Plos ONE: Mikofenolna kislina zavira migracije in Invazija želodca raka celic prek več molekularnih poteh,

Povzetek

Mikofenolna kislina (MPA) je presnovi izdelek in aktivni element mofetilmikofenolata (SDT), ki se pogosto uporablja za preprečevanje akutne zavrnitve presadka. MPA močno zavira inozin monofosfat dehidrogenaze (IMPDH), ki je navzgor regulirano v številnih tumorjih in MPA je znano, da inhibira proliferacijo rakavih celic, kot tudi fibroblast in endotelijsko celično migracijo. V tej študiji smo dokazali prvič MPA je antimigratory in anti-invasion zmožnosti MPA občutljivih AGS (rak želodca) celic. Genome vsej izraz analizo z uporabo Illumina celotnega genoma mikromrež ugotovljenih 50 genov z ≥ 2 kratnih spremembah in 15 genov z > 4 krat spremembe in več molekularne poti vpleteni v celični migraciji. Realnem času RT-PCR analize izbranih genov potrdili tudi razlike izražanja. Poleg tega ciljno proteomskimi analize ugotovljenih več proteinov z obdelavo MPA spremenjenih. Naši rezultati kažejo, da MPA modulira migracije želodčni rak celic z zmanjšanjem števila velikega števila genov ( PRKCA
, DOCK1
, INF2, HSPA5, LRP8
in PDGFRA
) in beljakovine (PRKCA, AKT, SRC, CD147 in MMP1) z promigratory funkcij, kot tudi up-regulacijo številnih genov z antimigratory funkcij ( ATF3
, SMAD3
, CITED2
in CEAMCAM1
). Vendar pa je nekaj genov, ki lahko spodbujajo migracije ( CYR61
in NOS3
) so up-urejena. Zato je celotna antimigratory vloga MPA na rakave celice odraža ravnotežje med promigratory in antimigratory signalov z obdelavo MPA vplivom

Navedba. Dun B, Sharma A, Teng Y, Liu H, Purohit S, Xu H, et al . (2013) Mikofenolna kislina zavira migracije in Invazija želodca raka celic prek več Molecular Poti. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10,1371 /journal.pone.0081702

Urednik: Ying Xu, University of Georgia, Združene države Amerike

Prejeto: 27. julij 2013; Sprejeto: 15. oktober 2013; Objavljeno: 15. november 2013

Copyright: © 2013 Dun et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Študija je bila podprta s sredstvi iz Regents univerze Georgia. JXS ga Georgia Research Alliance delno podprta uglednega znanstvenika. Financer imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Najbolj trdni tumorji so v veliki meri ozdravljiv, če so diagnosticirati in zdraviti pred razširjanjem izven prvotnega primarnem mestu. Vendar, ko tumorjev razširil na druge lokacije, ki jih običajno postanejo zelo morbidno in verjetno ploda. Zato je nujno, da se omeji začetni širjenje in preprečitev širjenja sekundarni. Invasion in metastaze dva glavna načina širjenja tumorja, vsak poganja različnih mehanizmov in vodijo v različne terapevtske izzivi [1]. Vendar pa oba oblike razširjanja zahtevajo gibanje celic iz primarnih mest na sekundarni lokaciji ter ponovno vzpostavitev in preživetje tumorskih celic v srednjih lokacijah. Ti procesi se izvede preko kaskade molekulskih sprememb v rakavih celic. Čeprav je bil molekularni mehanizem migracije osnovna celica temeljito raziskano, lahko nove vpogled v molekularnih dogodkov, zagotavljanje novih terapevtskih pristopov. Dejansko so zaviranje molekul, ki spodbujajo migracijo celic in regulacijo navzgor molekul, ki inhibirajo migracijo celic skozi farmakoloških intervencij postal pomemben del weaponries za boj proti raku. Razvoj ali repurposing dodatnih zdravil, ki zavirajo migracijo in invazija je pomembno nenehno prizadevanje za zdravila proti raku.

Mofetilmikofenolata (SDT) je bil odobren za preprečevanje akutne zavrnitve presadka pri ledvic, srca in jeter presaditvi [ ,,,0],2,3]. SDT je ​​morfolinoetilni ester predzdravilo z dne mikofenolne kisline (MPA), ki je močan nekompetitivni zaviralec inozin monofosfat dehidrogenaze (IMPDH), ki omejuje hitrost encim za de novo
Sinteza gvanozin nukleotidov [4,5 ], ki igrajo ključne vloge v celično proliferacijo in drugih celičnih funkcij, vključno s podvajanjem DNK, RNK in sintezo beljakovin in celično signalizacijo [6]. Zato MPA bloki T in B limfocitov proliferacijo in klonsko širitev, in preprečuje nastajanje celic T citotoksičnih in druge efektorske T celice. Drugi mehanizmi lahko prispevajo tudi k učinkovitosti MPA pri preprečevanju zavrnitve presadkov. Skozi izčrpavanje Gvanozin nukleotidov, lahko MPA zatreti glikozilacijo in izražanje različnih adhezijskih molekul, s čimer bi zmanjšali zaposlovanje limfocitov in monocitov v mestih zavrnitve vnetje in presadka [5].

Ker IMPDH izraz je precej up-urejena v številnih tumorskih celic [7,8], je zato potencialno primerna za zdravljenje raka, poleg imunskega kemoterapijo. MPA /SDT so poročali, da inhibira proliferacijo rakavih celic in inducira apoptozo v mnogih rakavih celic [9-14]. MPA /MMF so poročali tudi, da zavira migracije fibroblastne celice [15] in človekovih popkovna venskih endotelnih celic (HUVECs) [16]. Vendar pa ni znano, ali lahko MPA spremeni sposobnost migracije in invazijo rakavih celic. Poleg tega so natančne migracije signalne poti in efektor molekul temeljne dejavnosti MPa ostajajo nedosegljiva.

V tej raziskavi smo najprej pokazali, da MPA bistveno spremeni migracije in invazijo sposobnost AGS celic smo nato uporabili izražanje genov in proteomskimi tehnologij za identifikacijo genov in proteinov, ki vplivajo na te funkcije.

Materiali in metode

celične linije, reagenti in protitelesa

Dve želodčni rak celične linije (AGS in Hs746T) so bili pridobljeni iz American Type Culture Collection (ATCC). Obe celični liniji smo gojili v RPMI 1640 mediju, ki vsebuje 10% fetalnega govejega seruma, 100 enot /ml penicilina in 100 ug /ml streptomicina pri 37 ° C s 5% CO2. MJU je bila kupljena od VWR. CD147 je protitelo integrin beta5 kupili od Abcam, na GAPDH in ICAM-1antibodies iz Santa Cruz; Src, Akt, in p-Akt (Ser473) protitelesa iz signalizacijo med celicami.

In vitro trans-ter migracije in invazijo testi

Cell migracije je bilo opravljeno s Transwell (Costar) sistem, ki omogoča celice migrirajo skozi 8-im velikost por polikarbonatno membrano. Na kratko, so v serumu sestradana AGS ali HS746T celic dodali v zgornjo komoro (5 x 104 celic na vložku) in gojišče DMEM z različno koncentracijo MPA (1 pg /ml, 1.5μg /ml in 2 u.g /ml) smo uporabili kot chemoattractant v spodnji komori. Po inkubaciji pri 37 ° C 8 ur, so bile celice v spodnji komori določene v metanolu in obarvamo z 0,2% kristal vijolično. Številke, ki se selijo celic v devetih naključno izbranih področjih iz trojnih komor so prešteti v vsakem poskusu pod fazno kontrastnim mikroskopom. Invazivnega potenciala celic smo analizirali z uporabo Študiie obložene modificiran Boyden komoro (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA), kot je predhodno opisan [17]. DMEM, ki vsebuje mikofenolno kislino dodamo k spodnji komori. Po inkubaciji pri 37 ° C za 24 ur, je preštejemo število celic, ki napadel na spodnji strani zgornje komore.

Micorarray poskusi

Celotna RNA je bila ekstrahirana iz AGS celic z uporabljanjem magnatic kroglice RNA črpanje kit (Jinfiniti Biosciences, Augusta, GA). Izražanje genov profiliranje je bila izvedena s pomočjo človeka Illumina HumanHT-12 v4 BeadChip (Illumina, San Diego, CA). Alikvot 200ng celotne RNA smo pretvorili v dvojnoverižna cDNA (ds-cDNA) z uporabo kompleta za označevanje Illumina TargetAmp-Nano z oligo-dT osnovni premaz vsebuje promotor T7 RNA polimerazo (Genset, St. Louis, MO). In vitro
prepis je bila izvedena na zgoraj DS-cDNA z uporabo kompleta za označevanje Prepis Enzo RNA. Biotin označenega Črna očistimo z uporabo RNeasy afiniteto stolpec (Qiagen) in razdrobljeni naključno velikosti od 35-200 baz z inkubacijo pri 94 ° C za 35 minut. Hibridizacije rešitve vsebovane 100mm STG, 1 M NA ^{+, 20 mM EDTA, in 0,01% Tween 20. Končna koncentracija razdrobljenega Črna je bila 0,05 g /ul v raztopini hibridizacije. Ciljni za hibridizacijo smo pripravili z združevanjem 40 xl razdrobljenega transkripta s sonicirali sled sperme DNA (0,1 mg /ml), BSA in 5nm kontrolnega oligonukleotida v pufru, ki vsebuje 1,0 M NaCI, 10 mM Tris.HCl (pH7.6) in 0,005 % Triton X-100. Ciljni smo hibridizirali pri 16 h pri 45 ° C v Illumina hibridizacije pečici. Čipi so bili nato izperemo pri 50 ° C s strogimi raztopino, nato pa še pri 30 ° C z ne-strogimi opere. Polja so nato obarvali z streptavidina-Cy3. Podatki o mikromrež so MIAME skladna in so shranjeni v NCBI Gene Expression Omnibus in so dostopni preko GEO Series pristop številko GSE46671.}

realnem času RT-PCR analizo

alikvot celotne RNA ( 2 u.g na vzorec) smo oblečen v 96 vdolbinami in se nato pretvori v cDNA z uporabo visoko sposobnost cDNA povratne Transcription Kit (Applied Biosystems) in PTC-100TM programabilni toplotno krmilnik (MJ Research, Inc.). Proizvodi cDNA smo uporabili za kvantitativno PCR v realnem času z uporabo pripravljene za uporabo TaqMan genske ekspresije teste od Applied Biosystems. Pet referenčne geni z relativno konstantno izražanja (GAPDH, ITR, GUSB, IPO8 in MRPL19), so bili uporabljeni za normalizacijo koncentracije RNA. PCR v realnem času smo izvedli z 96x96 Fluidigm ekspresivnih čipov. Standardni kolesarjenje stanje termalne (10 min pri 95 ° C 40 ciklov za 15 sekund pri 95 ° C, 1 minuta pri 60 ° C) smo uporabili za vse gene. Vsi vzorci so bili analizirani na isti plošči in vsak vzorec smo analizirali v dvojniku.

Western blot

Celice so bile pobrane in v PBS. Po centrifugiranju pri 2000rpm za 5 min, pelet lizirali v ledeno mrzlo M-PER sesalcev protein Pridobivanje reagent, ki vsebuje 1% zaustavitev proteaz in Fosfataza zaviralcem Cocktail (Thermo Scientific) za 30 minut. Supernatant smo zbrali po 10 min centrifugiranjem pri 12000rpm, s spektrofotometrijo znašala, denaturiran z vzorcem pufra 10 minut pri 95ᵒC in shranimo pri 4 ° C za nadaljnjo uporabo. Proteine ​​smo ločili z 10% SDS-poliakrilamidnem gelu in prenesli na PVDF membrano (Bio-Rad) ter inkubirali s primarnimi protitelesi interesa pri 4 ° C preko noči. Dodamo 10000 v pufru (3% BSA-TBST) blokiranje in inkubiramo 1 h pri sobni temperaturi: primeren hrenovo konjugirano sekundarno protitelo po razredčenju 1. Vse protitelesa smo razredčili v 3% BSA-TBST. Immunoblots bil razvit z uporabo ECL kemiluminescenco reagenta (Thermo Scientific).

pretočno citometrijo

Celice tripsiniziramo in dvakrat sprali v PBS. Približno 1x10 ^{6 celice inkubiramo z 1 pg anti-CD147, anti-ICAM-1 in anti-integrinov beta 5 protitelesi za 30 minut, sprani z PBST dvakrat, nato inkubiramo s sekundarno protitelo konjugirano s TRITC ali APC za 30 minut, in dvakrat speremo s PBST. Analize tok citometrije so bile izvedene na FACScaliburTM tok citometrom z CELLQuestTM programske opreme (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, ZDA).}

Luminex test

MMP beljakovine v gojišče tako so bile izmerjene z uporabo Luminex kompleti iz Millipore Company (Billerica, MA, ZDA), v skladu s priporočili proizvajalca. Medij celične kulture (1:10 razredčitev) je bil inkubiran s mikrokroglic-protiteles povezan in nato z biotiniliranega protitelesca zaznavanje pred dodatkom streptavidina-fikoeritrin. Ujete noge kompleksi so bile izmerjene z FLEXMAP 3D sistem (Luminex, Austin, TX). Mediana fluorescenčna intenziteta (MFI), smo zbrali in se uporablja za izračun koncentracij beljakovin.

Statistična analiza

Vse statistične analize smo opravili s pomočjo jezika R in okolje za statistično računalništva (www.r projektu. org). Primerjave med skupine sredstev so prispevali ANOVA (za ≥ 3 skupine), nato pa par-pametno primerjave z uporabo Bonferroni post-hoc testiranje. Statistična pomembnost razlik je bila določena na P < 0,05.

Paket lumi je bila uporabljena za podatke vnaprejšnjo obdelavo mikromrež. Razlika izraz analize smo opravili z uporabo paketa limma iz projekta Bioconductor [18]. Uporabili smo lažno stopnjo odkrivanja (FDR) prilagoditi za večkratno testiranje [19]. Kombinacija prilagojenega p-vrednosti in absolutno vrednostjo kratnega spremembe (FC), so bili uporabljeni za izbiro diferencialno izraženih genov.

Analiza Cluster je bila opravljena za združevanje diferencialno izraženih genov, ki kažejo podobne izrazne vzorce s programom HPCluster [20]. Bioconductor paket "GOstats" The smo uporabili za testiranje združenje Gene ontologijo smislu (bioloških procesov) z različno izraženih genov [21] A p-vrednost, ki temelji na hipergeometrične testu je bila izračunana za oceno, ali je število genov, povezanih z izrazom je večji od pričakovanega. V p-vrednosti, dobljene so bile prilagojene za večkratno testiranje po FDR. Seznam gen smo analizirali tudi s pomočjo prebuild kegg poti. Uporabili smo "spia" (signalne analize vpliva Pathway) paket za identifikacijo poti, ki so jih opazili spremembe v izražanju genov [22] vplivali. Analiza omrežja je bila izvedena za gradnjo interakcije omrežij molekularne z uporabo podatkovne baze string [23]. Mreže so bile uvožene v preprosti obliki interakcij na Cytoscape za vizualizacijo [24].

Rezultati

MPA zavira migracije AGS celic in invazija

migracijski Sposobnost dveh želodca raka celičnih linijah (AGS in Hs746T) z in brez zdravljenja MPA je bila ocenjena s pomočjo 8μm pore transwell komore brez Matrigel. Kot je prikazano na sliki 1A, odstotki selijo AGS celic zmanjšal na način, ki MPA odvisen od odmerka, zmanjšanje na manj kot 50% AGS celic kontrole pri koncentracijah > 1.5μg /ml. Vendar pa je bil migracijski sposobnost Hs746T celic MJU ne vpliva na podobnih koncentracijah. Podobno je celica invazija testiramo z uporabo 8μm por Biocoat Matrigel 8-mikronsko invasion komore (slika 1B). Zdravljenje MPA tudi bistveno zmanjšalo preplavljajo sposobnost AGS celic, vendar ne Hs746T celic.

MPA-induciranih genske ekspresije spremembe, povezane z migracijo karcinom

Za identifikacijo genov z obdelavo MPA spremenjenih, smo izvedli globalna transcriptomic profiliranje eksperiment z AGS celicah, obdelanih z MJU. Uporaba celotno izražanje genov nabor podatkov, smo ugotovili kegg poti, ki so bistveno spremenjene MJU. Osem od desetih najboljših bistveno spremenile poti (p53 signalnih, celičnega ciklusa, poteh pri raku, PPAR signalizaciji, raka na mehurju, predelavo beljakovin v ER, drobnocelični pljučni rak in MAPK signalizacija), je dobro znano, da je v zvezi z rakom. Različno izražene gene so preslikane tudi biološke procese Gene ontologijo in hipergeometrična Testiranje je bilo izvedeno oceniti pomen obogatitve za vsako kategorijo. Naša analiza je pokazala, da so zelo obogatene geni vpleteni v celični cikel (1,6-krat obogatitev, p < 10 ^{-5), celična smrt (1,7-krat obogatitev, p < 10 -7), razmnoževanje celic (1,8-krat obogatitev, p < 10 -7), in celične migracije (1,5-krat obogatitev, p < 0,005). globalni podatki o genski izraz so v skladu z dejavnostjo MPA pri zaviranju raka proliferacije celic, indukcijo apoptoze in inhibicije migracije.}

Ker je glavni cilj te študije za pojasnitev molekularni mehanizem, ki je podlaga vpliva MPA o migracijah rakavih celic, smo analizirali podrobno 50 v zvezi z migracijami genov z 2-4-kratno razliko in 15 v zvezi z migracijami genov z ^ 4-krat razlike med obdelanih in neobdelanih AGS celic (slika 2). Štiri različne gruče genov so priznane. Geni cluster 1 so hitro gor, urejena v času, ko 12h točke in dosegel najvišjo vrednost v 24h časovni točki, vendar nekoliko navzdol pozneje urejena. Grozd 2 geni so nekoliko povečale ob 24h časovni točki, nato pa postane bolj reguliran na 48 urah in 72 ur časovnih točkah. Geni grozd 3 so hitro navzdol urejeno na 12h in 24h časovnih točkah, vendar navzdol uredbe postane veliko manj v kasnejših časovnih točkah, medtem ko so cluster 4 geni navzdol urejeno na 24 in poznejših obdobjih. Funkcionalne razmerja med temi geni so upodobljeni v genski regulativne mreže (slika 3). Pozneje smo ocenili tudi veljavnost podatkov izražanja z analizo podmnožice kandidatnih genov, ki uporabljajo v realnem času RT-PCR (slika 4). Drugačen nabor vzorcev RNA so bili pridobljeni v različnih časovnih zdravljenje točk (0, 12, 24 in 48 ur po zdravljenju) iz MPA-občutljive AGS celic in MPA-neobčutljivih Hs746T celic.

MPA zdravljenje močno navzdol regulirane dve celične površine receptorjev geni ( PDGFRA
in LRP8
), protein kinaze gen ( PRKCA
), in pet drugih genov ( INF2
DOCK1
, HSPA5
, ARRB1
in IGFBP5
) (slika 2). Šest od teh genov so bili izbrani za potrditev RT-PCR in vseh šest genov so potrdili, da so občutno MPA navzdol regulirano v AGS celice, ki so občutljive na MPA (slika 4). Zanimivo je, da je večina teh genov niso bistveno z obdelavo MPA v Hs746T celice, ki so neobčutljivi na zdravljenje MPA (slika 4) navzdol reguliran.

Poleg zdravljenje MPA od AGS celic močno navzgor regulirano ekspresijo veliko število genov vpletenih v migracijo celic. Sedem geni ( ATF3
, SMAD3
, CITED2
, CEAMCAM1
, CYR61
, NOS3
in CDH10
) imajo več kot štiri-kratno razliko in so označene v mikromrež Toplotna slika (slika 2). Real-time RT-PCR potrdili, da ATF3
se poveča za 10-20 gub v celicah AGS po zdravljenju MPA, medtem ko se je povečal le za 2-3 gub v Hs746T celicah (slika 4). Podobno zdravljenje MPA znatno povečal CDH10
izraz v AGS celic, vendar ne v Hs746T celicah (slika 4).

Prav tako smo izvedli analizo obogatitev pot na migracijskih 65 celic genov različno izraženih po zdravljenju MPA. Prvih pet kegg poti, ki so bistveno spremenjene MJU so predstavljeni v tabeli 1. poti vodstvom osrednja oprijema, aktin skeleta in AXON so zelo povezane z migracijo celic in znatno zavira zdravljenje MPA, ki je skladen z opazili zmanjšanje sposobnosti migracij MPA obdelano AGS celice. Poleg tega je pot v raku je tudi močno zaviral kot nekaj geni igrajo pomembno vlogo v celično proliferacijo in apoptozo. TGF-beta steze je pomembno aktivira z obdelavo MPA in ta ugotovitev v skladu s funkcijo dušenja TGF-beta in aktivnosti MPa pri inhibirajo migracijo celic in proliferacijo.
Pathway Ime
ID
pFDR
Status
kontaktno adhesion45101.46E-06InhibitedRegulation aktina cytoskeleton48101.22E-05InhibitedPathways v cancer52002.21E-05InhibitedAxon guidance43600.00016InhibitedTGF-beta signalizacija pathway43500.00021ActivatedTable 1. Prvih pet kegg-poti migracije 65 celic genov pomembno spremenila zdravljenje MPA.
CSV prenos CSV

MPA-inducirane spremembe signalnih v zvezi z migracijo

AKT
je ključni gen, ki povezuje z velikim številom migracijskih genov različno izražena v podatkih mikromrež. Vendar pa izraz AKT
geni ni bil spremenjen z obdelavo MPA. Poleg tega skupna AKT protein je pokazala le majhno spremembo v poznejših obdobjih (slika 5A). Zanimivo je, da je fosfo-Akt (Ser473) močno zmanjšala za zdravljenje MPA (slika 5A). Ti rezultati kažejo, da lahko MPA spremeni tudi migracije sposobnost AGS celice preko vpliva na stanje aktivacije ključnih signalnih proteinov, kot AKT, poleg reguliranje ekspresije genov.

izražanje genov kodira src tirozin kinaze je le malo navzdol urejena podatkov mikromrež. Ker je Src funkcionalno povezan z velikim številom migracijskih genov različno izražene v podatkih mikromrež (slika 3), smo določili stopnjo protein ekspresije Src in ugotovili, da je protein drastično z obdelavo MPA (slika 5A) navzdol reguliran. Vendar pa je natančen razlog za opazovanih genov in izražanja proteina neskladij je nejasno in je treba še dodatno raziskati.

MPA-inducirane CD147 zmanjšanje

Src tirozin kinaze prenaša tudi integrin odvisna od signalov centralne za gibanje celic in orožja. Več diferencialno izraženih genov ( CEACAM1
in CYR61
), so prav tako vpleteni v integrin signalne poti. Zato smo analizirali ekspresijo več integrinov za AGS in Hs746T površini celic z uporabo FACS analize. Čeprav izraz CD147
gen ni spremenila zdravljenje MPA (slika 4), površina proteinski izraz CD147 je dramatično navzdol regulirano po zdravljenju MPA (slika 5B). Poleg tega, Western blot analiza prav tako potrdila, da je bila celotna CD147 beljakovin močno navzdol ureja obdelavo MPA (slika 5A). Zanimivo je, da zdravljenje MPA od Hs746T celic ni bistveno spremenila površine izraz CD147. Izraz ICAM-1 in integrin beta 5 ni bila spremenjena z obdelavo MPA (slika 5B).

MPA zmanjšuje matrix metalo-1 (MMP-1)

Tri MMP proteinov smo izmerili v gojišče za AGS in Hs746T celic po obdelavi MPA uporabo Luminex teste (slika 6). Ravni proteinske MMP2 in MMP9 bila zelo nizka AGS mediju celične kulture (podatki niso prikazani). MMP1 je bistveno zmanjšajo s čiščenjem MPA na način, ki je odvisen od odmerka v AGS mediju celične kulture (slika 6A), pa niso bile pomembne spremembe opazili Hs746T celic (slika 6b).

Diskusija

MPA je znano, da specifično inhibira IMPDH, ki omejuje hitrost encim za de novo
sintezo gvanozinskih nukleotidov, ki so bistvenega pomena za replikacijo DNK, kot tudi RNA in beljakovin. MPA je tudi dobro znano, da inhibira proliferacijo rakavih celic in inducira apoptozo. V tej študiji smo pokazali prvič, da lahko MPA znatno zmanjšali migracije in invazijo sposobnosti AGS celic. Ker metastaze je glavna težava bolnikov z rakom, sposobnost MPA, da zavirajo migracijo celic raka in invazije, poleg njegovo sposobnost, da zavira celično proliferacijo in inducira apoptozo, zaradi česar MPA odlična kandidatka proti raku drog.

te študije smo uporabili tudi različne molekularnih tehnik za pojasnitev molekularne mehanizme, ki podpirajo funkcijo MPA, da zavira migracije rakavih celic. Najprej smo se uporablja globalna transcriptomic analize ugotoviti kandidatke migracije gene z obdelavo MPA spremenjenih. Te študije kažejo, 50 genov z 2-4-kratno razliko in 15 genov z > 4 krat razlike (slika 2). Ti geni vključuje površinske receptorje celic, protein kinaz in drugih genov, ki sodelujejo pri urejanju migracij. Veljavnost podatkov mikromrež je potrdil v realnem času RT-PCR za izbrane gene s > 4-krat razlike (Slika 4). Poleg transcriptomic analizi smo uporabili tudi več proteomskimi in funkcionalne tehnologije za pojasnitev molekularne mehanizme, ki podpirajo aktivnost anti-migracijo MPA. Transcriptomic profiliranje je zmogljiva tehnologija za ocenjevanje globalnih molekularne spremembe. Glavna prednost genske ekspresije mikromrež je njegova sposobnost, da hitro in ekonomično oceni ekspresijski vzorec skoraj vseh genov, izraženih v celicah interesa. Kljub moč tega razreda tehnologije, obstajajo številna vprašanja, ki omejujejo mikromrež predvsem kot orodje hipoteze ustvarjajoče. Najbolj resna omejitev je nepopolna korelacija ali pomanjkanje korelacije med izražanju genov in proteinov izražanja /funkcijo. Ta pomanjkljivost je tudi prikazano v tej študiji, kot so velike razlike v beljakovin izraz stanja aktivacije spremeni MJU, medtem ko so stopnje izraženosti genov nespremenjene. Zato je bistveno, da se združi transcriptomic in proteomskimi tehnologij za svetovno karakterizacijo bioloških funkcij.

Vsaj tri gene, ki so znani za spodbujanje celične migracije ( INF2
, DOCK1
in HSPA5
) so močno navzdol reguliranim (^ 4-krat) z obdelavo MPA (slika 2). INF2
kodira obrnjeno Formin 2 protein, ki spodbuja nastajanje detyrosinated mikrotubulov, ki so potrebni za Centromera preusmeritev pri prehodu celic [25]. Dedicator od cytokinesis 1 (DOCK1) beljakovin sodeluje s HER2 in spodbuja-HER2 povzroča aktivacijo RAC celic migracije [26]. HSPA5 je protein odgovor stres, ki ga zastopniki ali pogojev, ki negativno vplivajo na endoplazmatskem funkcijo retikulum povzroča. Aktivno ureja več maligni fenotipi, vključno s celično rast, migracije in invazije. Dol-regulaciji teh genov s strani MJU je v skladu z znižanim migracijskega zmogljivosti AGS celic po obdelavi MPA. V nasprotju s čezmernim beta arestina-1 ( ARRB1
) zmanjšalo migracijski nagnjenost celic raka dojke linij, medtem ko utišanje povečane migracije [27]. V bolj nedavni študiji [28], ARRB1
je bilo ugotovljeno, da spodbuja migracijskega sposobnost migracije pljučnega raka. Zato je jasno, v tem trenutku, ali ARRB1
zavira ali pospešuje migracije v AGS celicah. Druga drastično navzdol urejeno gen, IGFBP5
, inducira celično adhezijo in poveča preživetje celic v MCF-7 človeških celic raka dojke [29]. IGFBP5 zdi, da zavirajo migracijo MCF7 celic [29], vendar spodbuja migracijo enojedrnih celicah periferne krvi [30]. Zato ostaja vloga IGFBP5 o migraciji AGS celic je treba določiti.

MPA zdravljenje AGS celic tudi bistveno navzgor regulirano ekspresijo številnih genov vpletenih v migracijo celic. Med njimi je sedem genov ( ATF3
, SMAD3
, CITED2
, CEAMCAM1
, CYR61
, NOS3
in CDH10
) so zelo zanimivi, saj kažejo več kot štirikrat razlike v mikromrež Toplotna slika (slika 2). Dva od sedmih genov ( ATF3
in CDH10
), ki ga v realnem času RT-PCR so bili izbrani in potrjeni. ATF3
izraz se je povečala za 11-krat, 12 ur po zdravljenju MPA in 19-krat v 48 urah. CDH10
izraz se spremeni v AGS celic, vendar ne v Hs746T celicah (slika 4). ATF3 je bila nedavno pokazala, da zatre metastaze raka mehurja skozi regulacijo Gelson posredovanega preoblikuje aktinu citoskeleta. Čezmerno ATF3
in zelo metastatskega raka sečnega mehurja celic zmanjšuje migracijo in vitro
in in vivo
[31]. TGF-β /Smad signalne poti igra ključno vlogo pri trebušne slinavke duktalni rasti adenokarcinomom, migracije in metastaz. -SiRNA posredovano utišanje SMAD3 povečuje rakavih celic migracije TGF-beta-inducirane [32]. V skladu z zmanjšanim migracijskega sposobnosti AGS celic po obdelavi MPA, SMAD3 je precej up-ureja obdelavo MPA (slika 2). CITED2
kodira /-P300 stiku transaktivator 2 protein CBP, ki pozitivno ureja TGF-ß signalizacija preko svoje povezave z SMAD /P300 /CBP posredovano transkripcijske coactivator kompleksa in spodbuja številne druge transkripcijske aktivnosti. Izkazalo se je, da je so Cited2
knockout miši v povečanem priseljevanju žlez celic [33]. Zato up-urejena CITED2
izražanje genov lahko prispeva k znižanju migracijskega sposobnosti AGS celic, zdravljenih z MJU. CEACAM1
kodira karcinoembrionski povezan antigen oprijem celic molekule (CD66a), ki vpliva na signalizacijo integrin- odvisni in ureja zunajcelični matriks specifični protein-morfologijo in migracije endotelijskih celic [34]. Čeprav je večina študije pokazale, da CEACAM1 sama igra promigratory vlogo, interakcijo CEACAM1 in filamin A drastično zmanjša migracije in celic sipanje [35]. Zato se lahko vloga CEACAM1 v celični migraciji odvisna od mobilnega konteksta.

Vendar sta dva od genov zelo up-ureja MPA ( CYR61
in NOS3
) dejansko spodbujati migracije. CYR61
kodira cistein bogati protein 61, ki spodbuja migracijo celic preko spreminjanja funkcij integrin [36]. Up-ureditev CYR61
z obdelavo MPA lahko zmanjša proti migracijski vloga MJU. Dušikov oksid spodbuja mlečne migracijo tumorskih celic z zaporedno aktivacijo sintaze dušikovega oksida, gvanilat ciklaze in z mitogeni aktivirani protein kinaze [37]. NOS3
kodira oksid sintaze dušikovega 3 in je zelo z obdelavo MPA reguliran. Spet up-regulacijo NOS3
lahko zmanjša antimigratory funkcijo MJU. CDH10
kodira eno kadherina beljakovin, ki igrajo ključne vloge v adhezijo celic celic. Ugotovljeno je bilo sklepati, da lahko CDH10 igrajo pomembno vlogo pri prehodu na mesendodermal celic, čeprav je ta povzeta razmerje še ni bilo eksperimentalno preizkušena. CDH10
drastično poveča za zdravljenje MPA z AGS celic, ne pa tudi v Hs746T celicah in njegova vloga na področju migracij je treba eksperimentalno preizkušena.

PDGFRA
kodira tirozin kinaze člana v receptor celične površine na-rastni faktor iz trombocitov družini in je znano, da je tesno povezana s celično migracijo [38]. Lipoproteina nizke gostote povezanih receptorja proteina 8 (LRP8), znan tudi kot apolipoproteina E receptorja 2 (ApoER2), celična površinska receptorja z ESPG podobno domeno a. Ti receptorji delovati signalov in endocitoze specifičnih ligandov. LRP8 je znano, da igrajo pomembno vlogo v zametkih nevronov migracije [39]. Zunajcelični ligand veže na LRP8 in s tem povezano receptor, VLDLR na selijo na nevronih aktivira znotrajcelične procese, ki se začnejo z Dab1 fosforilacije [39]. Dab1, tirozin kinaze fosforilirajo protein, lahko fosforilirajo dvema tirozin kinaz (src in Fyn) in fosforiliranega Dab1 inducira nadaljnje aktiviranje teh dveh kinaz in drugih kinaz, vključno s PI3K. Fosforiliran PI3K lahko privede do zaviralnega fosforilacijo tau kinaza glikogen sintaza kinaza 3 beta (GSK3B), ki spremeni aktivnost proteina tau, ki se ukvarja z stabilizacijo mikrotubularne. PI3K lahko fosforilacije tudi protein kinaza C beljakovine (PKC), ki fosforilacije široko paleto ciljev beljakovin in za katere je znano, da sodelujejo v različnih celičnih signalnih poteh.

• Plos ONE: Resveratrol zavira rast želodčnega raka, ki ga indukcijo G1 faza za prijetje in staranje v SIRT1 odvisnih Manner
• Plos ONE: Skupnosti-Based, Case Control-študija Ocenjevanje Smrtnost Zmanjšanje iz želodca raka, ki jih endoskopske screening v Japan