PLoS ONE: mikofenolio rūgščiai slopina Migracija ir invazija Skrandžio vėžio ląsteles per kelis Molecular kelius

SANTRAUKA

MFR (mikofenolio rūgštis) yra metabolizuojamas produktas ir aktyvus elementas mikofenolato mofetilo (PRF), kuri buvo plačiai naudojamas ūmaus transplantato atmetimo prevencijai. MFR stipriai slopina inozino monofosfato dehidrogenazės (IMPDH), kuris yra iki reguliuojama daugelyje navikų, MPA yra žinoma, kad slopina vėžio ląstelių proliferaciją, taip pat, kad fibroblastai ir endotelio ląstelių migraciją. Šiame tyrime mes parodė pirmą kartą MPa anketa antimigratory ir anti-invazija gebėjimų MFR jautrus AGS (skrandžio vėžio) ląstelių. Genomo išraiška analizės, taikant ILLUMINA visą genomą mikrogardelių nustatytas 50 genus su ≥2 klosčių pokyčius ir 15 genus su > 4 kartus pokyčiai ir daug molekulinio keliai, besiverčiantys ląstelių migraciją. Realaus laiko PGR analizė pasirinktų genų taip pat patvirtino raiškos skirtumus. Be to, tikslingai PROTEOMIKOS analizuoja nustatė keletą baltymų pakeista MPA gydymo. Mūsų rezultatai rodo, kad MFR moduliuoja skrandžio vėžio ląstelių migraciją per žemyn reguliavimo daugelio genų ( PRKCA pervežimas DOCK1
inf2, HSPA5, LRP8 parsisiųsti ir PDGFRA
) ir baltymų (PRKCA, AKT, SRC, CD147 ir MMP1) su promigratory funkcijų, taip pat iki-reguliavimo genų su antimigratory funkcijų (skaičius ATF3
, SMAD3
CITED2 parsisiųsti ir CEAMCAM1
). Tačiau keli genai, kurie gali skatinti migraciją ( CYR61 parsisiųsti ir NOS3
) buvo iki reguliuojama. Todėl, MPa anketa bendras antimigratory vaidmuo vėžinių ląstelių atspindi pusiausvyrą tarp promigratory ir antimigratory signalų daro įtaką MPA gydymo

nurodomoji dalis:. Dan B Sharma A Teng Y Liu H Purohit S Xu O et al , (2013) mikofenolio rūgštis slopina Migracija ir invazija Skrandžio vėžio ląsteles per kelis Molecular kelius. PLoS ONE 8 (11): e81702. Doi: 10,1371 /journal.pone.0081702

redaktorius: Inga Xu universitetas Džordžija, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: July 27, 2013; Priėmė: Balandis 15, 2013 m Paskelbta: Lapkričio 15, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Dan et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. The tyrimą parėmė lėšomis Gruzijos Regents universitete. JXS iš dalies remia Gruzijos mokslinių tyrimų sąjungą kaip žymiam mokslininkui. Finansuotojas neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

solidžiausių navikai yra labai išgydomas, jei jie diagnozuoti ir gydyti prieš sklaidos po pradinio pirminės svetainės. Tačiau, kai augliai išplito į kitas vietas, jie paprastai tampa labai liguistas ir tikėtina, vaisiaus. Todėl, labai svarbu apriboti pradinį sklaidą ir užkirsti kelią antrinei plitimo. Invazija ir metastazės yra du pagrindiniai būdai naviko sklaidos, kiekvienas varo įvairių mechanizmų ir skatinant skirtingų terapinių iššūkių [1]. Tačiau, abu sklaidos formos reikalauja ląstelių judėjimą iš pirminių aikštelių iki antrinio vietą, taip pat atstatymą ir išgyvenimą auglio ląstelių antrinių vietose. Šie procesai yra atliekami per molekulinių pokyčių per vėžinių ląstelių kaskados. Nors molekulinės mechanizmo, lemiančio ląstelių migracija buvo plačiai ištirtas, naujų Įžvalgos molekulinių įvykių gali suteikti naujų gydymo metodai. Iš tiesų, slopinimas molekulių, kurios skatina ląstelių migraciją ir up-reguliavimą molekulių, kurios slopina ląstelių migraciją per farmakologinių intervencijų tapo svarbi dalis weaponries kovos su vėžiu. Plėtros arba repurposing papildomų vaistų, kurie slopina migraciją ir invazija yra pagrindinė nuolatinės pastangos vėžio terapijos.

Mycophenolate mofetil (PRF) buvo patvirtintas ūmios transplantato atmetimo inkstų, širdies ir kepenų transplantacijos [prevencijos ,,,0],2,3]. PRF yra morfolinetilo junginio esterio provaistas mikofenolio rūgšties (MFR), kuris yra stiprus nekonkurencinis inhibitorius inozino monofosfato dehidrogenazės (IMPDH funkciją,), norma ribojantis fermentas de novo
sintezės iš guanozino nukleotidų [4,5 ], kuris atlieka svarbius vaidmenis ląstelių proliferaciją ir kitų mobiliojo ryšio funkcijas, įskaitant DNR replikacija, RNR ir baltymų sintezę ir ląstelių signalizacijos [6]. Todėl, MPA blokai T ir B limfocitų proliferacija ir klonų išplėtimas, ir apsaugo nuo citotoksinių T ląstelių ir kitų efektoriaus T ląstelių kartos. Kiti mechanizmai, taip pat gali prisidėti prie MFR veiksmingumą užkertant kelią implanto atmetimo. Per išnaudosime guanozinas nukleotidų, MFR gali slopinti glikozilinant ir kelių adhezijos molekulių ekspresiją, taip sumažinant limfocitų ir monocitų įdarbinimas į vietas uždegimą ir transplantato atmetimą [5].

Kadangi IMPDH funkciją, išraiška yra gerokai iki reguliuojama daugelyje naviko ląstelių [7,8], ji yra, todėl, potencialiai taikiniu vėžio gydymo be to, imunosupresiniais chemoterapija. MFR /PRF buvo pranešta slopina vėžio ląstelių proliferaciją ir indukuoja apoptozę daugelio vėžinių ląstelių [9-14]. MFR /PRF taip pat buvo pranešta, kad slopina migracijos fibroblastus ląstelių [15], ir žmogaus bambos venos endotelio ląstelių (HUVECs) [16]. Tačiau kol kas nežinoma, ar MFR gali pakeisti migracijos ir invazija pajėgumus vėžio ląsteles. Be to, tikslios migracijos signalizacijos keliai ir Efektorinės molekulės pagrindinės MPa veiklą lieka nepagaunamas.

Šiame tyrime mes pirmą kartą įrodė, kad MFR žymiai keičia migracijos ir invazija gebėjimas AGS ląstelių ir tada mes naudojamas genų ekspresiją ir PROTEOMIKOS technologijas identifikuoti genus ir baltymų pagrindines šias funkcijas.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linijos, reagentai ir antikūnai

du skrandžio vėžio ląstelių linijas (AGS ir Hs746T) buvo gauta iš amerikiečių tipas kultūros kolekcijos (ATCC). Abi ląstelių linijos buvo auginamos RPMI 1640 terpę, turinčią 10% vaisiaus galvijų serumo, 100 vienetų /ml penicilino ir 100μg /ml streptomicino 37 ° C temperatūroje su 5% CO2. MFR buvo įsigytas iš VWR. CD147, integrino beta5 antikūnų buvo įsigytas iš Abcam, kad GAPDH ir ICAM-1antibodies iš Santa Cruz; Src, Akt, ir p-Akt (Ser473) antikūnai iš mobiliųjų signalizacijos.

in vitro Trans-pat migracija ir invazija tyrimai

Mobilusis migracija buvo atliktas su Transwell (Costar) sistema, kuri leidžia ląstelėms migruoti per 8 mikronų akučių dydis polikarbonato membrana. Trumpai tariant, serumo alkanas AGS arba HS746T ląstelės buvo pridėta prie viršutinės kameros (5 × 104 ląstelių viename įterpti) ir DMEM terpėje, turinčioje kitą koncentraciją MFR (1μg /ml, 1.5μg /ml ir 2μg /ml) buvo naudojamas kaip chemoattractant į apatinę kamerą. Po to, kai inkubacijos 37 ° C temperatūroje 8 valandas, apatinėje kameroje ląstelės buvo nustatyti metanolyje ir nudažomi su 0,2% violetinei. Skaičiai migruojančių ląstelių devynių atsitiktinai pasirinktose srityse iš trijų dalių kamerose buvo skaičiuojami kiekvieno eksperimento pagal tam fazinio kontrasto mikroskopu. Invazinių ląstelių potencialas buvo analizuojami naudojant Matrigel dengta modifikuotą Boyden kamerą (BD biologijos mokslų, San Chosė, CA, USA), kaip aprašyta anksčiau [17]. DMEM, kurių sudėtyje yra MPA buvo įtraukta į apatinę kamerą. Po to, kai inkubacijos 37 ° C temperatūroje 24 valandų, buvo suskaičiuotos ląstelių skaičius, kad įsiveržė į apatinę esančias viršutinės kameroje.

Micorarray eksperimentai

bendra RNR buvo išskirta iš AGS ląstelių naudojant priedo A magnatic karoliukai RNR gavybos komplektas (Jinfiniti biomokslai Augusta, GA). Genų ekspresijos atlikta naudojant žmogiškuosius Illumina HumanHT-12 V4 BeadChip (Illumina, San Diegas, CA). Kurio 200ng visų RNR alikvotinė buvo paversta dvigrandq kDNR (DS kDNR) naudojant Illumina TargetAmp-Nano ženklinimo komplektas su oligo-dT gruntas su T7 RNR polimerazės rengėjas (GENSET, St Louis, MO). in vitro
transkripcija buvo atliktas pirmiau DS-kDNR naudojant Enzo RNR stenograma ženklinimo rinkinys. Biotinas žymėto Crna buvo gryninamas naudojant RNeasy giminingumo kolonėlė (QIAGEN), o atskiri atsitiktine tvarka dydis svyruoja nuo 35-200 bazių, inkubuojant 94 ° C temperatūroje 35 min. Hibridizacijos sprendimai esančius 100mm RES, 1 M Na ^{+ 20 mM EDTA ir 0,01% tūrio Tween 20. galutinė koncentracija nevienalytė Juodos buvo 0,05 g /mikrol į hibridizacijos tirpalą. Tikslas hibridizacijos buvo paruošiamas, sumaišant 40 mikrol Fragmentiško transkripto su ultragarsu susmulkintos silkės spermos DNR (0,1 mg /ml), BSA ir 5nm kontrolės oligonukleotido buferiniame tirpale, kuriame yra 1,0 M NaCl, 10 mM Tris.HCl (pH7.6), ir 0,005 % Triton X-100. Tikslas buvo hibridizuoti už 16h 45 ° C temperatūroje į Illumina hibridizacijos krosnį. tada skiedros buvo plaunamos esant 50 ° C su griežtai tirpalo, tada vėl 30 ° C temperatūroje su ne-griežtos plauna. tada masyvai buvo tamsintas su streptavidino-Cy3. Mikrogardeliq duomenys MIAME atitinka ir buvo pervestas į NCBI genų ekspresijos Omnibus ir yra prieinama per gėjų serija inventorinį numerį GSE46671.}

Realaus laiko AT-PGR analizės

visos RNR tirpalo alikvotinės dalies ( 2μg už mėginio) buvo apsivilkusi 96-duobučių lėkštelėse ir paverčiama kDNR naudojant High Capacity kDNR atvirkštinės transkripcijos Kit (Applied Biosystems) ir "PTC-100TM programuojamas šiluminę kontrolierius (MJ Research, Inc.). KDNR produktai buvo naudojami kiekybiniai realaus laiko PGR naudojant paruoštus naudoti TaqMan genų ekspresijos tyrimus, atliekamus iš Applied Biosystems. Penki pagalbos genai su santykinai pastovus išraiškos (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 ir MRPL19) buvo naudojami normalizuoti RNR koncentracija. Realaus laiko PGR buvo atliekama su 96x96 Fluidigm Expression lustai. Standartinis Cikliškas kaitinimas sąlyga (10 min, esant 95 ° C, 40 ciklai 15 s esant 95 ° C temperatūroje, 1 min, esant 60 ° C) buvo naudojamas visų genų. Visi mėginiai buvo analizuojami ant tos pačios plokštelės ir kiekvienas mėginys buvo analizuojamas du kartus.

Imunoblotingo

Ląstelės buvo nukirsta ir sumaišymo PBS. Po centrifugavimo metu 2000rpm 5 min, granulių buvo lizuoti į ledo šalto M-PER žinduolių baltymais gavyba Reagentų, kuriame yra 1% Halt proteazės ir fosfatazės inhibitoriumi kokteilis (Thermo Scientific) 30 min. Supernatantas buvo surinkta po to, kai 10 min centrifuguojant 12000rpm, sudarė spektrofotometriškai, denatūruotas su mėginio buferinio tirpalo 10 min 95ᵒC ir saugomi 4 ° C temperatūroje naudoti ateityje. Baltymai buvo atskirti 10% SDS-poliakrilamido gelyje ir perkelti į PVDF membrana (Bio-Rad), ir inkubuojami su pirminiais antikUnais interesų, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Tinkamas krienų-konjuguoto antrinis antikūnas ne praskiesto santykiu 1:: 10000 su blokuojančiu buferiu (3% BSA-TBST) buvo pridėta ir inkubuojami 1h kambario temperatūroje. Visi antikūnai, praskiesto 3% BSA-TBST. Immunoblots buvo sukurtas naudojant ECL chemiliuminescencine reagento (Thermo Scientific).

tėkmės citometrijos

Ląstelės buvo tripsinizuojamos ir išplauti du kartus PBS. Maždaug 1x10 ^{6 ląstelės buvo inkubuojami su 1μg anti-CD147, anti-ICAM-1 ir Anti-integrino beta 5 antikūnų už 30min, nuplauti PBST du kartus, tada inkubuojamos su antriniais antikūnais konjuguoto su TRITC ar APC už 30min, ir plaunama du kartus PBST. Tėkmės citometrijos analizė buvo atliekama ant FACScaliburTM tekėti citometre su CELLQuestTM Programinė įranga (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, JAV).}

Luminex tyrimas

MMP baltymai kultūrinėje terpėje buvo matuojamas naudojant Luminex rinkiniai nuo Millipore Įmonės (Billerica, MA, JAV) pagal gamintojo rekomendacijas. Ląstelių kultūros terpė (01:10 praskiedimas) buvo inkubuojami su antikūnų-kartu mikrosferas ir tada su biotinilintu aptikimo antikūną prieš streptavidino-fikoeritrinu to. Sugautus granulės kompleksai buvo matuojamas FLEXMAP 3D sistemos (Luminex, Ostinas, TX). Mediana fluorescencijos intensyvumas (PFI) buvo renkami ir naudojami apskaičiuojant baltymų koncentraciją.

Statistinė analizė

Visi statistinės analizės buvo atliekamos naudojant R kalbą ir aplinką Statistiniai vienetai kompiuterijoje (www.r projekte. org). Skirtumai tarp grupių priemonėmis buvo lyginama pagal ANOVA (už ≥ 3 grupes), po to poros išmintingas palyginimų naudojant Bonferroni post-hoc tyrimus. Statistinis reikšmingumas skirtumų buvo nustatytas P < 0,05.

LUMI paketas buvo naudojamas vykdyti išankstinį microarray duomenis. Skirtumas išraiška analizė buvo atlikta naudojant limma paketą iš Bioconductor projekto [18]. Mes naudojome klaidingą atradimas norma (FDR), siekiant prisitaikyti prie kelių bandymų [19]. Patikslintų p-reikšmė ir absoliučiosios vertės kartus kaita (FC) derinys buvo naudojamas atrenkant skirtingai išreikštas genus.

klasterinė analizė buvo atliekama grupuojant skirtingai išreikštas genus matomos panašios išraiškos būdus per HPCluster programą [20]. Į Bioconductor paketų "GOstats" buvo naudojamas tiriant genų ontologijos požiūriu asociaciją (biologinių procesų) su skirtingai išreikštas genų [21] p-reikšmė grindžiama hypergeometric testas buvo skaičiuojamas siekiant įvertinti, ar genų skaičius susijęs su terminu yra didesnis, nei tikėtasi. P-vertės gautos buvo patikslinti daugkartiniam bandymų naudojant FDR. Genas sąraše taip pat buvo analizuojami naudojant prebuild KEGG kelius. Mes naudojome "Spia" (signalinio kelio poveikio analizė) paketą nustatyti kelius įtakojo pastebėtus pokyčius genų ekspresiją [22]. Tinklo analizė buvo atlikta statyti molekulinės sąveikos tinklus per string duomenų bazę [23]. Šie tinklai buvo importuota paprasta sąveika formatu Cytoscape vizualizavimo [24].

Rezultatai

MFR slopina AGS ląstelių migraciją ir invazija

migracijos galimybė iš dviejų skrandžio vėžio ląstelių linijų (AGS ir Hs746T) su ir be MPA gydymo buvo įvertintas naudojant 8μm porų transwell kameras be Matrigel. Kaip parodyta 1A skaičiumi, migruoja AgS ląsteles procentai sumažėjo į MFR nuo dozės priklausomu būdu, sumažinti iki mažiau nei 50% nuo kontrolinio AGS ląstelių, kurių koncentracija > 1.5μg /ml. Tačiau migracijos gebėjimas Hs746T ląstelių nebuvo paveikta panašių koncentracija MFR. Panašiai, ląstelių invazija buvo tiriami naudojant 8μm porų Biocoat Matrigel 8 mikronų invazija kameros (1b pav.) MFR gydymas taip pat žymiai sumažėjo invazija gebėjimas AGS ląstelių, bet ne Hs746T ląsteles.

MFR sukeltos genų ekspresijos pokyčiai, susiję su vėžio ląstelių migracijos

Jei norite identifikuoti genus pakeista MPA gydymo, mes atlikome pasaulinė transcriptomic profiliavimas eksperimentas su AGS ląstelių gydomi MPA. Naudojant visą genų ekspresijos rinkinį, mes nustatyti KEGG kelius, kurie reikšmingai nepakito MFR. Aštuoni iš dešimties ženkliai pasikeis kelius (53 psl signalizacijos, ląstelinio ciklo, kelius vėžio, PPAR signalizacijos, šlapimo pūslės vėžio, baltymų perdirbimo ER, nesmulkialąstelinis plaučių vėžys ir MAPK signalizacijos) yra gerai žinoma, kad vėžys susiję. Į skirtingai išreikšti genai taip pat buvo susietas su Genų ontologija biologinių procesų ir hypergeometric bandymas buvo atliktas siekiant įvertinti praturtėjimo reikšmę kiekvienos kategorijos. Mūsų analizė parodė, kad žymiai pagerinta genai susijęs ląstelės ciklo (1,6 karto sodrinimo, p < 10 ^{-5), ląstelių mirtis (1,7 karto sodrinimo, p < 10 -7), ląstelių proliferaciją (1,8 karto sodrinimo, p < 10 -7), ir ląstelių migracija (1,5 karto sodrinimo, p < 0,005). Pasauliniai genų ekspresijos duomenys sutampa su MPA veiklos slopinimui vėžinių ląstelių proliferaciją, sukeliama apoptozė ir slopinimo migracijos.}

Kadangi pagrindinis dėmesys šiame tyrime yra išsiaiškinti molekulinį mechanizmo, lemiančio MPa anketa poveikį vėžio ląstelių migracija, mes analizuojami išsamiai 50 migracija susiję genai su 2-4 kartų skirtumas, ir 15 migracija susijusių genų su > 4 kartus skirtumai tarp gydytų ir negydytų AGS ląstelių (2 paveikslas). Keturi atskiri klasteriai genų pripažįstami. Klasterio 1 genai yra greitai iki reguliuojama ne 12h laiko momentu ir pasiekė ne 24h laiko momentu, bet šiek tiek žemyn reguliuojama vėliau. Klasterio 2 genai šiek tiek padidėjo tuo 24h laiko momentu, bet tada tampa iki reguliuojama ties 48 val ir 72 val laiko momentais. Klasterio 3 genai yra greitai žemyn reglamentuojama 12h ir 24h laiko momentais, bet žemyn reguliavimo tampa daug mažiau vėlesniuose laiko kiekis, o klasterio 4 genai žemyn reglamentuojama 24h ir praėjus ilgesniam laiko tarpui. Funkciniai ryšiai tarp šių genų yra pavaizduota genų reguliavimo tinklo (3 paveikslas). Vėliau, mes taip pat įvertino raiškos duomenų galiojimą analizuojant kandidačių genų, naudojant realaus laiko RT-PGR (4 paveikslas) poaibis. buvo gautas kitoks rinkinys RNR mėginiuose (0, 12, 24 ir 48 valandoms po gydymo) skirtingų gydymo laiko momentais iš MFR jautrių AGS ląstelių ir MFR-nejautrus Hs746T ląsteles.

MFR gydymas labai Down reguliuojami dvi ląstelės paviršiaus receptorių genai ( PDGFRA parsisiųsti ir LRP8
), baltymų kinazės geno ( PRKCA
) ir kiti penki genai ( inf2
DOCK1
HSPA5
ARRB1
, ir IGFBP5
) (2 pav.) Šeši iš šių genų buvo atrinkti AT-PGR patvirtinimo ir visos šešios genai buvo patvirtinta, kad reikšmingai mažina reguliuoja MPa AGS ląstelių, kurios yra jautrios MFR (4 pav.) Įdomu tai, kad dauguma šių genų nebuvo reikšmingai mažina reglamentuoja MPA gydymo į Hs746T ląstelių, kurios nejautrios MPA gydymo (4 paveikslas).

Be to, MFR gydymas AGS ląstelių gerokai iki reguliuojama išraiškos daug genų padariusiems ląstelių migraciją. Septyni genai ( ATF3
SMAD3
CITED2
CEAMCAM1
CYR61
NOS3
ir CDH10
) turi daugiau nei keturis kartus skirtumą ir yra pabrėžta mikrogardeliq Spalvinė diagrama (2 paveikslas). Realaus laiko PGR patvirtino, kad ATF3
padidėjo 10-20 susilanksto į AGS ląstelių po MPA gydymo, kol jis padidėjo tik 2-3 susilanksto į Hs746T ląstelių (4 paveikslas). Panašiai, MFR gydymas reikšmingai padidėjo CDH10
išraiška AGS ląstelių, bet ne Hs746T ląstelių (4 paveikslas).

Taip pat atliekama stažuotė sodrinimo analizė 65 ląstelių migracijos genų skirtingai išreikštas po MPA gydymo. Penkių KEGG keliai, kurie reikšmingai nepakito MFR yra pateikti 1 FOCAL sukibimą, aktino citoskeleto ir AXON orientavimo būdai yra labai susijęs su ląstelių migracijos lentelėje ir yra žymiai slopinamas MPA gydymo, sutampa su stebimos mažinimo migracijos gebėjimas MFR gydytų AGS ląsteles. Be to, į vėžio kelias taip pat smarkiai slopino kaip keli genai vaidina svarbų vaidmenį ląstelių proliferaciją ir apoptozės. TGF-beta kelias yra gerokai aktyvuota MPA gydymo ir ši išvada yra suderinama su slopinimo funkcija TGF-beta ir MPA veiklos slopinimui ląstelių migraciją ir proliferaciją.
Kelias Vardas
ID
pFDR
Status
Židinio adhesion45101.46E-06InhibitedRegulation Aktino cytoskeleton48101.22E-05InhibitedPathways į cancer52002.21E-05InhibitedAxon guidance43600.00016InhibitedTGF-beta signalizacijos pathway43500.00021ActivatedTable 1. penkios KEGG-keliai iš 65 ląstelių migracijos genų reikšmingai nepakito MPA gydymo.
CSV Parsisiųsti CSV

MFR sukeltos signalizacijos pakeitimus, susijusius su migracijos

AKT
yra pagrindinis genas, kuris jungia su daugeliu migracijos genų atskirtinai išreikštas mikrogardelių sistemoje duomenų. Tačiau AKT
genai nebuvo pakeista MPA gydymo išraiška. Be to, bendra AKT baltymų parodė tik nedidelį pokytį praėjus ilgesniam laiko tarpui (5a pav.) Įdomu tai, kad PHOSPHO-Akt (Ser473) buvo smarkiai sumažėjo MPA gydymo (5a pav.) Šie rezultatai rodo, kad MFR taip pat gali būti pakeistas migracijos gebėjimas AGS ląstelės per įtaka Aktyvinimo būsena pagrindinių signalizavimo baltymams, tokiems kaip AKT, be to, reguliavimo genų ekspresiją.

genų išraiška, koduojanti src tirozino kinazės yra tik šiek tiek žemyn reguliuojama mikrogardeliq duomenis. Nuo Src yra funkciškai susiję su daugelio migracijos genų skirtingai išreikštos mikrogardeliq duomenis (3 pav), nustatėme, tai baltymų ekspresijos lygį Src ir nustatė, kad baltymas yra stipriai žemyn reguliuoja MPA gydymo (5a pav.) Tačiau tiksli priežastis, dėl pastebėtų genų ir baltymų ekspresijos neatitikimų yra neaiškus ir dar turi būti toliau tiriamas.

MFR sukeltos CD147 sumažinimas

SRC tirozino kinazės taip pat perduoda integrino priklauso signalus centrinės ląstelės judėjimo ir platinimu. Keli diferencialinės išreiškė genai ( CEACAM1 parsisiųsti ir CYR61
) taip pat susijęs integrino signalizacijos keliu. Todėl mes išanalizavo kelių integrinų apie AGS ir Hs746T ląstelių paviršiuje, naudojant FACS analizė išraiška. Nors CD147
genas nebuvo pakeista MPA gydymo (4 paveikslą), CD147 paviršiaus baltymo ekspresija buvo smarkiai žemyn reguliuojama po MPA gydymo (5b pav) išraiška. Be to, Vakarų dėmė analizė taip pat patvirtino, kad bendras CD147 baltymas buvo gerokai žemyn reguliuoja MPA gydymo (5a pav.) Įdomu tai, kad MFR gydymas Hs746T ląstelių reikšmingai nepakeitė CD147 paviršiaus išraiška. Iš ICAM-1 ir integrinų beta 5 išraiška nepasikeitė MPA gydymo (5b pav.)

MFR sumažina matricos metaloproteinazę 1 (MMP-1)

Trys MMP baltymai buvo matuojamas kultūra terpė AGS ir Hs746T ląstelių po MPA gydymo naudojant Luminex tyrimai (6 pav.) Baltymų lygiai MMP2 ir MMP9 buvo labai mažai AGS ląstelių kultūros terpės (duomenys neparodyti). MMP1 buvo žymiai sumažintas MPA gydymo dozės priklausomu būdu į AGS ląstelių kultūros terpėje (6a pav), o ne pokytis buvo stebimas Hs746T ląstelių (6b pav.)

Diskusijos

MFR yra žinoma, kad specifiškai slopina IMPDH, norma ribojantis fermentas de novo
sintezė guanozinas nukleotidų, kurie yra būtini DNR replikacija, taip pat RNR ir baltymų sintezę. MFR yra taip pat gerai žinoma, kad slopina vėžio ląstelių proliferaciją ir indukuoja apoptozę. Šiame tyrime mes parodė pirmą kartą, kad MFR gali žymiai sumažinti migracijos ir invazija gebėjimus AGS ląsteles. Nuo metastazės yra didelė problema susiduria vėžiu sergantiems pacientams, MPa gebėjimas slopinti vėžio ląstelių migraciją ir invazija, be to, jo gebėjimas slopinti ląstelių proliferaciją ir paskatinti apoptozę, teikia MFR puikus vėžio narkotikų kandidatas.

šis tyrimas taip pat naudojamas molekulinės įvairius metodus išsiaiškinti molekulinius mechanizmus, sukeliančius MPa funkciją slopina vėžio ląstelių migraciją. Mes pirmą kartą panaudotas pasaulinė transcriptomic analizes, nustatyti migracijos kandidates genus pakeista MPA gydymo. Šie tyrimai parodė, 50 genus su 2-4 kartų skirtumas, ir 15 genus su > 4 kartus skirtumai (2 pav.) Šie genai yra ląstelės paviršiaus receptoriais, proteinkinazes ir kitų genus migracijos reguliavimo. Iš mikrogardelių sistemoje duomenų tinkamumas buvo patvirtinta realaus laiko RT-PGR pasirinktų genų su > 4 kartus skirtumai (4 pav.) Be transcriptomic analizės, mes taip pat naudojamas keletą PROTEOMIKOS ir funkcinės technologijas išsiaiškinti molekulinius mechanizmus, sukeliančius kovos su migracijos aktyvumą MFR. Transcriptomic profiliavimas yra galinga technologija įvertinti pasaulines molekulinius pokyčius. Pagrindinis privalumas genų ekspresijos microarray yra jos gebėjimas greitai ir ekonomiškai įvertinti išraiška modelio beveik visi genai į interesų ląsteles. Nepaisant to, kad šio technologijų klasės galios, yra daug problemų, kurios riboja mikrogardelių sistemoje pirmiausia kaip hipotezės-generavimo įrankį numeris. Rimčiausia apribojimas yra netobulas koreliacija arba koreliacija tarp genų ekspresiją ir baltymų ekspresijos /funkcijos trūkumas. Tai trūkumas yra gerai iliustruoja šiame tyrime kaip pagrindiniai skirtumai baltymų raiškos aktyvacijos statuso buvo pakeista MFR o genų ekspresijos lygis nepakito. Todėl labai svarbu derinti transcriptomic ir PROTEOMIKOS technologijas pasaulio apibūdinimo biologinių funkcijų.

Bent trys genai, kurie yra žinomi skatinti ląstelių migraciją ( inf2
DOCK1
ir HSPA5
) yra smarkiai žemyn reguliuojama (> 4 kartus) iki MPA gydymo (2 paveikslas). inf2
koduoja apverstą formin 2 baltymų, kuris skatina detyrosinated mikrovamzdeliai reikalingų Centromera perorientavimo į migruojančių ląstelių [25] išsidėstymą. Iš citokinezė 1 (DOCK1) baltymų kuris skirti sąveikauja su HER2 ir skatina HER2 sukeltos RAC aktyvinimą ir ląstelių migraciją [26]. HSPA5 yra stresas atsakas baltymų sukeltas agentų ar sąlygų, kurios turi neigiamos įtakos Endoplazminis tinklas funkciją. Ji aktyviai reguliuoja kelis piktybinius fenotipų įskaitant ląstelių augimą, migracijos, ir invazijos. Žemyn reguliavimo šių genų pagal MFR yra suderinamas su sumažintu migracijos talpa AGS ląstelių po MPA gydymo. Priešingai, raiška beta-arrestin-1 ( ARRB1 pervežimas) sumažino migracijos polinkį krūties vėžio ląstelių linijų, o slopinimo padidėjusį migracijos [27]. Naujesniame tyrimo [28] ARRB1
buvo nustatyta, kad skatinti migracijos galimybę susirgti plaučių vėžiu migracija. Todėl neaišku, šiuo metu, ar ARRB1
slopina arba skatina migraciją AGS ląsteles. Kitas drastiškai žemyn reguliuoja genų IGFBP5
, skatina ląstelių sukibimą ir padidina ląstelių išgyvenimą MCF-7 žmogaus krūties vėžio ląstelių [29]. IGFBP5 atrodo slopina migracijos MCF7 ląstelių [29], bet skatina migraciją periferinio kraujo vienabranduolėse ląstelių [30]. Todėl IGFBP5 vaidmuo AGS ląstelių migracija dar reikia nustatyti.

MFR gydymas AGS ląstelių, taip pat gerokai iki-sureguliavo genų padariusiems ląstelių migracijos skaičiaus išraiška. Tarp jų septyni genai ( ATF3
SMAD3
CITED2
CEAMCAM1
CYR61
NOS3 parsisiųsti ir CDH10
) yra labai svarbūs, nes jie rodo daugiau nei keturis kartus skirtumai mikrogardeliq Spalvinė diagrama (2 paveikslas). Du iš septynių genų ( ATF3 parsisiųsti ir CDH10
) atrinko ir patvirtino realaus laiko RT-PGR. ATF3
išraiška padidėjo 11 kartų po 12 valandų nuo MPA gydymo ir 19 kartų didesnė už 48 valandas. CDH10
išraiška pakeista AGS ląstelių, bet ne Hs746T ląstelių (4 paveikslas). ATF3 neseniai buvo įrodyta, kad slopinti metastazes šlapimo pūslės vėžio per reguliavimo Gelson-tarpininkaujant rekonstruoti aktino citoskeleto. Padidėjusi ATF3
labai metastazavusio šlapimo pūslės vėžio ląstelių sumažėja migracija in vitro parsisiųsti ir vivo
[31]. TGF-β /SMAD signalizacijos kelias vaidina svarbų vaidmenį kasos latakų adenokarcinoma augimo, migracijos ir metastazių. SiRNA tarpininkaujant triukšmo slopinimo ir SMAD3 padidina TGF-beta-sukeltas vėžys ląstelių migraciją [32]. Suderinamas su sumažintu migracijos gebėjimas AGS ląstelių po MPA gydymo SMAD3 yra žymiai daugiau, reglamentuoja MPA gydymo (2 paveikslas). CITED2
koduoja CBP /P300-bendrauja transaktyvatoriaus 2 baltymų, kurie teigiamai reguliuoja TGF-beta signalizacijos per savo asociacijas su SMAD /P300 /CBP sąlygojamą transkripcijos coactivator komplekso ir stimuliuoja keletą kitų transkripcijos veiklą. Įrodyta, kad Cited2
pelç padidėjo lytinių liaukų ląstelių migraciją [33]. Todėl iki reguliuojama CITED2
genų ekspresija gali prisidėti prie sumažinto migracijos gebėjimas AGS ląstelių gydomi MPA. CEACAM1
koduoja karcinoembrioninius antigeno susijusių ląstelių adhezijos molekulės (CD66a), kuris veikia integrino priklauso signalizacijos ir reguliuoja tarpląsteliniame baltymų konkrečiai morfologiją ir migracijos endotelio ląstelių [34]. Nors dauguma tyrimai parodė, kad vien CEACAM1 vaidina promigratory vaidmuo, CEACAM1 sąveiką ir filamin drastiškai sumažino migracijos ir ląstelių sklaida [35]. Todėl CEACAM1 vaidmuo ląstelių migracija gali priklausyti nuo ląstelių kontekste.

Tačiau du genai labai up-reguliuojamų MPa ( CYR61 parsisiųsti ir NOS3 pervežimas ) faktiškai skatina migraciją. CYR61
koduoja cisteino turtingas baltymų 61, kuri skatina ląstelių migraciją per keisti ir integrinu [36] funkcijas. Up-reguliavimas CYR61
pagal MFR gydymo gali sumažinti kovos su migracijos vaidmuo MFR. Azoto oksidas skatina tešmens naviko ląstelių migraciją per paeiliui aktyvavimo azoto oksido sintezės, guanilatciklazės ir mitogenu aktyvinto proteino kinazės [37]. NOS3
koduoja azoto oksido syntazės 3 ir yra labai naujausias reglamentuoja MPA gydymo. Vėlgi, iki-reguliavimo NOS3
gali sumažinti antimigratory funkciją MFR. CDH10
genas koduoja viena iš cad baltymų, kurie vaidina svarbius vaidmenis ląstelių ląstelių sukibimą. Jis buvo daryti išvadą, kad CDH10 gali vaidinti svarbų vaidmenį mesendodermal ląstelių migracija, nors tai numanomas santykiai nebuvo eksperimentiškai išbandyti. CDH10
drastiškai padidėjo MPA gydymo AGS ląstelių, bet ne Hs746T ląstelių ir jos vaidmuo migracijos turėtų būti eksperimentiškai išbandyti.

PDGFRA
koduoja ląstelės paviršiaus tirozino kinazės receptorių narį trombocitų kilmės augimo faktoriaus šeima ir yra žinoma, kad būti glaudžiai susiję su ląstelių migraciją [38]. Mažo tankio lipoproteinų receptorių susijusių baltymų 8 (LRP8), taip pat žinomas kaip apolipoproteino E receptoriaus 2 (ApoER2), yra ląstelės paviršiaus receptorių su EGF-panašų domeną. Šie receptoriai veikia signalo perdavime ir Endocitozė konkrečių ligandų. LRP8 yra žinoma, vaidina svarbų vaidmenį embriono neuronų migracijos [39]. Ekstraceliulinis ligandas jungiasi prie LRP8 ir susijusios receptorių, VLDLR, nuo migruojančių neuronų suaktyvina ląstelėje procesus, prasidedančius Dab1 fosforilinimo [39]. Dab1, tirozino kinazės fosforilinarai baltymų, gali būti fosforilinamos dviejų tirozino kinazės (Src ir Fyn) ir fosforilinarai Dab1 skatina tolesnį aktyvacijos šių dviejų kinazės ir kitų kinazės įskaitant PI3K. Fosforilinamos PI3K gali sukelti slopinančio fosforilinimo iš Tau kinazės glikogeno sintezės kinazės 3 Beta (GSK3B), kuris keičia tau baltymo, kuris dalyvauja mikrovamzdelių stabilizavimo veikla. PI3K taip pat gali fosforilinti baltymų kinazės C baltymų (PKC), kurios fosforilinti platų baltymų tikslų ir yra žinoma, kad dalyvauja įvairių ląstelių signalinių kelių.

• PLoS ONE: Resveratrolis Slopina skrandžio vėžio augimą skatinančius G1 fazės suimti ir senatvė į Sirt1 priklausomas Manner
• PLoS ONE: bendruomeninė, atvejo-kontrolės tyrimas Vertinti Mirtingumas mažinimas skrandžio vėžio endoskopinis atrankinės patikros Japan