PLoS One: mikofenolsavra Gátolja migrációs és behatolás gyomorrák sejtek révén nagyszámú molekuláris Pathways

absztrakt katalógusa

A mikofenolsav (MPA) metabolizálódik termék és aktív eleme a mikofenolát mofetil (MMF), hogy már széles körben használják megelőzésére akut graft kilökődés. MPA hatékonyan gátolja az inozin-monofoszfát-dehidrogenáz (IMPDH), amely fel-szabályozott számos daganat és MPA ismert, hogy gátolja a rákos sejtek szaporodását, valamint a fibroblaszt és az endoteliális sejtek migrációját. Ebben a vizsgálatban kimutattuk, az első alkalommal mPa-s fenotípusbeli és anti-invázió képességeit az MPA-érzékeny AGS (gyomor rákos) sejtek. Genomra kiterjedő expressziós analízis segítségével Illumina teljes genom microarray azonosított 50 gén ≥2 szeres változásokat és 15 gének > 4 szeres változtatások és több molekuláris útvonalakat játszanak a sejtek migrációját. Real-time RT-PCR-analízise kiválasztott gén is megerősítette az expressziós különbségeket. Továbbá, a megcélzott proteomikai analízis szerint számos fehérje megváltozott MPA kezelést. Eredményeink azt mutatják, hogy az MPA modulálja gyomorrák sejt migrációt leszabályozza a nagyszámú gén ( PRKCA katalógusa, DOCK1 katalógusa, INF2, HSPA5, LRP8 katalógusa és PDGFRA katalógusa) és fehérjék (PRKCA, AKT, SRC, CD147 és MMP1) a promigratory funkcióit csakúgy, mint up-reguláció számos gén fenotípusbeli funkciók ( ATF3 katalógusa, SMAD3 katalógusa, CITED2 katalógusa és CEAMCAM1 katalógusa). Azonban néhány gént, amelyek elősegíthetik a migráció ( CYR61 katalógusa és NOS3 katalógusa) került fel szabályozni. Ezért MPA általános fenotípusbeli szerepe a rákos sejtekre tükrözi közötti egyensúly promigratory és fenotípusbeli jelek által befolyásolt MPA kezelést.

bevezető hivatkozás: Dun B, Sharma A, Teng Y, Liu, H Purohit S, Xu, H et al . (2013) mikofenolsavra Gátolja migrációs és behatolás gyomorrák sejtek keresztül több molekuláris útvonalakat. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10,1371 /journal.pone.0081702 katalógusa

Szerkesztő: Ying Xu, University of Georgia, Egyesült Államok

Beérkezett: július 27, 2013; Elfogadva: október 15, 2013; Megjelent: november 15, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Dun et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Finanszírozás: A tanulmány támogatta alapok, a Georgia Egyetem Regents. JXS részlegesen támogatja a Georgia Research Szövetség egy kiváló tudós. A fenntartó nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a legtöbb szolid tumorok nagymértékben gyógyítható, ha diagnosztizálják és kezelik, mielőtt terjesztés túl a kezdeti elsődleges helyén. Azonban, ha a daganatok átterjedt más helyeken, általában válnak nagyon morbid és valószínűleg a magzat. Ezért lényeges, hogy korlátozza a kezdeti terjesztése és megakadályozzák a másodlagos terjedését. Invázió és metasztázis két fő módok tumor terjesztés, mindegyik által vezérelt különböző mechanizmusok és vezető különböző terápiás kihívások [1]. Azonban mindkét formája terjesztés igényelnek sejt mozgása az elsődleges helyeket a másodlagos helyen, valamint a helyreállítása és a túlélés a tumorsejtek a másodlagos helyeken. Ezeket a folyamatokat valósítottuk kaszkád molekuláris változások a rákos sejteket. Bár a molekuláris mechanizmusa sejtmigráció már kiterjedten vizsgálták, újszerű betekintést a molekuláris események nyújthat új terápiás megközelítéseket. Valóban, gátlás a molekulák, amelyek elősegítik a sejtek migrációját és up-regulációját molekulák, amelyek gátolják a sejtek migrációját keresztül farmakológiai beavatkozások váltak fontos része a weaponries a rák elleni küzdelemre. Fejlesztés vagy repurposing további gátló gyógyszerek migrációs és behatolás jelentős folyamatos erőfeszítést rákterápiában. Katalógusa

A mikofenolát-mofetil (MMF) hagyták jóvá a megelőzésére akut graft kilökődés vese-, szív-, és májátültetés [ ,,,0],2,3]. MMF van a morfolino-etil-észter előanyaga mikofenolsav (MPA), amely egy hatásos nem kompetitív inhibitora az inozin-monofoszfát-dehidrogenáz (IMPDH), a sebességmeghatározó enzim a de novo
szintézisét guanozin nukleotidok [4,5 ], amely döntő szerepet játszanak a sejtproliferációban, és más celluláris funkciók, többek között a DNS-replikációt, RNS és fehérje szintézist és sejtes jelátviteli [6]. Következésképpen MPA blokkolja a T-és B-limfociták szaporodását és klonális expanzió, és megakadályozza, hogy a citotoxikus T-sejtek és más effektor T-sejteket. Más mechanizmusok is hozzájárulhatnak a hatásosságát az MPA az allograft kilökődés. Keresztül kimerülése guanozin nukleotidok, MPA elnyomja glikoziláció és expresszióját számos adhéziós molekulák, ezáltal csökken a felvételi a limfociták és monociták a gyulladásos helyekre és a graft kilökődés [5].

Mivel IMPDH expressziója szignifikánsan felülszabályozott sok tumoros sejtekben [7,8], ezért szükség van arra, potenciálisan a cél a rák terápia mellett immunszuppresszív kemoterápiában. MPA /MMF leírták, hogy gátolja a rákos sejtek szaporodását és apoptózist indukál számos rákos sejtekben [9-14]. MPA /MMF is leírták, hogy gátolják migrációját fibroblaszt sejtek [15] és a humán köldökvéna endoteliális sejteket (HUVEC) [16]. Azonban nem ismert, hogy az MPA megváltoztathatja a migrációs és behatolás képességét a rákos sejteket. Emellett a pontos migráció jelátviteli és effektormolekulái szolgáló MPA tevékenységét továbbra is megfoghatatlan.

Ebben a vizsgálatban először bizonyította, hogy az MPA jelentősen módosítja a migrációs és behatolás képességét AGS sejtek, és mi majd használt génexpressziós és proteomikai technológiákat azonosítani gének és fehérjék alapjául ezeket a funkciókat.

Anyagok és módszerek

sejtvonalak reagensek és antitestek a

Két gyomor rákos sejtvonalat (AGS és Hs746T) kaptuk az American Type Culture Collection (ATCC). Mindkét sejtvonalat RPMI 1640 tápközegben, amely 10% magzati borjúszérumot, 100 egység /ml penicillin és 100 ng /ml sztreptomicin-37 ° C hőmérsékleten, 5% CO2-t. MPA-tól vásárolták VWR. A CD147, integrin beta5 ellenanyagot vásárolt ABCAM, GAPDH és ICAM-1antibodies Santa Cruz; Src, Akt, és a p-Akt (Ser473) antitestek a Cell Signaling.

In vitro transz-jól migrációs és behatolás vizsgálatokban

A sejtmigrációt végeztünk a Transwell (Costar) rendszer, amely lehetővé teszi a sejtek vándorlását és 8-um pórusméretű polikarbonát membránszűrőn. Röviden, a szérum éheztetett AGS vagy HS746T sejtet adtunk a felső kamrába (5 × 104 sejt per betétet), és DMEM tápközeg, különböző koncentrációjú MPA (1 ng /ml, 1.5μg /ml és 2 ng /ml) használtunk kemoattraktáns az alsó kamrában. Az inkubálást 37 ° C-on 8 órán át, majd a sejteket az alsó kamrába metanolban fixáljuk és megfestjük 0,2% kristályibolya. Számok a vándorló sejtek kilenc véletlenszerűen kiválasztott területeken a három párhuzamos kamrák megszámoltuk minden kísérletben alatt egy fáziskontraszt-mikroszkóp. Az invazív potenciál a sejtek alkalmazásával analizáltuk Matrigel bevont módosított Boyden kamra (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) a korábban leírtak szerint [17]. Tartalmazó DMEM-MPA-t adagolunk az alsó kamrába. Az inkubálást 37 ° C-on 24 órán át, a sejtek száma, hogy betört az alsó oldalán a felső kamra megszámláljuk.

Micorarray kísérletek

Teljes RNS-t extraháltunk a AGS-sejteken, magnatic gyöngyök RNS extrakciós kit (Jinfiniti Biosciences, Augusta, GA). Génexpressziós profilozást végeztünk a humán Illumina HumanHT-12 V4 BeadChip (Illumina, San Diego, CA). Egy aliquot 200 ng teljes RNS-t alakítjuk át kettős szálú cDNS-t (DS-cDNS) segítségével a Illumina TargetAmp-Nano jelölő kit egy oligo-dT primert tartalmazó T7 RNS-polimeráz promoter (Genset, St. Louis, MO). In vitro
transzkripciót végeztünk a fent DS-cDNS alkalmazásával az Enzo RNS-átirat jelölő kit. Biotin-jelzett cRNS-t tisztítjuk alkalmazásával RNeasy affinitás oszlopon (Qiagen), és széttagolt véletlenszerűen méretben 35-200 bázisok inkubálva 94 ° C-on 35 percig. A hibridizációs oldatokat tartalmazott 100 mM MES, 1 M Na ^{+, 20 mM EDTA-t és 0,01% Tween 20. A végső koncentrációja fragmentált cRNS-t 0,05 ug /jii hibridizációs oldatban. Cél hibridizációs állítunk elő oly módon 40 ul fragmentált transzkriptumot ultrahanggal kezelt hering sperma DNS-t (0,1 mg /ml), BSA-t és 5 nM kontroll oligonukleotid egy pufferben, amely 1,0 M nátrium-klorid, 10 mmól trisz-HCl (pH 7,6), és 0,005 % Triton X-100. Cél hibridizáljuk 16 órán át 45 ° C-Illumina hibridizációs kemencében. Chipeket ezután mossuk, 50 ° C-on szigorú-oldattal, majd ismét 30 ° C hőmérsékleten a nem szigorú mosás. A tömbök azután festettük sztreptavidin-Cy3. A microarray adatok MIAME kompatibilis, és letétbe helyezték NCBI Gene Expression Omnibus és keresztül érhető GEO Series hozzáférési szám GSE46671. Katalógusa}

Valós idejű RT-PCR analízis katalógusa

Egy aliquot teljes RNS ( 2 ng per minta) elrendezve a 96 lyukú lemezeken, majd alakítjuk cDNS-sé egy nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós Kit (Applied Biosystems), és egy PTC-100TM programozható termikus vezérlő (MJ Research, Inc). A cDNS-termékeket alkalmazták kvantitatív valós idejű PCR-rel kész használat TaqMan génexpressziós vizsgálatokban az Applied Biosystems. Öt referencia gének viszonylag állandó expresszió (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 és MRPL19) használtunk normalizálására RNS koncentrációját. Real-time PCR-t 96x96 Fluidigm Expression zseton. Szabványos termikus ciklusos állapot (10 perc 95 ° C, 40 ciklusban 15 másodpercig 95 ° C, 1 perc 60 ° C-on) használtuk minden géneket. Valamennyi mintát analizáltunk az ugyanazon a lemezen, és minden mintát két párhuzamosban elemeztük.

Western blot

a sejteket összegyűjtöttük és reszuszpendáltuk PBS-ben. Centrifugálás után 2000 rpm-nél 5 percig, a pelletet iizáituk jéghideg M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent, amely 1% szüneteltetése proteáz- és foszfatáz-gátló koktéllal (Thermo Scientific) 30 percig. A felülúszót 10 perc múlva összegyűjtjük a centrifugálással 12000rpm, equaled spektrofotometriásán, denaturált mintafelvivő pufferben 10 percen át 95ᵒC és tárolják 4 ° C-on későbbi használatra. Fehérjéket elválasztottuk 10% SDS-poliakrilamid gélen, és PVDF membránra (Bio-Rad), és inkubáltuk primer antitestekkel az érdeklődés át 4 ° C-on egy éjszakán át. A megfelelő torma-konjugált másodlagos antitesttel hígításban 1: 10000 blokkoló pufferben (3% BSA-TBST) adtunk hozzá, és inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. Minden antitest hígítottunk 3% BSA-TBST. Az immun-blot segítségével fejlesztett ECL kemilumineszcenciás reagens (Thermo Scientific).

Áramlási citometria

A sejteket tripszinizáltuk és kétszer mostuk PBS-ben. Körülbelül 1x10 ^{6 sejtet inkubáltunk 1 ng anti-CD147, anti-ICAM-1 és anti-integrin béta 5 antitestekkel 30 percig, mostuk PBST kétszer, majd inkubáljuk egy szekunder antitesttel konjugált TRITC vagy az APC 30 percig, és kétszer mossuk PBST-vel. Áramlási citometriás analízist végeztek egy FACScaliburTM áramlási citométerrel a CELLQuestTM szoftvert (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).}

Luminex vizsgálattal

MMP proteinek táptalajba mértük Luminex készletek a Millipore Company (Billerica, MA, USA) a gyártó ajánlása szerint. Cell táptalajt (1:10 hígítás) inkubáltuk az antitesttel kapcsolt mikrogömbök, majd biotinilált detektáló antitestet hozzáadása előtt sztreptavidin-fikoeritrinnel. A befogott bead-komplexeket mértük a FLEXMAP 3D rendszer (Luminex, Austin, Texas). Medián fluoreszcencia intenzitás (MFI) összegyűjtjük és kiszámítására használt fehérje koncentrációját. Katalógusa

A statisztikai elemzés katalógusa

Minden statisztikai analízist az R nyelv és környezet statisztikai számítások (www.r-projekt. org). A összehasonlítását csoport segítségével végezte ANOVA (a ≥ 3 csoport), majd páros összehasonlítások segítségével Bonferroni post-hoc vizsgálatok. A statisztikai jelentőségét különbségek határozták meg a P < 0.05.

A lumi csomagot használtuk elõfeldolgozását microarray adatokat. Differenciális expressziója elemzéseket végeztünk a limma csomagot a Bioconductor projekt [18]. Használtuk téves elfogadási arány (FDR), hogy beállítsa a többszöri vizsgálat [19]. A kombináció a korrigált p-érték és abszolút értéke szeres változást (Fc) adunk kiválasztásához használt differenciálisán expresszált géneket.

Klaszter analízist csoportosítására differenciáltan expresszálódó gének mutatnak hasonló expressziós mintázatot a HPCluster programot [20]. A Bioconductor csomag "GOstats" használták tesztelésére szövetsége Gene Ontology feltételek (biológiai folyamatok) a differenciáltan expresszálódó gének [21] A p-érték alapján hipergeometriai teszt számított annak értékelésére, hogy a gének száma kapcsolódó kifejezés nagyobb a vártnál. A p-értékeket kapott igazítottuk az elemzés a FDR. A gén lista is analizáltuk prebuild Kegg utakat. Mi használtuk "Spia" (szignalizációs hatásvizsgálat) csomag azonosítására utak befolyásolja a megfigyelt változások génexpressziós [22]. Hálózati analízist építésére molekuláris kölcsönhatások a STRING adatbázis [23]. A hálózatok importálták egyszerű kölcsönhatás formátumban Cytoscape vizualizációs [24].

Eredmények katalógusa

MPA gátolja AGS-migráció és invázió katalógusa

A mozgási képességét két gyomor rákos sejtvonalak (AGS és Hs746T) van és nincs MPA kezelés alkalmazásával vizsgáltuk 8 um pórus transzwell kamrák nélkül matrigelt. Amint az 1A ábrán látható, a százalékokat a vándorló AGS sejtek csökkent egy MPA dózisfüggő módon csökkentve, a kevesebb, mint 50% a kontroll AGS sejteket koncentrációban > 1.5μg /ml. Ugyanakkor a vándorló képességét Hs746T sejtek nem befolyásolta az MPA hasonló koncentrációban. Hasonlóképpen, a sejtek invázióját vizsgáltuk a 8 um pórusú Biocoat Matrigél 8 mikron invázió kamrák (1B). MPA kezelés is jelentősen csökkentette a betörő képességét AGS sejtekben azonban nem Hs746T sejteket. Katalógusa

MPA-indukálta génexpressziós változások összefüggő rákos sejt migrációt katalógusa

Azonosítani a gének megváltozott MPA kezelés végeztünk globális transzkriptomikai profilalkotás kísérletet AGS kezelt sejtek MPA. A teljes génexpressziós adatbázisba azonosítottunk Kegg előállítási módok, amelyekkel jelentősen megváltoztatta MPA. Nyolc az első tíz jelentősen megváltozott utak (p53 jelátvitel, a sejtciklusban, útjainak rák, PPAR jelző-, húgyhólyagrák, fehérje feldolgozás az ER, kissejtes tüdőrák és a MAPK jelátviteli) jól ismert, hogy a rákkal kapcsolatos. A differenciáltan expresszálódó géneket is leképezve Gene ontológia biológiai folyamatok és a hipergeometriai tesztet végeztünk, hogy értékelje a jelentőségét dúsítás minden kategóriában. Az elemzés azt mutatta, hogy a jelentősen dúsított gének érintettek a sejtciklus (1,6-szeres dúsítás, p < 10 ^{-5), sejthalál (1,7-szeres dúsítást, p < 10 -7), sejtproliferáció (1,8-szeres dúsítást, p < 10 -7), és a sejt migrációt (1,5-szeres dúsítás, p < 0,005). A globális génexpressziós adatok összhangban vannak MPA aktivitását gátolja a rákos sejtek szaporodását, apoptózis indukálása és a gátlás a migráció.}

Mivel a fő hangsúly ezen tanulmány vázolja a molekuláris mechanizmusa MPA hatását a rákos sejtek migrációját, részletesen elemeztük a 50 migrációval kapcsolatos gének 2-4 szeres különbségek és 15 migrációval kapcsolatos gének példa 4-szeres különbség a kezelt és a kezeletlen AGS sejtekben (2. ábra). Négy különböző klaszterek gének ismerik. A klaszter 1 gének gyorsan felfelé szabályozott a 12h időpontban és elérte a 24 időpontban, de kissé lefelé szabályozni később. A klaszter 2 gének kismértékben emelkedett a 24 időpontban, de aztán egyre inkább felfelé szabályozott a 48h és 72 időpontokban. A klaszter 3 gének gyorsan lefelé szabályozni a 12h és 24h időpontokban, de leszabályozza lesz sokkal kevesebb a későbbi időpontokban, míg a 4. klaszter géneket leszabályozott a 24 és későbbi időpontokban. A funkcionális kapcsolatok között ezek a gének ábrázolja egy gén szabályozó hálózat (3. ábra). Ezt követően azt is értékelte az érvényességét a kifejezés adatok elemzésével részhalmaza jelölt gének valós idejű RT-PCR (4. ábra). Egy sor különböző RNS-mintát vettünk különböző kezelési időpontokban (0, 12, 24 és 48 órával a kezelés után) az MPA-érzékeny AGS sejtek és MPA-érzéketlen Hs746T sejtekben.

MPA kezelés súlyosan lefelé szabályozott két sejtfelszíni receptor gén ( PDGFRA katalógusa és LRP8 katalógusa), a protein kináz gén ( PRKCA katalógusa), és öt másik gén ( INF2 katalógusa DOCK1 katalógusa, HSPA5 katalógusa, ARRB1 katalógusa, és IGFBP5 katalógusa) (2. ábra). Hat ezen gének választottunk ki a RT-PCR-igazolás és mind a hat gén is megerősítette, hogy szignifikánsan down-által szabályozott MPA AGS sejtek, amelyek érzékenyek a MPA (4. ábra). Érdekes módon, a legtöbb ilyen gének nem voltak szignifikánsan down-által szabályozott MPA kezelést a Hs746T sejtek, amelyek érzéketlenek a MPA kezelés (4. ábra).

Továbbá az MPA kezelés AGS sejtek szignifikánsan felülszabályozott expressziójának nagyszámú gén játszik a sejtek migrációját. Hét gének ( ATF3 katalógusa, SMAD3 katalógusa, CITED2 katalógusa, CEAMCAM1 katalógusa, CYR61 katalógusa, NOS3 katalógusa és CDH10 katalógusa) több mint négyszeres a különbség, és kiemeli a microarray hőtérkép (2. ábra). Real-time RT-PCR megerősítette, hogy ATF3
növeljük 10-20 redők a AGS sejtekben után MPA kezelés, míg az csak nőtt 2-3 redők a Hs746T sejtekben (4. ábra). Hasonlóképpen, az MPA kezelés jelentősen CDH10
expresszió AGS sejtekben azonban nem Hs746T sejtekben (4. ábra).

Azt is végre útvonal dúsítás elemzést a 65 sejtek migrációját gének eltérő expressziót követően MPA kezelést. Az első öt Kegg előállítási módok, amelyekkel változtatta meg lényegesen MPA van bemutatva az 1. táblázatban fokális adhéziós, aktin citoszkeleton és axon útmutatás utak nagyon kapcsolatos sejtmigráció és jelentősen gátolja az MPA kezelés, összhangban a megfigyelt csökkenés a migrációs képessége az MPA kezelt AGS sejtekben. Továbbá az útvonal rák is szignifikánsan gátolta, mint néhány gén fontos szerepet játszik a sejt-proliferáció és az apoptózis. A TGF-béta útvonal jelentősen aktiválódik MPA kezelés, és ez a megállapítás összhangban van a elnyomása funkció TGF-béta és az MPA aktivitását gátolja a sejtek migrációját és proliferációját.
útvonal neve
ID katalógusa pFDR katalógusa állapota katalógusa Focal adhesion45101.46E-06InhibitedRegulation aktin cytoskeleton48101.22E-05InhibitedPathways a cancer52002.21E-05InhibitedAxon guidance43600.00016InhibitedTGF-béta jelző pathway43500.00021ActivatedTable 1. Top öt Kegg-utak a 65 sejtek migrációját gének változtatta meg jelentősen MPA kezelés.
CSV letöltése CSV

MPA-indukált jelátvitel változások a migrációval kapcsolatos katalógusa

AKT katalógusa kulcsfontosságú gén, amely összeköti a nagyszámú migráció gének eltérően expresszált a microarray adatok. Azonban a kifejezés a AKT katalógusa gének nem befolyásolta MPA kezelést. Továbbá a teljes AKT fehérje csak azt mutatta, kis változás a későbbi időpontokban (5A ábra). Érdekes, foszfo-Akt (Ser473) súlyosan csökkent MPA kezelés (5A ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az MPA is megváltoztathatja a migrációs képességét AGS sejt keresztül befolyásolja a aktiválási állapotát kulcsfontosságú jelátviteli fehérjék, mint például AKT, amellett, hogy expresszióját szabályozó géneket.

A gének expresszióját kódoló src tirozin-kináz csak kis mértékben lefelé szabályozni a microarray adatokat. Mivel Src funkcionálisan kapcsolódnak a nagy számú migráció gének eltérően expresszált a microarray adatok (3. ábra), meghatároztuk a fehérje expressziós szintjét az Src és megállapította, hogy a fehérje drasztikusan alulszabályozott MPA kezelés (5A ábra). Azonban a pontos oka a megfigyelt gén és fehérje expressziós eltérések nem egyértelmű, és még tovább kell vizsgálni.

MPA-indukált CD147 csökkentés katalógusa

A Src tirozin-kináz is közvetíti integrin-függő jeleket központi sejtek mozgását és szaporodását. Számos eltérés expresszálódó gének ( CEACAM1 katalógusa és CYR61 katalógusa) is szerepet játszik az integrin jelátviteli útvonalat. Ezért megvizsgáltuk a kifejezés több integrinek AGS és Hs746T sejtfelszíni FACS elemzést. Bár a kifejezés a CD147 katalógusa gén nem befolyásolta az MPA kezelés (4. ábra), a CD147 felületi fehérje expressziót drasztikusan le van szabályozva után MPA kezelés (5B). Továbbá, Western-blot elemzés azt is megerősítették, hogy a teljes CD147 fehérje szignifikánsan down-szabályozott MPA kezelés (5A ábra). Érdekes, MPA kezelésére Hs746T sejtek nem változtatja meg jelentősen CD147 sejtfelszíni expresszióját. Az ICAM-1 és az integrin béta 5 nem módosította MPA kezelés (5B ábra).

MPA csökkenti mátrix metalloproteináz 1 (MMP-1)

Három MMP fehérjéket mértük táptalaj AGS és Hs746T sejtek után MPA kezelés alkalmazásával Luminex vizsgálatok (6. ábra). A fehérje szintje MMP2 és MMP9 nagyon alacsony volt a AGS sejttenyésztő közegben (az adatokat nem mutatjuk). MMP1 szignifikánsan csökkentette MPA kezelés dózisfüggő módon AGS sejttenyésztő közegben (6a ábra), míg nincs jelentős változás volt megfigyelhető Hs746T sejtekben (6B).

Discussion

MPA ismert, hogy specifikusan gátolják IMPDH, a sebességmeghatározó enzim a de novo
szintézisét guanozin nukleotidok, amelyek elengedhetetlenek a DNS-replikáció, valamint a RNS és fehérjeszintézist. MPA is jól ismert, hogy gátolja a rákos sejtek szaporodását és apoptózist indukál. Ebben a tanulmányban bemutattuk az első alkalom, hogy az MPA jelentősen csökkenti a migrációs és behatolás képességeit AGS sejteket. Mivel metasztázis egyik fő problémája a rákos betegek, az MPA azon képességét, hogy gátolja a rákos sejtek migrációját és invázióját, amellett, hogy a képessége, hogy gátolja a sejtproliferációt és apoptózist indukál, vakolatok MPA kiváló rákellenes gyógyszer jelölt.

Ebben a vizsgálatban azt is használják a különböző molekuláris technikák tisztázása molekuláris mechanizmusok mögöttes MPA feladata, hogy gátolja a rákos sejtek migrációját. Először használt globális transzkriptomikai elemzések azonosítani migráció jelölt gének megváltozott MPA kezelést. Ezek a vizsgálatok azt 50 gén 2-4 szeres különbségek és 15 gének > 4 szeres különbség (2. ábra). Ezek a gének közé tartoznak a sejtfelszíni receptorok protein-kinázok, és más gének szabályozásában vesz részt a migráció. Érvényességét a microarray adatok is megerősítették real-time RT-PCR kiválasztott gének > 4-szeres különbség (lásd 4. ábra). Amellett, hogy transzkriptomikai elemzés azt is használják számos proteomikai és funkcionális technológiák tisztázása molekuláris mechanizmusok mögöttes az anti-migrációs aktivitásának MPA. Transzkriptomikai profilalkotás egy hatékony technológiát, hogy értékelje a globális molekuláris változásokat. A fő előnye a génexpresszió microarray, hogy képes gyorsan és gazdaságosan értékelésére expressziós mintázata szinte minden gén expresszálódott a sejtekben az érdeklődés. Annak ellenére, hogy a hatalom ennek az osztálynak a technológiák, van számos kérdés, amely korlátozza microarray elsősorban a hipotézisek-generáló eszköz. A legsúlyosabb korlát a tökéletes korreláció vagy közötti korreláció hiánya génexpresszió és protein expresszió /funkció. Ez a hiány jól illusztrálja A vizsgálatban a jelentős különbségek fehérjeexpresszióját aktiválási állapotát megváltoztatták MPA míg a génexpressziós szintje nem változott. Ezért lényeges, hogy összekapcsolják transzkriptomikai és proteomikai technológiák globális jellemzésére biológiai funkcióit.

Legalább három gént, amelyekről ismert, hogy elősegítik a sejtmigrációt ( INF2 katalógusa, DOCK1
és HSPA5
) súlyosan lecsökkent (kitermeléssel 4-szeres) által MPA kezelés (2. ábra). INF2 katalógusa kódolja a fordított formin 2 fehérje, amely elősegíti a kialakulását detyrosinated mikrotubulusok szükséges centromer átirányítását a migráló sejtek [25]. Az ajánló szerző citokinézis 1 (DOCK1) fehérje kölcsönhatásba HER2 és elősegíti HER2-indukált Rac aktiváció és a sejtek migrációját [26]. HSPA5 egy stressz fehérje által kiváltott szerek vagy feltételeket, amelyek hátrányosan befolyásolhatják endoplazmás retikulum funkciót. Aktívan szabályozza több rosszindulatú fenotípus beleértve a sejtnövekedést, a migráció, és inváziót. Le-az ilyen gének szabályozásában által MPA összhangban van a csökkentett migrációs képességét AGS sejtek után MPA kezelést. Ezzel szemben a túlzott expressziója β-arrestin-1 ( ARRB1
) csökkentette a migrációs hajlamot a mellrák sejtek vonalak, mivel a hangtompító megnövekedett migráció [27]. Egy újabb tanulmány [28], ARRB1 katalógusa találták, hogy támogassák a migrációs képességét tüdőrák migráció. Ezért nem világos, hogy ebben az időben, hogy ARRB1 katalógusa gátolja vagy elősegíti a migráció AGS sejtekben. Egy másik drasztikusan alulszabályozott gén, IGFBP5 katalógusa, indukál sejtadhézió és növeli a sejtek túlélését az MCF-7 humán emlőrák-sejtek [29]. IGFBP5 tűnik, hogy gátolják migrációját MCF7-sejtek [29], de elősegíti a migráció a perifériás vér mononukleáris sejtekben [30]. Ezért a szerepe IGFBP5 az AGS sejtek migrációját is meg kell határozni.

MPA kezelésére AGS sejtek szintén szignifikánsan felülszabályozott expresszióját számos gén játszik a sejtek migrációját. Ezek közül hét gén ( ATF3 katalógusa, SMAD3 katalógusa, CITED2 katalógusa, CEAMCAM1 katalógusa, CYR61 katalógusa, NOS3
és CDH10 katalógusa) a nagy érdeklődés, mivel a válaszadók több mint négyszeres különbség a microarray hőtérkép (2. ábra). Két hét gén ( ATF3 katalógusa és CDH10 katalógusa) választottak meg, és arról a valós idejű RT-PCR-rel. ATF3
expresszió nőtt 11-szeres után 12 órával az MPA kezelés és a 19-szerese a 48 órát. CDH10
expresszió megváltozik AGS sejtekben azonban nem Hs746T sejtekben (4. ábra). ATF3 Újabban kimutatták, hogy elnyomják metasztázis húgyhólyagrák szabályozásán keresztül Gelson közvetített átalakítás az aktin citoszkeleton. Túlexpressziója ATF3 katalógusa az erősen szóródó húgyhólyag rákos sejtek csökkenti a vándorlási in vitro katalógusa és in vivo katalógusa [31]. A TGF-β /Smad jelátviteli útvonal kritikus szerepet játszik a hasnyálmirigy-vezeték adenokarcinóma növekedés, a migráció és metasztázis. SiRNS mediált csendesítése Smad3 növeli a TGF-β-indukált rákos sejt migrációt [32]. Összhangban a csökkentett migrációs képességét AGS sejtek után MPA kezelés SMAD3 szignifikánsan felülszabályozott által MPA kezelés (2. ábra). CITED2 katalógusa kódolja CBP /p300-kölcsönható transzaktivátor 2 fehérjét, amely pozitívan szabályozza a TGF-β jelátviteli keresztül kapcsolata a SMAD /P300 /CBP által közvetített transzkripciós koaktivátor komplex és serkenti számos más transzkripciós tevékenységét. Bebizonyosodott, hogy a Cited2
knockout egerekben megnövekedett gonadális sejtmigrációt [33]. Ezért, akár szabályozott CITED2
génexpresszió hozzájárulhat a csökkentett migrációs képességét AGS kezelt sejtek MPA. CEACAM1
kódolja a karcinoembrionális antigén kapcsolatos sejt adhéziós molekula (CD66a), amely befolyásolja az integrin-függő jelátviteli és szabályozza az extracelluláris mátrix protein-specifikus morfológiai és migráció az endoteliális sejtek [34]. Bár a legtöbb tanulmány kimutatta, hogy CEACAM1 egyedül játszik promigratory szerepet, a kölcsönhatás a CEACAM1 és filamin Egy drasztikusan csökkentette a migráció és a cella szórás [35]. Ezért a szerepe a CEACAM1 a sejtek migrációs függhet celluláris összefüggésben. Katalógusa

Azonban két gén nagyon up-szabályozott MPA ( CYR61 katalógusa és NOS3 katalógusa ) valóban elősegíti a migráció. CYR61
kódolja a cisztein-gazdag fehérje 61, amely elősegíti a sejtek migrációját keresztül eltérése a funkciók az integrin [36]. A fel-szabályozása CYR61 katalógusa MPA kezelés csökkentheti az anti-migrációs szerepe MPA. A nitrogén-monoxid elősegíti emlőtumor-sejtek migrációját keresztül szekvenciális aktiválása a nitrogén-oxid-szintáz, guanilát-ciklázt és a mitogén-aktivált protein-kináz [37]. NOS3 katalógusa kódolja a nitrogén-monoxid szintáz 3 és nagyon up-szabályozott MPA kezelést. Ismét, up-regulációját NOS3
csökkentheti a fenotípusbeli funkcióját MPA. A CDH10
gén kódolja az egyik cadherin fehérjék kritikus szerepet játszanak a sejt-sejt adhézió. Azt következtetni, hogy CDH10 játszhat kritikus szerepet mesendodermal sejtmigráció Bár ez a kikövetkeztetett összefüggés nem kísérletileg tesztelték. CDH10 katalógusa drasztikusan nőtt MPA kezelés AGS sejtekben azonban nem Hs746T sejtek szerepe a migrációs kell kísérletileg vizsgálni.

PDGFRA
kódol egy sejtfelszíni receptor tirozin-kinázzal tagja a vérlemezke-eredetű növekedési faktor család és ismert, hogy szorosan összefügg a sejtek migrációját [38]. Az alacsony sűrűségű lipoprotein-receptor-related protein 8 (LRP8), más néven apolipoprotein E-receptor-2 (ApoER2) egy sejtfelszíni receptor egy EGF-szerű domént. Ezek a receptorok működnek jelátviteli és endocitózis specifikus ligandumok. LRP8 ismert, hogy fontos szerepet játszik az embrionális neuronális migráció [39]. Extracelluláris ligand kötődés LRP8 és a hozzá kapcsolódó receptor, VLDLR, a vándorló neuronok aktiválja az intracelluláris folyamatok kezdődnek, dAb1 foszforilációs [39]. DAb1, egy tirozin-kináz foszforilezett fehérje, lehet foszforilálják két tirozin-kinázok (Src és Fyn) és foszforilált dAb1 indukál további aktiváló e két kinázok és más kinázok, beleértve a PI3K. A foszforilezett PI3K vezethet gátló foszforilációját a tau kináz glikogén szintáz kináz-3-béta (GSK3b), amely megváltoztatja a tevékenység a tau-protein, amely részt vesz a mikrotubulusok stabilizálása. PI3K is foszforilálni a protein kináz C fehérjék (PKC), amely foszforilálja a legkülönbözőbb célfehérjék és ismert, hogy részt vesz változatos sejtes jelátviteli útvonalak.

• PLoS One: resveratrol gátolja a gyomorrák indukálva G1 fázis leállását és az öregedés egy Sirt1-függő módon
• PLoS One: egy közösségi alapú, eset-kontroll vizsgálat kiértékelése Halálozás csökkentésével gyomorkarcinóma endoszkópos szűrés Japánban