PLoS One: affinitásérést monoklonális antitest 1E11 által célzott randomizá- a CDR3 régió optimalizálja Terápiás antitest célzás HER2-pozitív gyomorkarcinóma

absztrakt

anti-HER2 egér monoklonális ellenanyag 1E11 erős és szinergikus tumorellenes aktivitást HER2-t overexpresszáló gyomorrák-sejtek, amikor együtt használják trasztuzumab. Mi jelenleg optimalizált ez az antitest a humán gyógyászatban. Először is, a komplementaritást meghatározó régiókat (CDR-ek), a rágcsáló ellenanyag ojtott humán csíravonal immunglobulin variábilis géneket. Nincs különbség a affinitása és biológiai hatása volt megfigyelhető között kiméra 1E11 (ch1E11) és humanizált 1E11 (hz1E11). Ezután affinitás érését hz1E11 végeztük a randomizálás CDR-L3 és H3 maradékok követ szigorú biopanning kiválasztása. Enyhébb szelekciós nyomás kedvezett a választék több különböző klónok, míg a nagyobb választéka szigorúsága következtében a konvergencia a pásztázás kimenetet egy kisebb számú klón javított affinitást. Klón 1A12 négy aminosav-szubsztitúciót CDR-L3, és megmutatta, 10-szeres affinitással, mint a szülői klónból, és fokozott potenciát egy in vitro
antiproliferatív aktivitás assay HER2-overepxressing gyomorrák sejtekben. Klón 1A12 gátolta a tumor növekedését NCI-N87 xenograft modell hasonló hatékonysággal trastuzumab egyedül, és a kombinációs kezelés a 1A12 és trastuzumab teljesen eltávolították a kialakult tumorok. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a humanizált és affinitás érett monoklonális antitest 1A12 egy erősen optimalizált molekula jövőbeli terápiás fejlesztés ellen HER2-pozitív daganatok. Katalógusa

Citation: Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et al. (2015) affinitásérést monoklonális antitest 1E11 által célzott randomizá- a CDR3 régió optimalizálja Terápiás antitest célzás HER2-pozitív gyomorrákban. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10,1371 /journal.pone.0134600 katalógusa

Szerkesztő: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK katalógusa

Beérkezett: április 14, 2015; Elfogadva: július 12, 2015; Megjelent: július 30, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Ko et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány által támogatott AbClon Inc., valamint a Nemzeti Kutatási Alapítvány Korea (NRF) támogatás HS szánt gyógyszerek Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) . A kereskedelmi finanszírozói (AbClon Inc.), támogatás formájában fizetések szerzők (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, és JSL), de nem volt semmilyen további szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntését, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. A konkrét szerepe ezen szerzők csuklós a "szerző hozzájárulások" részben. Katalógusa

Érdekütközés: BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, és JSL mind által alkalmazott AbClon Inc. és birtokolni Készlet. HS fizetett tanácsadó a AbClon Inc. és a tulajdonosa az állomány. Abclon folytat a szabadalmak és a termék fejlesztése a vegyületeket, amelyek a fent ez a dokumentum. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, és JSL mind által jelenleg alkalmazott kereskedelmi finanszírozója kutatás AbClon Inc. és a saját állomány. HS jelenleg fizetett tanácsadással AbClon Inc. és a tulajdonosa az állomány. AbClon rendelkezik regisztrált szabadalom Koreában (KR10-1453462, antitestek képesek specifikusan kötődni a HER2) és nyújtott be PCT bejelentés (PCT /KR2014 /004317, antitest specifikusan kötődni HER2), amelyben a BKK, YHL, ISH, KTK, és JSL szerepelnek, mint a feltalálók. AbClon továbbá folytatja termék fejlesztése a humanizált, affinitással érlelt antitest, amelyek a fent ez a dokumentum. Ezek nem változtatja meg a szerzők betartása minden PLoS One politikák adatok megosztása és anyagok. Katalógusa

Bevezető katalógusa

A monoklonális antitestek többségi kezelések az onkológiában és autoimmun betegségek, és várhatóan fontos szerepet játszanak a jövőben a betegség kezelés [1, 2]. Több, mint 30 rekombináns ellenanyagok jelenleg jóváhagyott az Egyesült Államok Food and Drug Administration, amelyek közül mintegy fele rákellenes antitesteket. Gyomorrák egyik leggyakoribb rákos megbetegedések és a harmadik vezető daganatos halálok világszerte [3]. A gyomorrák, overexpressziója epidermális növekedési faktor receptor (EGFR), a humán epidermális növekedési faktor receptor 2 (HER2) és HER3 korrelál a gyenge prognózissal [4, 5]. A közelmúltban, a HER2 megcélzó monoklonális antitest trastuzumab jóváhagyták kezelésére HER2-pozitív, metasztatikus gyomor és gyomor találkozásánál rák eredményei alapján a trastuzumab-kemoterápiával HER2-pozitív előrehaladott gyomorrákban (ToGA) klinikai vizsgálat [6]. Katalógusa

sajátos kombinációi kölcsönösen noncompetitive célzó ellenanyagok ugyanazt a receptort növekedése daganatellenes aktivitás in vitro
és a in vivo katalógusa. Kombinációja a HER2 célzó ellenanyagok, trastuzumab és pertuzumab, azt mutatja, hatékonyság növekedését HER2-t túlzott mértékben emlőrákok [7]. Az előnyök a pertuzumab és trasztuzumab kombináció már tovább igazolták a preklinikai és klinikai vizsgálatok [8, 9]. Egyéb HER2-célzási antitestek mutató jobb hatásosságot kombinációt, mint egyetlen ágensként, és kimutatták, következetes down-regulációja HER2 szintek és előnyös kombináció hatása egér modellekben [10]. A megnövekedett hatásosságát antitest kombinációk is kimutatták EGFR-t célzó ellenanyagok [11, 12] és a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor receptor 3 (VEGFR3) -targeting antitestek [13].

terápiás antitestek jellemzően széles körben tervezték, hogy rendelkeznek kívánatos biológiai és fizikai-kémiai tulajdonságok, mint például az alacsony immunogenitási, nagy affinitással és specificitással, optimális effektor funkciókat, és a jó oldékonysága és stabilitása [14]. Különösen, az ellenanyag humanizálása és affinitás érést kettő a leggyakrabban alkalmazott mérnöki folyamatok fejlesztése során a terápiás antitest jelölt. Immunogenitás A terápiás ellenanyag korlátozza klinikai hasznosságát és hatásosságát termelési kábítószer-ellenes antitestek [15], és a humanizálása származó antitestek egér vagy más faj most egy szokásos eljárás a fejlesztési terápiás antitestek. Néhány humanizálás módszert fejlesztettek foglalkoztató akár racionális vagy empirikus megközelítések [16]. A komplementaritást meghatározó régió (CDR) ojtásos megközelítés mint módszer legyőzni a humán anti-kiméra antitest (HACA) válasz [17] egy jól megalapozott humanizálás módszerrel. Ugyanakkor a közvetlen oltása egéreredetű CDR-ek humán vázrégióba akceptor szekvencia gyakran eredményez veszteséget affinitás, így hát-mutációk vázrégió maradékok (Vernier zóna maradékok) alátámasztó szerkezetének CDR-hurkok gyakran szükség van [18]. Mert in vitro katalógusa affinitásérést három diverzifikálása megközelítés általában használják: random mutagenezis például hibára hajlamos PCR véletlenszerűség célzott maradványokat degenerált oligonukleotid, és a lánc shuffling. A megcélzott randomizálás megközelítés, CDR-ek a logikai cél a randomizálás a legtöbb esetben, mert a szomatikus hipermutáció fejlődött, hogy előnyben mutációk CDR antitestek [19], és CDR-H3 és CDR-L3 uralják az antitest-antigén kölcsönhatás [ ,,,0],20]. Az egyik fő problémák a célzott randomizálás kiválasztásakor a pozíciók, amelyek nem elengedhetetlenek a antigénkötő, de amelyek fokozzák az affinitás amikor optimális helyettesítése aminosav készül. Alanin pásztázó segíthet meghatározni a szermaradványok, hogy véletlenszerű, különösen, ha CDR hosszú. Néha, alanin mutáció önmagában növeli a affinitását antitestek [21].

korábban kifejlesztett egy rágcsáló ellenanyag célzási HER2 (klón 1E11), amely azt mutatja, szinergikus tumorellenes aktivitást kombinációban trastuzumab HER2 overexpresszáló gyomor rákos sejtvonalak [22 ]. Ebben a jelentésben leírjuk, hogy hogyan tudjuk optimalizálni a 1E11 egy terápiás antitest CDR oltása humán csíravonal immunglobulin variábilis gének és affinitásérést célzott véletlenszerűség a CDR-H3 és CDR-L3. Az optimalizált 1E11 ellenanyag (klón 1A12) mutatja szinergikus tumorellenes aktivitást HER2-pozitív gyomorrák xenograftmodellekben kombinálva trastuzumab. Azt tapasztaltuk, hogy a klón 1E11, humán csíravonal variábilis gének alkalmasak akceptorok humanizálásához nélkül affinitás csökkentése, és a helyettesítés a CDR-L3-maradékok, amelyek nem elengedhetetlenek antigénkötő elég volt ahhoz, hogy javítsa a affinitása több mint 10-szeres.

anyagok és módszerek

Sejtvonalak és anyagok

NCI-N87 sejteket vásárolt American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) és OE-19 sejtek kaptuk a European Collection of Cell Culture (ECACC, Porton Down, UK). A sejttenyésztési tápközeg volt RPMI-1640 kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS) és antibiotikumokat és a sejteket tenyésztettük 37 ° C hőmérsékleten 5% CO _{2. Trastuzumab és palivizumab állította elő Genentech (South San Francisco, CA, USA), és Medlmmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA), ill. ChromPure humán IgG-t (Jackson Immuno, West Grove, PA, USA) alkalmaztunk humán IgG kontroll antitest in vitro
vizsgálatokban. IgG antitesteket állítottunk elő a Freestyle 293 rendszer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), és tisztítjuk protein-A affinitási kromatográfiával (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Endotoxin eltávolítjuk egy Endotoxin Removal Kit (Genscript, Piscataway, NJ, USA), és az endotoxin szinteket határoztuk meg endotoxin Detection Kit (Genscript). A rekombináns fehérjéket állítottunk elő a szekretált fehérjék felhasználásával Freestyle 293 rendszer és tisztítjuk protein-A vagy Ni-NTA kromatográfia (Qiagen, Valencia, CA, USA) az Fc-címkézett vagy His-jelölt fehérjéket, ill.}

alanin-letapogató mutagenezis és Fab tisztítás

helyspecifikus mutagenezis alanint letapogató végeztük PCR-mutagenezis alkalmazásával QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, santa Clara, CA, USA). Mutáns Fab fehérjét expresszált és tisztított, hogy értékelje a fontosságára, hogy minden maradék az antigénkötő aktivitást. Röviden, a Escherichia coli
DH5a sejteket transzformáltunk a pComb3X vektor hordozó mutáns Fab gén növesztettük 28 ° C-SB húslevest. Expression indukáltuk 1 mM izopropii β-D-1-tiogalaktopiranozid amikor az optikai sűrűség (600 nm) a tenyészet elérte a 0,8. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk hűtött extrakciós pufferben (120 mM Tris, pH = 8,0, 0,3 mM EDTA-t és 300 mM szacharóz), és jégen inkubáljuk 30 percen periplazmatikus extrakció. Magnézium-klorid (2,5 mm) adunk a tisztított extraktumot a centrifugálás után lekötésére szabad EDTA megelőzően immobilizált fémion affinitási kromatográfia (IMAC) tisztítás. A tisztított Fab fehérjét használtunk ELISA kötési vizsgálattal és a K
_{off elemzés felületi plazmon rezonancia (SPR).}

affinitásérést

Humanizált 1E11 klónozott pComb3X vektor például Fab formátum használtunk templátként a átfedés hosszabbító polimeráz-láncreakció (PCR) mutagenezis a korábban leírt módon [23]. A degenerált oligonukleotidok (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(reverz) és 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Előre) alkalmaztunk az L-NNK és H-XXS könyvtár, ill. N értéke A, C, G vagy T; M jelentése C vagy A; és S G vagy C Számozott bázis pozíciók jelzik kézzel kevert nukleotidok amely 70% mennyiségben egy bázist és 10% az összes többi három bázis: 70% frekvencia bázis G, A, T, és C-1, 2, 3 és 4, ill. A H-2AA Library, ekvimoláris keveréke a következő előre mutagén oligonukleotidot alkalmaztuk: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 ', és az 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K jelöli G vagy T. után két fordulóban átfedés kiterjesztéses PCR, Fab könyvtár DNS egy randomizált CDR volt vágva a Sfil, ligáljuk Sfil-gyel emésztett fagemid vektorba pComb3X, és elektroporációval E katalógusa. coli törzs katalógusa ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Katalógusa

Nagy affinitású kötők segítségével választottuk oldható biotinilezett HER2-ECD protein. Bead kötőanyagokat előre kimerült inkubálva az antitest fág könyvtár 100 ni előre blokkolt Dynabeads M-280 Streptavidin (Invitrogen) 1 órán lassú forgás, szobahőmérsékleten. A biotinilezett HER2-ECD protein (100 nM- 12:01) adunk a pre-szegényített antitest könyvtár és 1 órán át inkubáltuk a forgás, szobahőmérsékleten. Ezután 50 pl blokkolt sztreptavidin mágneses gyöngyöket adtunk hozzá, és inkubáltuk a forgató 15 percig. Gyöngyöket mossuk 10-szer 1 ml Tris-pufferolt sóoldatot-Tween 20-at (TBST), valamint kétszer 1 ml PBS-ben. A kötött fágokat eluáltuk inkubálva a gyöngyöket 1 ml 100 mM trietil-amin 8 percig, majd semlegesítjük 0,5 ml 1 M Tris, pH = 7,4.

ELISA kötési aktivitás teszt

antitesteket adtunk a Costar 96-lyukú fele terület lemezekre (Corning, Corning, NY, USA Product No. 3690) bevont 1 ug /ml az antigént. Inkubálás után szobahőmérsékleten 1 órán át, a lemezeket háromszor mossuk TBST-vel és inkubáltuk nyúl anti-humán ellenanyag-torma-peroxidáz (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) az IgG antitestek és a patkány anti-HA-HRP (Clone F10, Roche Life Science, Basel, Svájc) Fab antitest, ill. A lemezeket háromszor mostuk, tetrametil-benzidin (TMB) peroxidáz szubsztrátot (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) adtunk hozzá, és reakciók hozzáadásával leállítjuk 1 N kénsavat (DukSan, Ansan, Korea). Abszorbancia 450 nm-en mértük Victor X3 eszköz (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA). Katalógusa

Felületi plazmon rezonancia elemzés katalógusa

k katalógusa _{off elemzés Fab fehérjét, a HER2-ECD-His fehérjét immobilizált felületére egy CM5 szenzor chip (GE Healthcare) segítségével az amin kapcsolási eljárás körülbelül 2.000 válasz egység (RU). A tisztított Fab fehérjét injektáltunk a 2 ng /ml koncentrációban, és az áramlási sebesség 50 ul /perc. A K
off elemzése IgG antitestek, kecske anti-humán IgG-t (γ) (Invitrogen, Cat. No. H10500) rögzítünk a CM5 szenzor chip alkalmazásával amin kapcsolás, és antitesteket elfogott 1 ng /ml 4 percig és a stabilizált 5 percen át, áramlási sebesség 50 ul /perc. HER2-ECD-His fehérje injektáltuk koncentrációban 160 nmol. Affinitás mérések ellenanyagokat fogtunk körülbelül 50 RU által kecske anti-humán IgG-t (γ) immobilizált CM5 chipen. HER2-ECD-His fehérjét injektáltunk a koncentráció tartományban 0-640 nM. Szenzorgrammokat kaptuk minden egyes koncentrációnál és értékeltünk a BIAevaluation szoftver. Epitóp binning, IgG formájában hz1E11 rögzítünk külön CM5 szenzor chip felületek mintegy 1000 válasz egységek. HER2-ECD-His (320 nm) és az antitestek (1 ng /ml) adtunk hozzá 4 perc és a stabilizált 5 percen át, áramlási sebesség 50 ul /perc.}

életképesség teszt katalógusa

sejteket szélesztettünk 96 lyukú lemezekre (Corning), a 10% FBS-t tartalmazó tápközegben és a pre-24 órán át tenyésztettük. A sejteket kezeltük antitestekkel a jelzett koncentrációkban, és a kultúra 4 napig. WST-1 reagenst (Dógen EZ-Cytox; Daeil Lab Service, Szöul, Korea) mértük sejt életképességét. Relatív sejt életképességét kiszámítani abszorpciós minden jól az átlagos abszorbancia PBS kezelt lyukakból mindegyik lemezen. Katalógusa

xenograft vizsgálat katalógusa

thymushiányos nőstény egereket (Daehan Biolink, Chungbuk, Korea ) injektáltunk szubkután a bal szárnyon területet 5 × 10 ^{6 NCI-N87 sejtek Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). A tumorokat hagytuk növekedni, hogy megközelítőleg 200 mm 3 méretű, és az egereket ezután véletlenszerűen csoportokba. Az állatoknak intraperitoneális beadása antitestek a jelzett dózisokban hetente kétszer. Kiszámítottuk a tumorok térfogatát a következő képlet segítségével (L × W × W) /2, ahol L jelenti a legnagyobb tumor átmérője W képviseli a legkisebb tumor átmérője. Kétirányú ismételt méréses ANOVA, majd Bonferroni poszt-tesztet végeztünk a statisztikai elemzés a tumor growth.All állat vizsgálatokat végeztek az iránymutatásokkal összhangban a NIH "Útmutató a Care and Use of Animals" és jóváhagyott protokoll által kapott a cég Intézet Animal Care and Use Committee. katalógusa}

Eredmények katalógusa

humanizálása 1E11 által végzett CDR-oltással humán csíravonal gének katalógusa

fejleszteni a humanizált antitest, a VH és VL szekvenciáit rágcsáló 1E11 összehasonlítottuk humán csíravonal V és J gén repertoárok segítségével IMGT /V-küldetés elemzési eszközök [24]. A nehéz lánc esetében, IGHV3-48 * 03 és IGHJ4 * 01 mutatta a legnagyobb homológiát a 1E11 társaik, megosztva 85% -os és 87% -os azonosság, ill. A könnyű láncot, humán IGKV1-39 * 01 és IGKJ1 * 01 gének jelenik azonossága 80%, illetve 81% volt. Ezek az emberi gének került kiválasztásra, mint akceptor-szekvenciákat az oltás a rágcsáló CDR-eket. Között a Vernier zóna, amely a maradékok a vázrégió, amelyek részt vesznek a bemutatása CDR struktúrák támogatásával a CDR-hurkok [18, 25], csak egy maradékot 49. pozícióban _{H a nehéz lánc különbözött egér és humán szekvenciákat. Következésképpen, a humanizált 1E11, hz1E11, csak egy egér-maradékot a vázrégiók (1. ábra).}

kötő aktivitását hz1E11 extracelluláris régió (ECD) a HER2 egyenértékű volt a ch1E11 (2A ábra), és az affinitás trastuzumab, ch1E11, és hz1E11 volt 3 nM, 23 nM, 23 nM, ill. Azt is megerősítette, hogy hz1E11 kötött al-domain IV, mint a szülői ch1E11. Trastuzumab is kötődik al-domain IV [26]. A in vitro katalógusa anti-proliferatív tevékenységét hz1E11 egyetlen szerként és trasztuzumabbal kombinálva is egyenértékű ch1E11 (2C ábra). Az előző tanulmány [22] azt jelentették, hogy ch1E11 volt in vivo daganatellenes hatást katalógusa összehasonlítható a trastuzumab egyetlen szerként, valamint a kombinált ch1E11 és trastuzumab eredményezte tumor regresszió index (TGI) pontjában 95,1%. Hasonlóképpen, hz1E11 egyetlen szerként hasonló volt in vivo
tumorellenes aktivitás trastuzumab (S1 ábra), és a kombináció a hz1E11 Trasztuzumabbal azt is kimutatta, dózisfüggő tumorellenes aktivitás a NCI-N87 xenograft egérmodellben ( ábra 2D). Ellenanyag kombinációs kezelést 1 mg /kg mindegyik hz1E11 és trastuzumab eredményezett hasonló tumorellenes aktivitást a trasztuzumab egyetlen kezelést 10 mg /kg, és a 2,5 mg /kg kombinációja, és a fenti a megállapított daganat stabilizált vagy kezdődött regressing (Nincs statisztikailag szignifikáns különbség [ P
< 0,05] volt megfigyelhető között 2,5, 5 és 10 mg /kg kombinációk). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy hz1E11 rendelkezik a affinitása és biológiai hatása egyenértékű ch1E11, és hogy hz1E11 fokozza az anti-tumor aktivitásának trastuzumab, amikor kombinációban alkalmazzuk.

alanin letapogatási CDR-H3 és CDR-L3 katalógusa

azonosítani a kritikus maradékok antigén-antitest kölcsönhatás, alanin pásztázó mutagenezist végeztünk CDR3 régiókban a nehéz és könnyű láncok (CDR-H3 és CDR-L3). A hatások a mutációk értékelték elemzésével kötési aktivitást a tisztított Fab fehérjék indirekt ELISA-val. CDR-H3, alanin szubsztitúció pozícióját Gly98 _{H eltörölte a kötelező a Fab HER2 és G97 HA és T99 HA mutánsok csökkent kötési aktivitás (3A ábra). CDR-L3, alanin helyettesítések volt sokkal kisebb hatást (3B ábra). A k katalógusa off értékek az alanin pásztázó mutánsok segítségével elemeztük SPR ellen immbolized HER2-ECD protein. Azt megerősítette, hogy a nehéz lánc G98A mutáns teljesen elvesztette kötelező tevékenységek, valamint a szomszédos T99 HA és G97 HA mutánsok eredményezte 32-szeres és 17-szorosára emelkedett k katalógusa off értéket , illetőleg (ábra 3C). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a nehéz lánc Gly98 H funkcionálisan kritikus és a szomszédos maradékok szintén funkcionálisan fontos antigén-antitest kölcsönhatás.}

Affinity érését hz1E11

Affinity érését hz1E11 végeztek az építési nehéz vagy könnyű lánc CDR3 variáns könyvtárak, majd a egyensúlyi kiválasztását a fág ellenanyag-könyvtárak. A könnyű lánc, glutamin pozíciókban 89 _{L és 90 L nem diverzifikált mert glutamin gyakran megtalálható ezekben a pozíciókban kilenc aminosav-longCDR-L3-szekvenciák 59% és 73% frekvenciák, illetve [ ,,,0],27]. Pozicionálja 91 L-94 L random segítségével NKK degenerált kodon (L-NKK). A nehéz lánc esetében, pozícionálja a 95 H -100a H random alkalmazásával XXS kodon (H-XXS), úgy tervezték, hogy az első és a második nukleotid pozíciók a diverzifikált kodon a vad típusú bázis történt 70 % esélye, mind a többi három bázisok fordult elő 10% -os frekvencia, és a harmadik betű a kodonok alkalmazásával szintetizáltuk ekvimoláris keveréke G és C (ábra 4A). Nagy affinitású kötőanyagok közül kerültek kiválasztásra nagy szigorúságú vagy alacsony szigorúságú panning (1. táblázat).}

Összehasonlítva az alacsony szigorúságú panning az L-NNK könyvtár, amelyben a 100% a második, harmadik, és a negyedik körben kimenet klónokat volt ELISA pozitív, a nagy szigorúságú aranymosás a negyedik fordulóban kimenet nem hozott kötőanyag egyáltalán, és csak egyharmada a harmadik fordulóban kimenet klónokat ELISA pozitív (1. táblázat). A kiválasztott klónokat a CDR-L3 könyvtár tartalmazza sok olyan szekvenciákat, amelyek már az összes négy randomizált CDR-L3 pozíciók mutált, ellentétben CDR-H3 könyvtárak, ahonnan a legtöbb kiválasztott klónok megtartotta a vad típusú szekvencia pozíciók 97 _{H -100 H (lásd alább). Különböző úsztatás stratégiák engedett más sorrendben dúsítás mintákat. Például a könnyű lánc variáns klónt 1A12 (Q 89LQNAYAPWT 97L) izoláltuk a nagy szigorúságú panning, de nem az alacsony szigorúságú panning, és a nehéz lánc variáns klónt 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) is kiválasztott csak a nagy szigorúságú aranymosás. Érdekes módon, 59% -a egyedi antitestek 4 ^{th kimenet alacsony szigorúságú panning L-NNK könyvtár volt alanin-es helyzetben 92 L, összhangban alanin pásztázó analízis (ábra 4B).}}

Majdnem minden klónok izoláljuk a H-XXS könyvtár ugyanaz volt a szekvencia 97 _{H -100 H, mint a szülői klón, mutattak, és egyértelműen dúsítása Asn-Tyr szekvencia 95-96. További értékelése hozzájárulását CDR-H3 maradékokat az antigén-antitest kötődés további CDR-H3 könyvtárat épített iker NKK véletlen kodon szkennelése CDR-H3 (H-2AA ábra 4A). Az alacsony szigorúság aranymosás, mutánsok pozíciók 95 H, 96 H, 99 H 100 H, és a 100a H került kiválasztásra az első körben panoráma, de csak mutánsok pozíciókban 95 H és a 96 H gazdagodott a negyedik-kerek kimenet (1. táblázat). Nem érzékeli a mutánsok pozícióban Gly97 H és Gly98 H bármely panoráma stratégiák és kimenetek. Katalógusa}

Affinity és kötő aktivitása kiválasztott klónok katalógusa

Annak felmérése kombináció hatása az affinitással érlelt nehéz és könnyű lánc variánsok, IgG antitestek kombinációjával affinitással érlelt nehéz és könnyű láncokat állítottak elő és ezek K
_{ki értékek meghatározására használja SPR analízis (2. táblázat). Közül két könnyű lánc variánsok és két nehéz lánc variáns, 1A12 származó L-NNK mutatta a legnagyobb javulás (16-szeres). A kombináció a könnyű láncának 1A12 az optimalizált nehéz lánca klón 1B12 eredményezett 24-szeres javulást k katalógusa off feletti szülői hz1E11, míg a többi kombináció a K
off értékek hasonlóak voltak, vagy nagyobb, mint a 1A12. Mivel a 1,5-szeres további javulás által az L-1A12 + H-1B12 kombináció nem volt szignifikánsan nagy, klónok 1A12 és 1f11 (könnyű lánc variánsok) választottunk ki a további jellemzés, hogy minimalizálja a szekvencia különbség az affinitással érlelt antitest a szülői klón. A disszociációs állandók a affinitásfejlesztett klónok is meghatároztuk SPR analízis, volt több, mint 10-szer alacsonyabb, mint a szülői klón hz1E11 és összehasonlítható a trastuzumab (3. táblázat).}

Annak meghatározására, hogy affinitás -matured hz1E11 klónok kötődnek ugyanahhoz az epitóphoz, mint a szülői hz1E11, a kötelező a 1A12 és 1f11 a HER2-ECD amelyet előre kötődött hz1E11 analizáltuk SPR. Mindkét klón nem képes kötődni a monomer HER2-ECD-His fehérje által rögzített immobilizált 1E11 míg trastuzumab tudott (ábra 4C). Továbbá azt is megerősítette, hogy a 1A12 epitóp nincs átfedésben hogy a trastuzumab (ábra 4D). Klónok 1A12 és 1f11 is kötődnek al-domain IV mint a szülői klón hz1E11 (ábra 4E). Ezek az adatok azt mutatják, hogy epitópokat 1A12 és 1f11 nem változtak az affinitás érési folyamatot. Katalógusa

hatásossága affinitásfejlesztett hz1E11 klónok katalógusa

Az 1A12 és 1f11 antitesteket mutattak kismértékben emelkedett anti-proliferatív tevékenységek, mint a monoterápia képest hz1E11 a NCI-N87 és OE-19 gyomorrák sejtvonalak fokozott HER2-expressziót (5A és 5B), míg a kombinációs trasztuzumabbal a sejtburjánzást gátló tevékenységek jobb volt, hogy a trastuzumab egyedül egyenértékű hz1E11 trasztuzumabbal . Az anti-proliferatív aktivitásának 1A12 és 1f11 igazoltuk in vivo
NCI-N87 xenograft modellben. Superior tumorellenes aktivitás nyilvánvaló volt együtt trastuzumab e az egyes hatóanyagok önmagukban mind xenograftmodellekben (ábra 5C). Katalógusa

Vita katalógusa

Annak ellenére biztató klinikai eredményeket kaptunk a HER2 célzó antitest trastuzumab a kezelésére gyomorrák, még mindig vannak igényei hatásosabb HER2 célzott terápiák [6]. Kombinációja nem konkurens célzó ellenanyagok receptorokat, mint például a HER2, EGFR, és VEGFR3, növelheti az anti-tumor aktivitás preklinikai modellekben [11-13, 28]. Pertuzumab másik HER2-célzott antitest használata engedélyezett kombinálva trastuzumab a metasztatikus emlőrák [29]. Egy korábbi tanulmányban, kifejlesztettünk egy új HER2 célzó antitest, 1E11, amely bizonyította, hogy jelentős tumorellenes aktivitást, mint egyetlen szer, szinergikus hatás kombinálva trastuzumab in vitro katalógusa és in vivo
[22]. Az anti-tumor aktivitás a 1E11 plusz trasztuzumab kombináció kiváló nemcsak a trastuzumab egyetlen kezelést, hanem a kombinációja a pertuzumab és trastuzumab. Ebben a jelentésben a humanizálása és az azt követő affinitásérést az egér hibridóma eredetű 1E11 monoklonális antitest van leírva.

A kezdeti megközelítés a potenciális immunogenitás csökkentése a nem humán variábilis régiók CDR-átültetéses egy humán framework jelentősen csökkenti az immunogenitást terápiás ellenanyagok [15, 17]. Superhumanization felhasználásával humán csíravonal keretek templátként javasolták kiváló humanizálása módszertan elkerülése feltételezett effektor T-sejt-epitópjának szomatikus hypermuations humán keretre [30-32]. Azt javasolták, hogy az antitestek által kódolt csíravonal-génszegmens szerkezetileg rugalmas és képes befogadni kötődés számos különböző antigének [33-35]. A CDR-ek az egéreredetű ellenanyag 1E11, valamint egy maradékot a Vernier zónájában V _{H (Ala49 H) adtunk ojtott humán csíravonal variábilis és csatlakozott gének legnagyobb homológiát a szülői antitest (1. ábra). A kapott humanizált ellenanyag, hz1E11 mutatott közel azonos affinitást és biológiai aktivitást a szülői antitest (2. ábra).}

kiválasztása maradékanyagok randomizálás egy kritikus lépés a célzott randomizálás megközelítése affinitás érés, mert a gyakorlati korlátai az antitest könyvtár mérete és a szelekciós technológiákat. Alanin letapogatási és in silico
elemzés Az ellenanyag-szekvencia, különösen a CDR-ek, amelyek hasznosak kiválasztására randomizáció cél maradékok és megkönnyíti az affinitás érési folyamat. Az alanin pásztázó elemzése CDR-H3 hz1E11, a G98A mutáns teljesen elvesztette kötődési aktivitását és a G97A mutáns mutatott csökkent kötési aktivitás (3A ábra). Közvetlen módosítása lényeges paratópot maradékot általában azt eredményezi, a teljes veszteség a kötési képességét az antitest [26, 33, 36]. Ezért egy konzervatívabb megközelítést CDR-H3 randomizálást használtuk, vagy kézzel kevert oligonukleotid, amely elfogult a szülői szekvencia, vagy a két nns véletlen kodon szkennelése CDR-H3. Ahogy az várható volt a alanin pásztázó elemzés, szinte minden klónt hogy izoláljuk a CDR-H3 könyvtárak volt a szekvencia 97 _{H-100A H ugyanaz, mint a szülői klón (G 97HGTAS 100Ah) .}

alanin pásztázó eredmények azt sugallják, hogy az összes CDR-L3 maradékok nélkülözhető, bár néhány, a mutációk úgy tűnik, hogy csökkenti az affinitás (3B ábra). Ezért négy pozíció CDR-L3 (91 _{L-94 L) teljes mértékben véletlenszerűen az NKK degenerált kodon. A szekvencia analízis A kiválasztott klónok megerősítette az alanin pásztázó elemzés; a többség a kiválasztott klónt a CDR-L3 könyvtár már mind a négy randomizált CDR-L3 pozíciók változott a szülői maradékot, ellentétben a CDR-H3 optimalizálása eredményez, amely a legtöbb kiválasztott klónt a könyvtárak ugyanaz volt a szekvenciája, mint a szülői hz1E11 a középső része a CDR (1. táblázat). A klónok legtöbb affinitás javulást jött a CDR-L3 könyvtár. Valószínű, hogy a CDR-H3 hz1E11 már közel optimális, és a legtöbb mutációk, különösen a régió 97 H-100 H, vannak káros a kötési affinitás, míg a CDR-L3-szekvencia nem mint optimális és a mutáció ebben a régióban eredményezhet jelentős javulás az affinitás. Az L-NNK könyvtár panning kimenetek arra dúsított klónok egy hidrofób aminosav abban a pozícióban a 91 L, a kis aminosavat 92 L, és egy aromás aminosavat 93 L. Ez a minta kissé eltér a szülői CDR-L3 sorozata Q 89LQLYSTPWT 97L és ugyancsak arra utal, hogy a CDR-L3 szekvenciáját szülői 1E11 ellenanyag volt az optimálisnál, így volt hely affinitás javulást.}