PLoS ONE: Affinitätsmaturierung des monoklonalen Antikörpers 1E11 durch gezielte Randomisierung in CDR3 Regionen optimiert therapeutische Antikörper-Targeting von HER2-positivem Magenkrebs

Abstrakt

Anti-HER2 murinen monoklonalen Antikörper 1E11 hat eine starke und synergistische Antitumoraktivität bei HER2-überexprimierenden Zellen Magenkrebs in Kombination mit Trastuzumab verwendet. Wir derzeit diesen Antikörper für Humantherapeutika optimiert. Zunächst werden die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) des murinen Antikörpers wurden auf menschlichen Keimbahn-Immunglobulin variable Gene aufgepfropft. Kein Unterschied in der Affinität und biologische Aktivität wurde zwischen chimären 1E11 (ch1E11) und humanisierte 1E11 (hz1E11) beobachtet. Als nächstes Affinitätsreifung von hz1E11 wurde durch die Randomisierung von CDR-L3 und H3 Rückstände gefolgt von stringent Biopanning Auswahl durchgeführt. Milder Selektionsdruck begünstigt die Auswahl vielfältiger Klone, während höhere Selektionsstringenz in der Konvergenz der Panning Ausgang auf eine kleinere Anzahl von Klonen mit verbesserter Affinität geführt. Klon 1A12 hatte vier Aminosäuresubstitutionen in CDR-L3, und zeigte eine 10-fache Steigerung der Affinität im Vergleich zum parentalen Klon und erhöhte Wirksamkeit in einem in vitro
anti-proliferative Aktivität Assay mit HER2-overepxressing Magenkrebs Zellen. Klon 1A12 hemmte das Tumorwachstum von NCI-N87 Xenograftmodell mit ähnlicher Wirksamkeit zu Trastuzumab allein und der Kombinationsbehandlung von 1A12 und Trastuzumab die etablierten Tumoren vollständig entfernt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass humanisierte und Affinität gereift monoklonalen Antikörper 1A12 ist ein hoch optimiertes Molekül für zukünftige therapeutische Entwicklung gegen HER2-positiven Tumoren

Citation. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang, Kim KT, et al. (2015) Affinitätsmaturierung des monoklonalen Antikörpers 1E11 durch gezielte Randomisierung in CDR3 Regionen optimiert therapeutische Antikörper-Targeting von HER2-positivem Magenkrebs. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10.1371 /journal.pone.0134600

Editor: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, UNITED STATES

Empfangen: 14. April 2015; Akzeptiert: 12. Juli 2015; Veröffentlicht am: 30. Juli 2015

Copyright: © 2015 Ko et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

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Finanzierung:. Diese Studie wurde von AbClon Inc., und von der National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss zu HS für Medicinal Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) unterstützt wurde . Die kommerzielle Geldgeber (AbClon Inc.) zur Verfügung gestellt Unterstützung in Form von Gehältern für Autoren (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK und JSL), aber hatte keine zusätzliche Rolle im Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung des Manuskripts. Die spezifischen Rollen dieser Autoren sind in der 'Autor Beiträge Abschnitt artikuliert

Konkurrierende Interessen:. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK und JSL sind alle von AbClon Inc. beschäftigt und sein kann besitzen Stock. HS ist auf bezahlte Beratung zu AbClon Inc. und besitzt auch seine Lager. Abclon verfolgt Patente und Produktentwicklung auf Verbindungen, die in diesem Dokument erwähnt werden. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK und JSL sind alle derzeit von der kommerziellen Geldgeber dieser Forschung AbClon Inc. beschäftigt und kann seine Aktien besitzen. HS ist derzeit auf der Beratung bis zur AbClon Inc. bezahlt und besitzt auch seine Lager. AbClon hat ein eingetragenes Patent in Korea (KR10-1453462, Antikörper, die zur spezifischen Bindung an HER2) und reichte eine PCT-Anmeldung (PCT /KR2014 /004317, Antikörper, der spezifisch die Bindung an HER2), in der BKK, YHL, ISH, KTK und JSL als Erfinder aufgelistet. AbClon verfolgt auch die Produktentwicklung auf den humanisierten, affinitätsgereiften Antikörper, die in diesem Dokument erwähnt werden. Diese verändern die Einhaltung der Autoren zu allen PLoS ONE Politik auf den Austausch von Daten und Materialien.

Einführung

Monoklonale Antikörper sind Mainstream-Behandlungen in der Onkologie und Autoimmunerkrankungen und werden voraussichtlich eine wichtige Rolle spielen in die Zukunft der Behandlung von Krankheiten [1, 2]. Mehr als 30 rekombinante Antikörper werden derzeit von der US-amerikanischen Food and Drug Administration, von denen etwa die Hälfte sind Anti-Krebs-Antikörper zugelassen. Magenkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen und ist die dritthäufigste Ursache für Krebstod weltweit [3]. In Magenkrebs, Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) und HER3 ist mit einer schlechten Prognose korreliert [4, 5]. Vor kurzem wurde für die Behandlung von HER2-positivem metastasierendem Magen und gastroösophagealen Übergang Krebs genehmigt die HER2 monoklonalen Antikörper Trastuzumab Targeting basierend auf den Ergebnissen der Trastuzumab mit einer Chemotherapie bei fortgeschrittenem HER2-positivem Magenkrebs (ToGA) klinische Studie [6].

Besondere Kombinationen von gegenseitig nicht-kompetitiven Antikörper die gleichen Rezeptor Erhöhung Antitumoraktivität Targeting in vitro Karten und in vivo
. Die Kombination der HER2-Antikörper, Trastuzumab und Pertuzumab Targeting, zeigt Wirksamkeit bei HER2-überexprimierenden Brustkrebs erhöht [7]. Die Vorteile der Pertuzumab und Trastuzumab Kombination ferner wurden in präklinischen und klinischen Studien nachgewiesen [8, 9]. Andere HER2-Targeting-Antikörper eine bessere Wirksamkeit in Kombination als als Einzelmittel zeigt, und haben konsequent die Herunterregulierung von HER2 Ebenen und günstige Kombinationseffekte in Mausmodellen gezeigt [10]. Die erhöhte Wirksamkeit von Antikörper-Kombinationen auch mit EGFR-Targeting-Antikörper [11, 12] und vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGFR3) -targeting Antikörper [13].

Therapeutische Antikörper typischerweise werden extensiv entwickelt, um nachgewiesen besitzen wünschenswerte biologische und physikalisch-chemische Eigenschaften, wie geringe Immunogenität, eine hohe Affinität und Spezifität, optimal Effektorfunktionen und eine gute Löslichkeit und Stabilität [14]. Insbesondere Humanisierung von Antikörpern und Affinitätsreifung sind zwei der am häufigsten angewandten Engineering-Prozesse bei der Entwicklung von therapeutischen Antikörperkandidaten. Immunogenität von therapeutischen Antikörpers begrenzt die klinische Brauchbarkeit und Wirksamkeit durch die Produktion von anti-drug-Antikörpern [15] und die Humanisierung der Antikörper von der Maus oder einer anderen Spezies ist jetzt ein Standardverfahren für die Entwicklung von therapeutischen Antikörpern. Einige Humanisierung Verfahren wurden entwickelt, die entweder rationale oder empirische Ansätze [16] eingesetzt werden. Die komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) Pfropfung Ansatz als Methode des menschlichen anti-chimären Antikörper (HACA) -Antwort zu überwinden [17] ist eine gut etablierte Methode Humanisierung. Jedoch führt direkte Pfropfung von murinen CDRs auf einen menschlichen Rahmen Akzeptorsequenz oft zu einem Verlust der Affinität, so Back-Mutationen Gerüstregion-Reste (Vernier-Zone Reste), die die Struktur der CDR-Schleifen oft notwendig ist [18]. Für In-vitro-
Affinitätsreifung werden drei Ansätze Diversifizierung der Regel verwendet: Zufallsmutagenese durch z.B. fehleranfällige PCR, Randomisierung von gezielten Rückstände unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden, und Ketten-Shuffling. In der Randomisierung Ansatz richten, sind in CDRs das logische Ziel für die Randomisierung in den meisten Fällen, weil somatische Hypermutation Mutationen in CDRs von Antikörpern zu begünstigen [19], und CDR-H3 und CDR-L3 der Antikörper-Antigen-Interaktion dominieren eher entwickelt hat [ ,,,0],20]. Eines der Hauptprobleme bei der gezielten Randomisierung verbunden ist die Auswahl der Positionen, die nicht essentiell für das Antigen sind, Bindungs, aber die die Affinität erhöhen kann, wenn eine optimale Substitution der Aminosäure hergestellt wird. Alanin-Scanning können die Rückstände zu ermitteln statistisch zu verteilen, vor allem, wenn CDRs lang sind. Manchmal erhöht Alanin-Mutation sich die Affinität der Antikörper [21].

Wir entwickelten zuvor eine Maus-Antikörper HER2-Targeting (Klon 1E11), die in Kombination mit Trastuzumab synergistische Antitumoraktivität zeigt in HER2 Magenkrebszelllinien überexprimiert, [22 ]. In diesem Bericht beschreiben wir, wie wir die 1E11 für einen therapeutischen Antikörper, der durch CDR Pfropfen für die menschliche Keimbahn-Immunglobulin-variable Gene und Affinitätsreifung durch gezielte Randomisierung von CDR-H3 und CDR-L3 optimiert. Der optimierte 1E11-Antikörper (Klon 1A12) zeigt synergistische Antitumoraktivität bei HER2-positivem mit Trastuzumab Magenkrebs Xenotransplantatmodellen in Kombination. Es wurde für den Klon 1E11, menschliche Keimbahn variable Gene eignen sich Akzeptoren für Humanisierung ohne Affinität Reduktion und die Substitution von CDR-L3-Reste, die nicht wesentlich sind für die Antigenbindung war genug, um zur Verbesserung der Affinität um mehr als das 10-fache beobachtet, dass.

Materialien und Methoden

Die Zelllinien und Materialien

NCI-N87-Zellen von der American Type Culture Collection erworben wurden (ATCC, Manassas, VA, USA) und OE-19-Zellen wurden von der European Collection of Cell Culture (ECACC, Porton Down, UK) erhalten. Das Zellkulturmedium war RPMI-1640 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, und Antibiotika, und die Zellen wurden kultiviert bei 37 ° C unter 5% CO _{2. Trastuzumab und Palivizumab wurde von Genentech (South San Francisco, CA, USA) und MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA) hergestellt sind. Chrompure Human-IgG (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) wurde als menschliche IgG-Kontroll-Antikörper für In-vitro-
Assays verwendet. IgG-Antikörper wurden mit dem Freestyle 293 System erzeugt (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und unter Verwendung von Protein-A-Affinitätschromatographie (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Endotoxin wurde mit einem Endotoxin Removal Kit entfernt (GenScript, Piscataway, NJ, USA), und Endotoxin-Spiegel wurden unter Verwendung eines Endotoxinnachweis Kit (GenScript) bestimmt. Rekombinante Proteine ​​wurden als sekretierte Proteine ​​produzierte die Freestyle 293-System und gereinigt unter Verwendung von Protein-A oder Ni-NTA-Chromatographie (Qiagen, Valencia, CA, USA) für Fc-tagged oder His-markierte Proteine, respectively.}

Alanin-Scanning-Mutagenese und Fab Reinigung

Die ortsgerichtete Mutagenese für Alanin-Scanning wurde durch PCR-Mutagenese unter Verwendung von Quick-Change-Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) durchgeführt. Mutant Fab-Proteine ​​wurden exprimiert und gereinigt auf die Bedeutung eines jeden Restes für Antigen-Bindungsaktivität zu untersuchen. Kurz gesagt, Escherichia coli DH5 &agr;
Zellen mit dem Vektor transformierten pComb3X mutant Fab-Gene wurden bei 28 ° C in SB-Brühe gezüchtet beherbergen. Expression wurde induziert mit 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid, wenn die optische Dichte (600 nm) der Kultur 0,8 erreichte. Zellpellets wurden in gekühltem Extraktionspuffer (120 mM Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA und 300 mM Saccharose) und inkubiert auf Eis für 30 Minuten zur periplasmatischen Extraktion resuspendiert. Magnesiumchlorid (2,5 mM) wurde nach Zentrifugation zur geklärte Extrakt hinzugefügt freie EDTA vor immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) Reinigung abfängt. Gereinigtes Fab-Proteine ​​wurden für den ELISA-Bindungsassay verwendet und k
_{off-Analyse unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz (SPR).}

Affinitätsreifung

Humanized 1E11 geklont in pComb3X Vektor als Fab-Format als Matrize für die Overlap-Extension-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Mutagenese verwendet wurde, wie früher beschrieben [23]. Die degenerierten Oligonucleotide (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(rückwärts) und 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Vorwärts) wurden für die L-NNK und H-XXS-Bibliothek verwendet wurden. N bezeichnet A, C, G oder T; M C oder A; und S G oder C. Nummerierte Basispositionen zeigen Hand gemischt Nukleotiden, bestehend aus 70% einer Base und jeweils 10% der anderen drei Basen: 70% Frequenzbasis ist G, A, T und C für 1, 2, 3 und 4. Für die H-2AA Bibliothek eine äquimolare Mischung der folgenden Vorwärts mutagenen Oligonukleotide wurden verwendet: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 'und 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K bezeichnet G oder T. Nach zwei Runden der Overlap-Extension-PCR, Fab-Bibliothek-DNA mit einer randomisierten CDR wurde mit SfiI geschnitten, in die SfiI-verdaute Phagemidvektor pComb3X und Elektroporation in E
abgebunden. coli
Stamm ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

Hohe Affinität Bindemittel wurden unter Verwendung von löslichem biotinylierten HER2-ECD-Protein ausgewählt. Bead Bindemittel wurden durch Inkubation der Antikörper-Phagen-Bibliothek mit 100 ul vorblockierte Dynabeads M-280 Streptavidin (Invitrogen) für 1 Stunde unter langsamer Rotation bei Raumtemperatur vorge abgereichert. Biotinylierte HER2-ECD-Protein (100 nm- 12.01) wurde zu dem vorge abgereicherten Antikörperbibliothek hinzugefügt und für 1 Stunde mit Rotation bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 50 ul blockierter Streptavidin-magnetische Kügelchen wurden zugegeben und für 15 Minuten auf dem Rotator inkubiert. Perlen wurden 10-mal mit 1 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung-Tween 20 (TBST) und zweimal mit 1 ml PBS gewaschen. Gebundenen Phagen wurden durch Inkubation der Kügelchen mit 1 ml 100 mM Triethylamin für 8 Minuten, dann mit 0,5 ml 1 M Tris, pH 7,4 neutralisiert eluiert.

ELISA Bindungsaktivitätstest

Antikörper wurden hinzugefügt zu Costar 96-Well-Halbfläche Platten (Corning, Corning, NY, USA Art.Nr. 3690) mit 1 &mgr; g /ml des Antigens beschichtet. Nach Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten dreimal mit TBST gewaschen und inkubiert mit Kaninchen-anti-Human-Antikörper-Meerrettich-Peroxidase (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) für IgG-Antikörper und Ratten-anti-HA-HRP (Klon F10, Roche Life Science, Basel, Schweiz) für Antikörper Fab sind. Platten dreimal gewaschen wurden, Tetramethylbenzidin (TMB) Peroxidase-Substrat (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) wurde zugegeben und die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 N Schwefelsäure (Duksan, Ansan, Korea) gestoppt. Die Absorption bei 450 nm wurde unter Verwendung eines Victor X3 Instrument (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) gemessen.

Oberflächenplasmonresonanz-Analyse

Für k
_{off-Analyse von Fab-Proteinen wurde HER2-ECD-His-Protein auf der Oberfläche eines CM5-Sensorchip (GE Healthcare) unter Verwendung des Aminkopplungsverfahren bei etwa 2.000 Antworteinheiten (RU) immobilisiert. Gereinigtes Fab-Proteine ​​wurden mit 2 ug /ml-Konzentration und einer Durchflussrate von 50 &mgr; l /min injiziert. Für k
off-Analyse von IgG-Antikörpern, Ziegen-Anti-Human-IgG (γ) (Invitrogen, Kat. Nr H10500) auf den CM5-Sensorchip mit Amin Kupplung immobilisiert wurde, und Antikörper eingefangen wurden bei 1 &mgr; g /ml für 4 Minuten und stabilisiert für 5 Minuten bei einer Flussrate von 50 &mgr; l /Minute. HER2-ECD-His-Protein wurde in einer Konzentration von 160 nM injiziert. Zur Affinitätsmessungen bei ungefähr 50 RU durch Antikörper wurden Ziege erfasst anti-human IgG (γ) auf einem CM5-Chip immobilisiert. HER2-ECD-His-Protein wurde bei Konzentrationen von 0-640 nM Bereich injiziert. Sensorgramme wurden bei jeder Konzentration erhalten und bewertet die BIAevaluation Software. Für Epitop Binning wurde IgG Form von hz1E11 auf separaten Sensor CM5 Chipoberflächen immobilisiert bei etwa 1000 Antworteinheiten. HER2-ECD-His (320 nM) und Antikörper (1 ug /ml) wurden für 4 min nacheinander zugegeben und stabilisiert für 5 Minuten bei einer Flussrate von 50 &mgr; l /Minute.}

Zelllebensfähigkeitstest

die Zellen wurden in 96-Well-Platten (Corning) in 10% FBS enthaltendem Medium und vorkultiviert für 24 Stunden beimpft. Die Zellen wurden mit Antikörper in den angegebenen Konzentrationen und die Kultur für 4 Tage behandelt. WST-1-Reagens (Dogen EZ-Cytox; Daeil Lab-Service, Seoul, Korea) wurde verwendet, die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen. Relative Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Division der Absorption jeder Vertiefung durch die mittlere Absorption von PBS-behandelten Vertiefungen in jeder Platte berechnet.

Xenograft Studie

Athymischen nackte weibliche Mäuse (Daehan Biolink, Chungbuk, Korea subkutan in die linke Flanke Bereich) wurden mit injizierten 5 x 10 ^{6 von NCI-N87-Zellen in Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Tumoren durften etwa 200 mm 3 in der Größe zu wachsen, und die Mäuse wurden dann in Gruppen randomisiert. Die Tiere erhielten intraperitoneale Verabreichung von Antikörpern bei den angegebenen Dosen zweimal wöchentlich. Die Tumorvolumina wurden unter Verwendung der Formel berechnet (L × B × B) /2, wobei L den größten Tumordurchmesser darstellt und W die kleinste Tumordurchmesser. Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Bonferroni Post-Test wurde für die statistische Analyse der Tumor growth.All Tierstudien durchgeführt, in Übereinstimmung durchgeführt wurden, mit den Richtlinien der NIH "Leitfaden für Pflege und Verwendung von Tieren" und einem genehmigten Protokoll empfangen durch die Institution Animal Care und Verwenden des Unternehmens Committee.}

Ergebnisse

• PLoS ONE: Strahlungsinduzierte Leberschädigung in Dreidimensionale Conformal Radiation Therapy (3D-CRT) für postoperative oder Lokoregionale Recurrent Magenkrebs: Risikofaktoren und Dosis Limitation…
• PLoS ONE: Verlust der Expression von Reprimo, eine p53-induzierte Gene Zellzyklusarrest, korreliert mit einer invasiven Stadium der Tumorprogression und p73 Expression in Magen Cancer