PLOS ONE: micofenólico Ácido Migração inibe e invasão das células de câncer gástrico através de múltiplos caminhos moleculares

Sumário

O ácido micofenólico (MPA) é o produto metabolizado e elemento activo de micofenolato de mofetil (MMF), que tem sido amplamente utilizada para a prevenção de rejeição aguda do enxerto. MPA inibe potentemente desidrogenase inosina monofosfato (IMPDH) que é sobre-regulada em muitos tumores e MPA é conhecido para inibir a proliferação de células de cancro, bem como de fibroblastos e a migração de células endoteliais. Neste estudo, nós demonstramos pela primeira habilidades antimigratória e anti-invasão do MPA de sensível MPA-AGS células (câncer gástrico) tempo. expressão do genoma análises usando Illumina microarrays todo genoma identificados 50 genes com ≥ 2 mudanças de dobra e 15 genes com > 4 alterações dobrar e múltiplas vias moleculares envolvidos na migração celular. Análises em tempo real de RT-PCR dos genes seleccionados confirmou também as diferenças de expressão. Além disso, proteômica alvo análises identificaram várias proteínas alteradas pelo tratamento MPA. Nossos resultados indicam que MPA modula a migração de células de câncer gástrico através da infra-regulação de um grande número de genes ( PRKCA
, DOCK1
, INF2, HSPA5, LRP8
e PDGFRA
) e proteínas (PRKCA, AKT, Src, CD147 e MMP1) com funções promigratory, bem como up-regulação de um número de genes com funções antimigratória ( ATF3
, Smad3
, CITED2
e CEAMCAM1
). No entanto, alguns genes que podem promover a migração ( Cyr61
e NOS3
) foram up-regulada. Portanto, o papel antimigratória geral do MPA sobre as células cancerosas reflete um equilíbrio entre promigratory e sinais antimigratória influenciados pelo tratamento MPA

Citation:. Dun B, Sharma A, Teng Y, Liu H, Purohit S, Xu H, et al . (2013) Migração Inibe ácido micofenólico e invasão das células de câncer gástrico através de múltiplos caminhos moleculares. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10.1371 /journal.pone.0081702

editor: Ying Xu, Universidade da Geórgia, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de julho de 2013; Aceito: 15 de outubro de 2013; Publicação: 15 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Dun et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por fundos do Regents da Universidade da Geórgia. JXS é parcialmente apoiado pela Research Alliance Geórgia como um eminente estudioso. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

maioria dos tumores sólidos são em grande parte curáveis ​​se forem diagnosticados e tratados antes da divulgação para além do site principal inicial. No entanto, uma vez que os tumores se espalhar para outros locais, eles geralmente se tornam altamente mórbida e provavelmente fetal. Portanto, é essencial para limitar a disseminação inicial e evitar a propagação secundária. Invasão e metástase são dois principais modos de disseminação do tumor, cada impulsionado por diferentes mecanismos e levando a desafios terapêuticas distintas [1]. No entanto, ambas as formas de disseminação requerem o movimento célula a partir dos sítios primários para o local secundário, bem como o restabelecimento e a sobrevivência das células tumorais nos locais secundários. Estes processos são realizados por meio de uma cascata de alterações moleculares dentro das células cancerosas. Embora a migração de células mecanismo molecular subjacente tem sido extensivamente estudada, novas perspectivas sobre os eventos moleculares podem fornecer novas abordagens terapêuticas. Com efeito, a inibição das moléculas que promovem a migração de células e a regulação positiva de moléculas que inibem a migração de células através de intervenções farmacológicas tornaram-se uma parte importante dos weaponries para combater o cancro. Desenvolvimento ou indevido de drogas adicionais que inibem a migração e invasão é um grande esforço em curso para a terapêutica do cancro.

O micofenolato de mofetil (MMF) foi aprovado para a prevenção da rejeição aguda do enxerto no rim, coração, fígado e transplante [ ,,,0],2,3]. MMF é o pró-fármaco éster morfolinoetilo do ácido micofenólico (MPA), a qual é um inibidor não competitivo potente da desidrogenase inosina monofosfato (IMPDH), enzima que limita a velocidade para o
de novo síntese de nucleótidos de guanosina [4,5 ], os quais desempenham papéis cruciais na proliferação de células e outras funções celulares, incluindo a replicação do ADN, síntese de ARN e proteína e sinalização celular [6]. Por conseguinte, os blocos de MPA T e a proliferação de linfócitos B e a expansão clonal, e evita a geração de células T citotóxicas e outras células T efectoras. Outros mecanismos também podem contribuir para a eficácia do MPA na prevenção da rejeição de aloenxertos. Através da depleção de nucleótidos de guanosina, MPA pode suprimir a glicosilação e a expressão de várias moléculas de adesão, diminuindo assim o recrutamento de linfócitos e monócitos nos locais de inflamação e rejeição de enxertos [5].

Uma vez que a expressão da IMPDH é significativamente sobre-regulada em muitas células tumorais [7,8], que é, por conseguinte, potencialmente, um alvo para terapia de cancro para além da quimioterapia imunossupressora. MPA /MMF tem sido relatado para inibir a proliferação de células de cancro e induz a apoptose em muitas células de cancro [9-14]. MPA /MMF também tem sido relatado para inibir a migração de células de fibroblastos [15] e as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) [16]. No entanto, desconhece-se se MPA pode alterar a capacidade de migração e invasão de células cancerosas. Além disso, as vias de sinalização migração precisas e moléculas efetoras subjacentes atividades do MPA são ainda imperceptíveis.

Neste estudo, nós demonstramos pela primeira vez que MPA altera significativamente a capacidade de migração e invasão de células AGS e, em seguida, utilizado a expressão genética e as tecnologias proteômicas para identificar genes e proteínas subjacentes a estas funções.

Materiais e Métodos

as linhas celulares, reagentes e anticorpos

Duas linhas celulares de cancro gástrico (AGS e Hs746T) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Ambas as linhas celulares foram crescidas em meio RPMI contendo soro fetal bovino a 10%, 1640, 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO2. MPA foi adquirido a VWR. O CD147, o anticorpo de integrina beta5 foi comprado de Abcam, o GAPDH e ICAM-1antibodies de Santa Cruz; Src, Akt, Akt e p-(Ser473) anticorpos de Cell Signaling.

in vitro bem trans-migração e invasão ensaios

A migração celular foi realizada com o sistema Transwell (Costar), a qual permite que as células migram através da membrana de 8 uM de tamanho de poro de policarbonato. Em resumo, a AGS carência de soro ou células HS746T foram adicionadas à câmara superior (5 × 104 células por pastilha) e meio DMEM com diferentes concentrações de MPA (1 ug /ml, 1.5μg /mL e 2 ng /ml) foi usado como um quimioatractivo na cara inferior. Após incubação a 37 ° C durante 8 horas, as células na câmara inferior foram fixadas em metanol e coradas com violeta de cristal a 0,2%. O número de células que migram em nove campos seleccionados aleatoriamente a partir de câmaras em triplicado foram contadas em cada experiência sob um microscópio de contraste de fase. O potencial invasivo das células foram analisados ​​utilizando uma câmara de Matrigel-revestidas de Boyden modificada (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) como descrito anteriormente [17]. DMEM contendo MPA foi adicionada à câmara inferior. Após incubação a 37 ° C durante 24 horas, o número de células que invadiram para o lado inferior da câmara superior foi contado.

Micorarray experiências

O ARN total foi extraído a partir de células utilizando uma AGS magnatic kit de extracção de RNA esferas (Jinfiniti Biosciences, Augusta, GA). perfil de expressão gênica foi realizada utilizando o humano Illumina HumanHT-12 v4 BeadChip (Illumina, San Diego, CA). Uma alíquota de 200 ng de ARN total foi convertido em ADNc de cadeia dupla (ds-cDNA) usando o kit de marcação de TargetAmp Ilumina-Nano com um iniciador oligo-dT contendo um promotor de ARN-polimerase de T7 (Genset, St. Louis, MO). In vitro
transcrição foi realizada nos acima ds-cDNA usando o kit de marcação de ARN transcrito Enzo. A biotina marcado com ARNc foi purificado usando uma coluna de afinidade de RNeasy (Qiagen), e fragmentadas aleatoriamente para tamanhos que variam de 35-200 bases por incubação a 94 ° C durante 35 min. As soluções de hibridação continha 100 mM de MES, 1 M de Na ^{+, 20 mM de EDTA e 0,01% de Tween 20. A concentração final de ARNc fragmentado foi de 0,05 ug /ul de solução de hibridação. Alvo para a hibridação foi preparado combinando 40 ul de transcrição fragmentado com ADN de esperma de arenque sonicado (0,1 mg /mL), BSA e 5 nM oligonucleótido de controlo num tampão contendo NaCl 1,0 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,6), e 0,005 % de Triton X-100. Objectivo foi hibridizada durante 16 h a 45 ° C num forno de hibridação Ilumina. Batatas fritas foram depois lavados a 50 ° C com solução rigorosas, em seguida, novamente a 30 ° C, com lavagens não rigorosas. As matrizes foram, em seguida, corado com estreptavidina-Cy3. Os dados de microarranjos são Miame compatível e foram depositados em NCBI Gene Expression Omnibus e são acessíveis através do número de acesso GEO Series GSE46671.}

em tempo real RT-PCR análise

Uma alíquota de RNA total ( 2 ug por amostra) foram dispostos em placas de 96 poços e, em seguida, convertido em ADNc, utilizando um High Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems) e um controlador térmico programável PTC-100TM (MJ Research, Inc.). Os produtos de ADNc foram utilizados para quantitativa PCR em tempo real utilizando ensaios de expressão de genes TaqMan prontos-a-usar a partir da Applied Biosystems. Cinco genes de referência com a expressão relativamente constante (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 e MRPL19) foram usadas para normalizar a concentração de ARN. PCR em tempo real foi realizado com 96x96 fichas Expressão Fluidigm. Padrão condição de ciclos térmicos (10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C, 1 min a 60 ° C) foi usado para todos os genes. Todas as amostras foram analisadas na mesma placa e de cada amostra foi analisada em duplicado.

Western Blotting

As células foram colhidas e ressuspensas em PBS. Após centrifugação a 2000 rpm durante 5 min, a pelete foi lisadas em gelo frio de M-PER de mamíferos Proteína Reagente de extracção contendo 1% de protease e fosfatase Halt Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific) durante 30 min. O sobrenadante foi recolhido depois de 10 minutos de centrifugação a 12000 rpm, igualada por espectrofotometria, desnaturados com tampão de carregamento de amostra durante 10 min a 95ᵒC e armazenado a 4 ° C para uso futuro. As proteínas foram separadas por 10% de gel de SDS-poliacrilamida e transferidos para uma membrana de PVDF (Bio-Rad), e incubadas com os anticorpos primários de interesse a 4 ° C durante a noite. Foi adicionado 10000 em tampão (3% de BSA-TBST) de bloqueio e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente: O anticorpo secundário de rábano conjugada apropriada, a uma diluição de 1. Todos os anticorpos foram diluídos em BSA a 3%, TBST. Imunotransfer�cias foram desenvolvidos utilizando ECL reagente quimiluminescência (Thermo Scientific).

A citometria de fluxo

As células foram tratadas com tripsina e lavadas duas vezes em PBS. Aproximadamente 1x10 ^{6 as células foram incubadas com 1 ug de anticorpos anti-CD147 e anti-ICAM-1 e anti-integrina beta 5 anticorpos durante 30 min, lavadas com PBST duas vezes, depois incubadas com um anticorpo secundário conjugado com TRITC ou APC durante 30 min, e lavou-se duas vezes com PBST. As análises de citometria de fluxo foram realizadas num citómetro de fluxo com FACScaliburTM software CELLQuestTM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA).}

Luminex ensaio

MMP proteínas no meio de cultura foram medidos utilizando kits de Luminex Millipore Company (Billerica, MA, EUA) de acordo com a recomendação do fabricante. meio de cultura de células (diluição 1:10) foi incubada com as microesferas acoplado a anticorpos e depois com anticorpo biotinilado de detecção antes da adição de estreptavidina-ficoeritrina. Os Bead-complexos foram capturados medido com o sistema FLEXMAP 3D (Luminex, Austin, TX). Median intensidade de fluorescência (MFI) foi recolhida e utilizada para calcular as concentrações de proteína.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando a linguagem R e ambiente para computação estatística (-projeto www.r. org). As comparações entre as médias do grupo foram feitas por ANOVA (para ≥ 3 grupos), seguido de comparações de pares, utilizando o teste Bonferroni post-hoc. A significância estatística das diferenças foi estabelecido em P < 0,05.

O pacote lumi foi usado para dados de pré-processamento de microarray. A expressão diferencial análises foram realizadas utilizando o pacote de limma do projecto Bioconductor [18]. Nós usamos a taxa de descoberta de falsas (FDR) para ajustar para testes de múltipla [19]. Uma combinação de p-valor ajustado e o valor absoluto da mudança de dobragem (FC) foram usadas para seleccionar os genes expressos diferencialmente. A análise de agrupamento

Foi realizada para o agrupamento de genes diferencialmente expressos que exibem padrões de expressão semelhantes utilizando o programa HPCluster [20]. Os pacotes Bioconductor "GOstats" foi utilizado para testar a associação de termos Gene Onto- (processos biológicos) para os genes diferencialmente expressos [21] Um valor de p baseado no teste hipergeométrico foi calculado para avaliar se o número de genes associados com o termo é maior do que o esperado. Os valores de p obtidos foram ajustados para testes múltiplos utilizando o FDR. A lista gene também foi analisada utilizando vias KEGG prebuild. Utilizou-se o "spia" (análise de impacto via de sinalização) pacote para identificar vias impactadas pelas mudanças observadas na expressão genética [22]. análise de rede foi realizada para a construção de redes de interação molecular utilizando o banco de dados STRING [23]. As redes foram importados em formato de interação simples de Cytoscape para visualização [24].

Resultados

MPA inibe a migração celular e AGS invasão

A capacidade migratória de duas linhas celulares de cancro gástrico (AGS e Hs746T) com e sem tratamento MPA foi avaliada usando 8um pore Transwell câmaras sem matrigel. Como mostrado na Figura 1A, as percentagens de migração de células AGS diminuiu de um modo dependente da dose MPA, reduzir para menos de 50% das células de controlo AGS em concentrações de > 1.5μg /ml. No entanto, a capacidade migratória das células Hs746T não foi afectada por MPA em concentrações semelhantes. Da mesma forma, a invasão de células foi testada usando 8um poro Biocoat Matrigel câmaras de 8 micra de invasão (Figura 1B). tratamento MPA também diminuiu significativamente a capacidade de invasão das células AGS mas não células Hs746T.

induzidas MPA gene mudanças de expressão relacionadas com a migração de células cancerosas

Para identificar os genes alterados por tratamento MPA, realizamos um experimento de profiling transcriptomic global com células AGS tratados com MPA. Usando todo o conjunto de dados de expressão gênica, foram identificadas vias KEGG que são significativamente alterados pela MPA. Oito das dez principais vias significativamente alterados (sinalização p53, ciclo celular, as vias em câncer, sinalização PPAR, câncer de bexiga, de processamento de proteína no ER, cancro do pulmão de pequenas células e sinalização MAPK) são bem conhecidos para ser relacionada ao câncer. Os genes diferencialmente expressos também foram mapeados para processos biológicos Gene Ontologia e um teste hypergeometric foi realizada para avaliar a importância de enriquecimento para cada categoria. A análise indicou que os genes significativamente enriquecidas estão implicados no ciclo celular (1,6 enriquecimento vezes, p < 10 ^{-5), a morte celular (enriquecimento de 1,7 vezes, p < -7 10), a proliferação de células (enriquecimento de 1,8 vezes, p < 10 -7), e a migração de células (1,5 enriquecimento vezes, p < 0,005). Os dados de expressão de genes globais são consistentes com a actividade de AMP na inibição da proliferação de células de cancro, indução de apoptose e inibição de migração.}

Uma vez que o foco principal deste trabalho é elucidar o mecanismo molecular subjacente impacto do MPA sobre a migração de células de câncer, foram analisados ​​em detalhe os 50 genes relacionados com a migração com 2-4 diferenças de dobra e 15 genes relacionados com a migração com > diferenças 4 vezes entre células AGS tratadas e não tratadas (Figura 2). Quatro grupos distintos de genes são reconhecidos. Os genes do cluster 1 são rapidamente regulada para cima no ponto de tempo de 12h e chegou ao ponto de tempo de 24 horas, mas ligeiramente regulada para baixo mais tarde. O cluster 2 genes são ligeiramente aumentada no ponto de tempo de 24 horas, mas, em seguida, tornar-se mais up-regulada nas 48h e 72h pontos de tempo. Os genes do cluster 3 são rapidamente regulada para baixo nas 12h e 24h pontos de tempo, mas a infra-regulação torna-se muito menos em momentos posteriores, enquanto o cluster 4 genes são regulados negativamente na 24h e momentos posteriores. As relações funcionais entre estes genes estão descritos em uma rede de transcrição (Figura 3). Subsequentemente, nós também avaliada a validade dos dados de expressão por análise de um subconjunto de genes candidatos utilizando em tempo real de RT-PCR (Figura 4). Um conjunto diferente de amostras de RNA foram obtidas em diferentes pontos de tempo de tratamento (0, 12, 24 e 48 horas após o tratamento) das células AGS MPA-sensíveis e células Hs746T MPA-insensíveis.
Tratamento

MPA severamente down- dois genes de receptores de superfície celular regulamentados ( PDGFRA
e LRP8
), um gene da proteína quinase ( PRKCA
), e cinco outros genes ( INF2
, DOCK1
, HSPA5
, ARRB1
, e IGFBP5
) (Figura 2). Seis destes genes foram seleccionados para confirmação de RT-PCR e todos os seis genes foram confirmadas como sendo significativamente regulada negativamente por MPA em células AGS que são sensíveis ao AMF (Figura 4). Curiosamente, a maioria destes genes não foram significativamente regulada negativamente por tratamento das células de MPA em Hs746T que são insensíveis ao tratamento com AMF (Figura 4).

Além disso, o tratamento de células MPA AGS significativamente sobre-regulada a expressão de um grande número de genes envolvidos na migração de células. Sete genes ( ATF3
, Smad3
, CITED2
, CEAMCAM1
, Cyr61
, NOS3
e CDH10
) têm diferença de mais de quatro vezes e são destacadas no heatmap microarray (Figura 2). Em tempo real de RT-PCR confirmou que ATF3
é aumentado em 10-20 dobras nas células após o tratamento com AMF AGS, enquanto é aumentado apenas por 2-3 dobras nas células Hs746T (Figura 4). Da mesma forma, o tratamento MPA aumentaram significativamente expressão em células CDH10
AGS, mas não em células Hs746T (Figura 4).

Nós também realizadas análises de enriquecimento via nos genes de migração de 65 células diferencialmente expressos após o tratamento MPA. As cinco principais vias KEGG que são significativamente alterados por MPA são apresentados na Tabela 1. As vias de orientação de adesão focal, citoesqueleto de actina e de axónios estão altamente relacionadas com a migração de células e são significativamente inibida pelo tratamento com AMP, consistente com a redução observada na capacidade de migração de MPA-células tratadas com AGS. Além disso, a via de cancro é também inibida significativamente como vários genes desempenham um papel importante na proliferação celular e da apoptose. A via de TGF-beta é significativamente activado por tratamento MPA e esta constatação é consistente com a função de supressão de TGF-beta e a actividade de AMP na inibição da migração e proliferação celular.
Caminho Nome
ID
pFDR
Estado
Focal adhesion45101.46E-06InhibitedRegulation de actina cytoskeleton48101.22E-05InhibitedPathways em cancer52002.21E-05InhibitedAxon guidance43600.00016InhibitedTGF-beta sinalização pathway43500.00021ActivatedTable 1. Top cinco KEGG-vias dos genes de migração de 65 células significativamente alterada por tratamento MPA.
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alterações da sinalização induzidas MPA relacionados com a migração

AKT
é uma chave do gene que liga com um grande número de genes diferencialmente expressos em migração a dados de microarray. No entanto, a expressão do AKT
genes não foi alterada por tratamento MPA. Além disso, a proteína Akt total mostrou apenas ligeira mudança em pontos de tempo mais tardios (Figura 5A). Curiosamente, fosfo-Akt (Ser473) foi severamente diminuída por tratamento MPA (Figura 5A). Estes resultados sugerem que o MPA, também podem alterar a capacidade de migração de células através de AGS influência sobre o estado de activação das proteínas principais de sinalização, como AKT, além de regular a expressão de genes.

A expressão dos genes que codificam o src de tirosina cinase é apenas marginalmente regulada para baixo nos dados de microarranjos. Desde Src está funcionalmente relacionado com um grande número de genes diferencialmente expressos em migração os dados de microarray (Figura 3), determinou-se o nível de expressão da proteína de Src e descobriram que a proteína é drasticamente regulada negativamente por tratamento MPA (Figura 5A). No entanto, a razão precisa para as discrepâncias expressão gênica e protéica observados não é clara e continua a ser investigado.

induzida MPA CD147 redução

A tirosina-quinase Src também transmite sinais dependente de integrina centrais ao movimento e proliferação celular. Vários genes diferenciais expressa ( CEACAM1
e Cyr61
) estão também implicados na via integrina sinalização. Por isso, analisou-se a expressão de várias integrinas na superfície celular AGS e Hs746T, utilizando análise de FACS. Embora a expressão da gene CD147
não foi alterada por tratamento MPA (Figura 4), a expressão da proteína CD147 de superfície foi dramaticamente regulado para baixo após o tratamento de MPA (Figura 5B). Além disso, a análise de mancha de Western também confirmou que a proteína total CD147 foi significativamente regulada negativamente por tratamento MPA (Figura 5A). Curiosamente, o tratamento de células MPA Hs746T não alterou significativamente a expressão de superfície de CD147. A expressão de ICAM-1 e integrina beta 5 não foi alterada por tratamento MPA (Figura 5B).

MPA reduz metaloproteinase de matriz 1 (MMP-1)

Três proteínas de MMP foram medidos no meio de cultura de células AGS e Hs746T após o tratamento MPA utilizando ensaios Luminex (Figura 6). Os níveis de proteína de MMP2 e MMP9 foram muito baixos no meio de cultura celular AGS (dados não mostrados). MMP1 foi significativamente reduzida por tratamento com AMF de forma dependente da dose em meio de cultura de células AGS (Figura 6A), ao passo que nenhuma alteração significativa foi observada em células Hs746T (Figura 6B).

Discussão

MPA é conhecido por inibir especificamente IMPDH, a enzima limitante da velocidade para o de novo
síntese de nucleótidos de guanosina, que são essenciais para a replicação do DNA, bem como RNA e síntese protéica. MPA é também bem conhecido para inibir a proliferação de células cancerosas e induzir a apoptose. Neste estudo, foi demonstrado pela primeira vez que o MPA pode reduzir significativamente a capacidade de migração e invasão de células AGS. Uma vez que a metástase é um grande problema que enfrentam os pacientes de cancro, a capacidade do AMF para inibir a migração de células de cancro e invasão, em adição à sua capacidade para inibir a proliferação celular e induzem a apoptose, torna MPA um excelente candidato a fármaco anti-cancro.

neste estudo também foi utilizado uma variedade de técnicas moleculares para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à função do AMF para inibir a migração de células de cancro. Nós usado pela primeira vez transcriptomic global de análises para identificar genes candidatos a migração alterados por tratamento MPA. Estes estudos sugeriram 50 genes com 2-4 diferenças de dobra e 15 genes com > 4 diferenças vezes (Figura 2). Estes genes incluem os receptores de superfície de células, cinases de proteínas e outros genes envolvidos na regulação da migração. A validade dos dados de microarray foi confirmada por em tempo real de RT-PCR para genes seleccionados com > diferenças 4 vezes (Figura 4). Além da análise do transcriptoma, também usamos várias tecnologias proteômicas e funcionais para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à actividade anti-migração de MPA. perfilamento transcriptomic é uma tecnologia poderosa para avaliar as alterações moleculares globais. A principal vantagem da micromatriz a expressão do gene é a sua capacidade de avaliar rapidamente e economicamente o padrão de quase todos os genes expressos nas células de interesse expressão. Apesar do poder desta classe de tecnologias, há uma série de problemas que limitam microarray principalmente como uma ferramenta hipóteses geradora. A limitação mais grave é a correlação imperfeita ou a falta de correlação entre a expressão do gene e proteína expressão /função. Esta deficiência está também ilustrado no presente estudo como grandes diferenças na expressão da proteína do estado de activação foi alterada pela MPA enquanto que os níveis de expressão de genes não foram alteradas. Portanto, é essencial combinar tecnologias Transcriptoma e proteoma para a caracterização global das funções biológicas.

Pelo menos três genes que são conhecidos por promover a migração celular ( INF2
, DOCK1
, e HSPA5
) são severamente regulada para baixo (> 4 vezes) por tratamento com AMF (Figura 2). INF2
codifica a proteína formin 2 invertido, o que promove a formação de microtúbulos detyrosinated necessárias para a reorientação centrómero em células migratórias [25]. A citocinese dedicador de uma proteína (DOCK1) interage com HER2 e promove a activação induzida Rac-HER2 e a migração de células [26]. HSPA5 é uma proteína de resposta ao estresse induzido por agentes ou condições que afetam adversamente a função retículo endoplasmático. Ela regula activamente vários fenótipos malignas, incluindo o crescimento celular, migração e invasão. A sub-regulação destes genes por MPA é consistente com a capacidade migratória reduzido de células após o tratamento com AMF AGS. Em contraste, a sobre-expressão de β-arrestina-1 ( ARRB1
) reduziu a propensão migratória de câncer de mama linhas celulares, enquanto silenciando o aumento da migração [27]. Em um estudo mais recente [28], ARRB1
foi encontrado para promover a capacidade migratória da migração câncer de pulmão. Portanto, não está claro neste momento se ARRB1
inibe ou promove a migração em células AGS. Outro gene drasticamente sub-regulada, IGFBP5
, induz a adesão de células e aumenta a sobrevivência das células em células MCF-7 de cancro da mama humano [29]. IGFBP5 parece inibir a migração de células MCF7 [29], mas promove a migração de células mononucleares do sangue periférico [30]. Portanto, o papel de IGFBP5 sobre a migração celular AGS continua a ser determinado.

MPA tratamento de células AGS também significativamente sobre-regulada a expressão de um número de genes envolvidos na migração de células. Entre estes, sete genes ( ATF3
, Smad3
, CITED2
, CEAMCAM1
, Cyr61
, NOS3 Comprar e CDH10
) são de grande interesse, pois mostram diferenças mais de quatro vezes na heatmap microarray (Figura 2). Dois dos sete genes de ( ATF3
e CDH10
) foram seleccionados e confirmado por em tempo real de RT-PCR. ATF3
expressão é aumentada em 11 vezes 12 horas após o tratamento MPA e por 19 vezes em 48 horas. CDH10
expressão está alterada em células AGS, mas não em células Hs746T (Figura 4). ATF3 foi recentemente mostrado para suprimir a metástase do cancro da bexiga por meio de regulação da remodelação Gelson mediada do citoesqueleto de actina. Superexpressão de ATF3
em células de cancro da bexiga altamente metastáticas diminui a migração in vitro
e in vivo
[31]. O TGF-β /Smad via de sinalização desempenha um papel crítico no crescimento pancreático adenocarcinoma ductal, migração e metástase. silenciamento mediada por siARN da Smad3 aumenta a migração de células de cancro de TGF-β induzida por [32]. Consistente com a capacidade migratória reduzido de células após o tratamento com AMF AGS, Smad3 é significativamente sobre-regulada pelo tratamento MPA (Figura 2). CITED2
codifica o /proteína transativador 2-interagindo p300 PPME, que regula positivamente TGF-β sinalização através de sua associação com a SMAD /p300 /complexo coativador transcricional CBP-mediada e estimula várias outras atividades de transcrição. Tem sido demonstrado que Cited2
camundongos knockout têm aumento da migração de células gonadais [33]. Por conseguinte, regulado para cima CITED2
expressão do gene pode contribuir para a capacidade migratória reduzido de células tratadas com AMF AGS. CEACAM1
codifica para a molécula de antigénio carcinoembrionário relacionadas com adesão celular (CD66a), que afecta de sinalização dependente de integrina e regula morfologia específico para a proteína da matriz extracelular e a migração de células endoteliais [34]. Embora a maioria dos estudos têm mostrado que a CEACAM1 sozinho desempenha um papel promigratory, a interacção de CEACAM1 e filamina A migração de células e espalhamento reduzido drasticamente [35]. Portanto, o papel de CEACAM1 na migração das células pode depender do contexto celular.

No entanto, dois dos genes altamente sobre-regulada por MPA ( Cyr61
e NOS3
), na verdade, promover a migração. Cyr61
codifica a proteína rica em cisteína 61, o que promove a migração de células através de alteração das funções da integrina [36]. O aumento da regulação do Cyr61
por tratamento MPA pode reduzir o papel anti-migratório de MPA. O óxido nítrico promove a migração de células de tumor mamário através da activação sequencial de óxido nítrico sintase, a guanilato ciclase e a proteína quinase activada por mitogénio [37]. NOS3
codifica a enzima óxido nítrico sintase 3 e é altamente regulado para cima por tratamento MPA. Mais uma vez, aumento da regulação do NOS3
pode reduzir a função antimigratória da MPA. O gene
CDH10 codifica uma das proteínas de caderina que desempenham papéis críticos na adesão célula-célula. Verificou-se inferir que CDH10 pode desempenhar um papel crucial na migração celular mesendodermal embora esta relação inferida não tenha sido testada experimentalmente. CDH10
é drasticamente aumentada por tratamento MPA de células AGS mas não em células Hs746T e seu papel na migração deve ser testada experimentalmente.

PDGFRA
codifica um membro do receptor de tirosina cinase na superfície celular da família do factor de crescimento derivado de plaquetas e é conhecida por estar intimamente relacionada com a migração de células [38]. De baixa densidade do receptor de lipoproteína relacionadas com a proteína 8 (LRP8), também conhecido como receptor 2 apolipoproteína E (ApoER2), é um receptor da superfície da célula com um domínio do tipo EGF. Estes receptores funcionam na transdução de sinal e endocitose de ligandos específicos. LRP8 é conhecida por desempenhar um papel importante na migração neuronal embrionário [39]. Extracelular ligação a LRP8 e um receptor relacionado, VLDLR, sobre os neurônios que migram ligando ativa processos intracelulares que começam com a fosforilação DAB1 [39]. DAB1, uma proteína fosforilada de tirosina-quinase, podem ser fosforilados por duas tirosina-quinases Src e Fyn () e fosforilado DAB1 induz a activação de estas duas quinases e outras quinases, incluindo PI3K. Fosforilada PI3K pode conduzir à fosforilação inibidora da beta tau quinase de glicogénio sintase quinase 3 (GSK3B), que altera a actividade de proteína tau que está envolvido na estabilização de microtúbulos. PI3K também pode fosforilar proteínas proteína quinase C (PKC), que fosforilam a uma grande variedade de alvos de proteína e são conhecidos por estarem envolvidos em diversas vias de sinalização celular.

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