CEAMCAM1
, Cyr61
, NOS3
e CDH10
) hanno differenza più di quattro volte e sono evidenziate nel heatmap microarray (Figura 2). Real-time RT-PCR ha confermato che ATF3
è aumentato del 10-20 pieghe nelle cellule AGS dopo il trattamento MPA, mentre è aumentata solo 2-3 pieghe nelle cellule Hs746T (Figura 4). Analogamente, il trattamento MPA significativamente aumentato CDH10
espressione in cellule AGS ma non nelle cellule Hs746T (Figura 4).

eseguita anche l'analisi percorso di arricchimento sui geni di migrazione delle cellule 65 differenzialmente espressi dopo il trattamento MPA. Le prime cinque percorsi KEGG che risultano significativamente modificati da MPA sono presentati nella tabella 1. I percorsi di orientamento di adesione focale, citoscheletro actina e assoni sono altamente correlate a migrazione cellulare e sono significativamente inibiti dal trattamento MPA, in linea con la riduzione osservata nella capacità di migrazione dell'MPA trattati con cellule AGS. Inoltre, il percorso nel cancro è significativamente inibita da diversi geni svolgono un ruolo importante nella proliferazione cellulare e l'apoptosi. Il TGF-beta è significativamente attivato mediante trattamento MPA e questo risultato è coerente con la funzione di soppressione del TGF-beta e l'attività di MPA nell'inibire la migrazione e proliferazione cellulare.
Pathway Nome
ID
pFDR
Stato
Focal adhesion45101.46E-06InhibitedRegulation di actina cytoskeleton48101.22E-05InhibitedPathways nella segnalazione pathway43500.00021ActivatedTable 1 cancer52002.21E-05InhibitedAxon guidance43600.00016InhibitedTGF-beta. i primi cinque KEGG-percorsi dei geni di migrazione 65 cellule significativamente modificati dal trattamento MPA.
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modifiche alla segnaletica MPA-indotte legate alla migrazione

AKT
è una chiave gene che collega con un gran numero di geni differenzialmente espressi migrazione nei dati microarray. Tuttavia, l'espressione del AKT
geni non era alterato dal trattamento MPA. Inoltre, la proteina totale AKT ha mostrato solo una leggera variazione in momenti successivi (Figura 5A). È interessante notare che, fosfo-Akt (ser473) è stata gravemente diminuita del trattamento MPA (Figura 5A). Questi risultati suggeriscono che MPA può anche alterare la capacità di migrazione delle cellule AGS via influenza sulla stato di attivazione di proteine ​​di segnalazione chiave come AKT, oltre a regolare l'espressione dei geni.

L'espressione dei geni codificanti la src tirosina chinasi è solo marginalmente down-regolato nei dati di microarray. Poiché Src è funzionalmente legato ad un gran numero di geni differenzialmente espressi migrazione nei dati microarray (Figura 3), abbiamo determinato il livello di espressione della proteina di Src e trovato che la proteina è drasticamente regolata mediante trattamento MPA (Figura 5A). Tuttavia, il motivo preciso per le discrepanze genica e proteica osservati non è chiara e deve essere ulteriormente indagato.

MPA-indotta CD147 riduzione

La tirosina chinasi Src trasmette anche i segnali integrine-dipendente centrali per il movimento e la proliferazione cellulare. Diversi differenziali espressi geni ( CEACAM1
e Cyr61
) sono anche implicati nella via di segnalazione integrina. Pertanto, abbiamo analizzato l'espressione di diversi integrine sulla superficie delle cellule AGS e Hs746T utilizzando l'analisi FACS. Anche se l'espressione del CD147
gene non è stato alterato dal trattamento MPA (figura 4), l'espressione della proteina di superficie CD147 è stato drasticamente regolata dopo il trattamento MPA (Figura 5B). Inoltre, l'analisi Western Blot ha anche confermato che la proteina CD147 totale era significativamente down-regolato dal trattamento MPA (Figura 5A). È interessante notare che il trattamento delle cellule MPA Hs746T non ha alterato in modo significativo l'espressione di superficie CD147. L'espressione di ICAM-1 e l'integrina beta 5 non è stato modificato dal trattamento MPA (Figura 5B).

MPA riduce metalloproteinasi della matrice 1 (MMP-1)

Tre proteine ​​MMP sono stati misurati in mezzo di coltura di cellule AGS e Hs746T dopo il trattamento MPA utilizzando saggi Luminex (Figura 6). I livelli di proteina di MMP2 e MMP9 erano molto bassi nel terreno di coltura cellulare AGS (dati non riportati). MMP1 era significativamente ridotta dal trattamento MPA in modo dose-dipendente in terreno di coltura cellulare AGS (Figura 6A), mentre nessun cambiamento significativo è stato osservato in cellule Hs746T (Figura 6B).

Discussione

MPA è noto per inibire specificamente IMPDH, l'enzima limitante per il de novo
sintesi dei nucleotidi guanosina, che sono essenziali per la replicazione del DNA, così come RNA e la sintesi proteica. MPA è anche noto per inibire la proliferazione delle cellule tumorali e indurre l'apoptosi. In questo studio, abbiamo dimostrato per la prima volta che MPA può ridurre significativamente la migrazione e l'invasione capacità delle cellule AGS. Dal momento che la metastasi è un grave problema che i malati di cancro, la capacità del MPA di inibire la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione, oltre alla sua capacità di inibire la proliferazione delle cellule e indurre l'apoptosi, rende MPA un ottimo candidato farmaco anti-cancro.

questo studio abbiamo anche usato una varietà di tecniche molecolari per chiarire i meccanismi molecolari alla base della funzione MPA di inibire la migrazione delle cellule del cancro. In primo luogo abbiamo usato trascrittomica globale analisi per identificare i geni candidati migrazione alterati dal trattamento MPA. Questi studi hanno suggerito 50 geni con 2-4 differenze piega e 15 geni con > 4 differenze di piegatura (figura 2). Questi geni includono i recettori delle cellule superficiali, proteine ​​chinasi, e altri geni coinvolti nella regolazione della migrazione. La validità dei dati microarray è stata confermata mediante real-time RT-PCR per i geni selezionati con > differenze 4 volte (figura 4). Oltre all'analisi trascrittomica, abbiamo utilizzato anche diverse tecnologie di proteomica e funzionali per chiarire i meccanismi molecolari alla base l'attività anti-migrazione di MPA. profiling trascrittomica è una potente tecnologia per valutare i cambiamenti molecolari a livello mondiale. Il principale vantaggio di espressione genica microarray è la sua capacità di valutare rapidamente ed economicamente il pattern di espressione di quasi tutti i geni espressi nelle cellule di interesse. Nonostante la potenza di questa classe di tecnologie, ci sono una serie di problemi che limitano microarray principalmente come strumento ipotesi generatrice. La limitazione più grave è la correlazione imperfetta o la mancanza di correlazione tra l'espressione di geni e proteine ​​di espressione /funzione. Questa carenza è ben illustrato in questo studio come le principali differenze di espressione della proteina di stato di attivazione sono stati modificati da MPA, mentre i livelli di espressione genica sono rimasti invariati. Pertanto, è essenziale per combinare le tecnologie trascrittomica e proteomica per la caratterizzazione globale delle funzioni biologiche
.

Almeno tre geni che sono noti per promuovere la migrazione delle cellule ( INF 2
, DOCK1
, e HSPA5
) sono gravemente down-regolato (> 4 volte) per il trattamento MPA (Figura 2). INF 2
codifica la rovesciata Formin 2 proteine, che promuove la formazione di microtubuli detyrosinated necessarie per centromero riorientamento in cellule migranti [25]. Il dedicante di cytokinesis 1 proteine ​​(DOCK1) interagisce con HER2 e promuove l'attivazione di Rac HER2-indotta e la migrazione delle cellule [26]. HSPA5 è una proteina risposta allo stress indotto da agenti o condizioni che influenzano negativamente la funzione reticolo endoplasmatico. E 'un controllo attivo della più fenotipi maligni, tra cui la crescita cellulare, la migrazione e l'invasione. Down-regolazione di questi geni di MPA è coerente con la ridotta capacità migratoria delle cellule AGS dopo il trattamento MPA. Al contrario, la sovraespressione di β-arrestina-1 ( ARRB1
) ha ridotto la propensione migratoria di cancro al seno linee cellulari, mentre a tacere aumento della migrazione [27]. In uno studio più recente [28], ARRB1
è stato trovato per promuovere la capacità migratoria delle migrazioni cancro ai polmoni. Pertanto, non è chiaro in questo momento se ARRB1
inibisce o promuove la migrazione delle cellule AGS. Un altro gene drasticamente down-regolato, IGFBP5
, induce l'adesione delle cellule e aumenta la sopravvivenza delle cellule in cellule MCF-7 cancro al seno umano [29]. IGFBP5 sembra inibire la migrazione delle cellule MCF7 [29], ma promuove la migrazione delle cellule mononucleari del sangue periferico [30]. Pertanto, il ruolo di IGFBP5 sulla migrazione delle cellule AGS Resta da stabilire.

trattamento MPA di cellule AGS significativamente up-regolata l'espressione di un certo numero di geni implicati nella migrazione delle cellule. Tra questi, sette geni ( ATF3
, SMAD3
, CITED2
, CEAMCAM1
, Cyr61
, NOS3
e CDH10
) sono di grande interesse in quanto mostrano differenze più di quattro volte del heatmap microarray (Figura 2). Due dei sette geni ( ATF3
e CDH10
) sono stati selezionati e confermato mediante real-time RT-PCR. ATF3
espressione è aumentata di 11 volte 12 ore dopo il trattamento MPA e 19 volte a 48 ore. CDH10
espressione è alterata nelle cellule AGS ma non nelle cellule Hs746T (Figura 4). ATF3 è stato recentemente dimostrato di sopprimere metastasi del cancro alla vescica attraverso la regolazione rimodellamento Gelson-mediata del citoscheletro di actina. Sovraespressione di ATF3
in cellule del cancro della vescica altamente metastatico diminuisce la migrazione in vitro
e in vivo
[31]. Il TGF-β /Smad via di segnalazione svolge un ruolo critico nel pancreas crescita adenocarcinoma duttale, la migrazione e la metastasi. silenziamento siRNA mediata SMAD3 aumenta la migrazione delle cellule del cancro del TGF-β-indotta [32]. Coerentemente con la ridotta capacità migratoria delle cellule AGS dopo il trattamento MPA, SMAD3 è significativamente up-regolato dal trattamento MPA (Figura 2). CITED2
codifica l'/p300 interagenti transactivator 2 proteina CBP che regola positivamente la segnalazione attraverso la sua associazione con il /CBP-mediata complesso trascrizionale coactivator SMAD /p300 TGF-β e stimola diverse altre attività trascrizionale. E 'stato dimostrato che Cited2
topi knockout hanno aumentato la migrazione delle cellule delle gonadi [33]. Pertanto, up-regolata CITED2
espressione genica possono contribuire alla ridotta capacità migratoria delle cellule AGS trattata con MPA. CEACAM1
codifica il carcinoembrionario molecola di adesione delle cellule antigene-correlato (CD66a), che colpisce la segnalazione integrina-dipendente e regola extracellulare morfologia specifica di proteine ​​della matrice e la migrazione delle cellule endoteliali [34]. Sebbene molti studi hanno dimostrato che CEACAM1 solo svolge un ruolo promigratory, l'interazione di CEACAM1 e filamina Una migrazione e la cella di scattering drasticamente ridotta [35]. Pertanto, il ruolo di CEACAM1 nella migrazione cellulare può dipendere dal contesto cellulare.

Tuttavia, due dei geni altamente up-regolati da MPA ( Cyr61
e NOS3
) in realtà promuovere la migrazione. Cyr61
codifica per la proteina ricca di cisteina 61, che promuove la migrazione cellulare tramite l'alterazione delle funzioni di integrina [36]. L'up-regolazione di Cyr61
da trattamento MPA può ridurre il ruolo anti-migratoria di MPA. L'ossido nitrico promuove la migrazione delle cellule tumorali mammarie attraverso l'attivazione sequenziale di ossido nitrico sintasi, guanilato ciclasi e proteina chinasi attivata dal mitogeno [37]. NOS3
codifica l'ossido nitrico sintasi 3 ed è altamente up-regolati dal trattamento MPA. Anche in questo caso, up-regolazione di NOS3
può ridurre la funzione antimigratory dell'MPA. Il CDH10
gene codifica per una delle proteine ​​caderina che giocano un ruolo critico nella adesione cellula-cellula. E 'stato dedotto che CDH10 può giocare un ruolo critico nella migrazione delle cellule mesendodermal anche se questo rapporto dedotto non è stato sperimentalmente testato. CDH10
è drasticamente aumentata di trattamento MPA di cellule AGS, ma non nelle cellule Hs746T e il suo ruolo nella migrazione dovrebbe essere sperimentalmente testati.

PDGFRA
codifica per una superficie cellulare tirosin-chinasi del recettore membro della famiglia del fattore di crescita derivato dalle piastrine ed è noto per essere strettamente correlato con la migrazione delle cellule [38]. Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 (LRP8), noto anche come apolipoproteina E recettore 2 (ApoER2), è un recettore sulla superficie cellulare con un dominio EGF-like. Questi recettori funzionano nella trasduzione del segnale e endocitosi di ligandi specifici. LRP8 è noto a svolgere un ruolo importante nella migrazione neuronale embrionale [39]. ligando extracellulare legame LRP8 e un recettore correlato, VLDLR, sui neuroni che migrano attiva processi intracellulari che iniziano con la fosforilazione DAB1 [39]. DAB1, una proteina fosforilata tirosina chinasi, può essere fosforilata da due tirosin-chinasi (SRC e Fyn) e fosforilata DAB1 inoltre induce attivazione di questi due chinasi e altre chinasi, tra cui PI3K. Fosforilata PI3K può portare alla fosforilazione inibitorio del tau chinasi glicogeno sintasi chinasi 3 beta (GSK3B), che altera l'attività delle proteine ​​tau che è coinvolto nella stabilizzazione dei microtubuli. PI3K può anche fosforilare proteine ​​proteina chinasi C (PKC), che fosforilano una vasta gamma di bersagli proteici e sono noti per essere coinvolti in diverse vie di segnalazione cellulare.

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