PLoS ONE: affiniteitsrijping monoklonaal antilichaam 1E11 door Gerichte randomisatie in CDR3 regio optimaliseert therapeutisch antilichaam Targeting van HER2-positieve maagkanker

Samenvatting

anti-HER2-monoklonaal antilichaam 1E11 en heeft sterke synergistische antitumoractiviteit in-HER2 overexpressie maagkanker cellen bij gebruik in combinatie met trastuzumab. We momenteel geoptimaliseerd dit antilichaam voor geneesmiddelen voor menselijk gebruik. Ten eerste, de complementariteitsbepalende gebieden (CDR's) van het muizenantilichaam werden geënt op humane kiemlijn immunoglobuline variabele genen. Geen verschil in affiniteit en biologische activiteit werd waargenomen tussen chimère 1E11 (ch1E11) en gehumaniseerde 1E11 (hz1E11). Vervolgens affiniteit maturatie van hz1E11 werd uitgevoerd door randomisatie van CDR-L3 en H3 residuen gevolgd door strenge biopanning selectie. Milder selectiedruk het voordeel van de selectie van meer diverse klonen, terwijl hogere selectie stringente resulteerde in de convergentie van de panning output naar een kleiner aantal klonen met verbeterde affiniteit. Kloon 1A12 had vier aminozuursubstituties in CDR-L3, en toonde een 10-voudige verhoging in affiniteit in vergelijking met de parentale kloon en verhoogde potentie per
in vitro antiproliferatieve activiteit test met HER2 overepxressing maagkanker cellen. Kloon 1A12 remde tumorgroei van NCI-N87 xenograft model met gelijke werkzaamheid alleen trastuzumab, en de combinatiebehandeling van 1A12 en trastuzumab volledig verwijderd gevestigde tumoren. Deze resultaten suggereren dat gehumaniseerde en affiniteitsgerijpte monoklonaal antilichaam 1A12 is een geoptimaliseerde molecule voor toekomstige therapeutische ontwikkeling tegen HER2-positieve tumoren

Citation:. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et al. (2015) Affiniteit rijping van monoklonaal antilichaam 1E11 door Gerichte randomisatie in CDR3 regio optimaliseert therapeutisch antilichaam Targeting van HER2-positieve maagkanker. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10.1371 /journal.pone.0134600

Uitgever: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 14 april 2015; Aanvaard: 12 juli 2015; Gepubliceerd: 30 juli 2015

Copyright: © 2015 Ko et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door AbClon Inc., en door de National Research Foundation Korea (NRF) subsidie ​​aan HS voor geneesmiddelen Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) . De commerciële financier (AbClon Inc.) steun verleend in de vorm van salarissen voor auteurs (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK en JSL), maar vond geen verdere rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en analyse niet, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript. De specifieke rol van deze auteurs worden verwoord in de sectie 'auteur bijdragen'

Competing belangen:. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK en JSL zijn allemaal in dienst van AbClon Inc. en eigenaar is haar voorraad. HS is betaald consultancy tot AbClon Inc. en is ook eigenaar van zijn voorraad. Abclon is het nastreven van patenten en productontwikkeling op de verbindingen die in dit document worden genoemd. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK en JSL zijn alle op dit moment in dienst van de commerciële financier van dit onderzoek AbClon Inc. en kunnen zijn voorraad bezitten. HS is momenteel op betaald consultancy tot AbClon Inc. en is ook eigenaar van zijn voorraad. AbClon een geregistreerd octrooi in Korea (KR10-1453462, antilichamen specifiek kunnen binden aan HER2) en diende een PCT aanvrage (PCT /KR2014 /004.317, antilichaam specifiek bindt aan HER2) waarin BKK, YHL, ISH, KTK en JSL worden vermeld als uitvinders. AbClon is ook bezig met productontwikkeling op het gehumaniseerde, affiniteit-gerijpte antilichamen die in dit artikel worden genoemd. Deze niet naleven van de auteurs om alle PLoS ONE beleid te veranderen op het delen van gegevens en materialen.

Introductie

monoklonale antilichamen zijn reguliere behandelingen in de oncologie en auto-immuunziekten, en zullen naar verwachting een belangrijke rol spelen in de toekomst van ziekte behandeling [1, 2]. Meer dan 30 recombinante antilichamen worden momenteel goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration, waarvan ongeveer de helft van zijn anti-kanker antilichamen. Maagkanker is een van de meest voorkomende vormen van kanker en is de derde belangrijke oorzaak van kanker overlijden wereldwijd [3]. Bij maagkanker, overexpressie van epidermale groeifactor receptor (EGFR), humane epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) en HER3 is gecorreleerd met een slechte prognose [4, 5]. Onlangs heeft de HER2 gericht monoklonaal antilichaam trastuzumab werd goedgekeurd voor de behandeling van HER2-positieve gemetastaseerde maag- en gastro-oesofageale overgang van kanker op basis van de resultaten van de Trastuzumab met chemotherapie bij HER2-positieve gevorderde maagkanker (ToGA) klinisch onderzoek [6].

Bepaalde combinaties van onderling niet-competitieve antilichamen gericht op dezelfde receptor toename van anti-tumor activiteit in vitro Kopen en in vivo
. Combinatie van het HER2 gericht antilichamen, trastuzumab en pertuzumab, toont verhoogde werkzaamheid in HER2-overexpressie borstkanker [7]. De voordelen van de pertuzumab en trastuzumab is verder aangetoond in preklinische en klinische studies [8, 9]. Andere-HER2 antilichamen gericht toont betere werkzaamheid in combinatie dan als enkele agenten en hebben consistente down-regulatie van HER2 niveaus en heilzame combinatie-effecten in muismodellen [10] getoond. De verhoogde effectiviteit van antistofcombinaties is eveneens aangetoond met EGFR gericht antilichamen [11, 12] en vasculaire endotheliale groeifactor receptor 3 (VEGFR3) -targeting antilichamen [13].

Therapeutische antilichamen kenmerkend uitgebreid ontwikkeld om bezitten gewenste biologische en fysisch-chemische eigenschappen, zoals lage immunogeniciteit, hoge affiniteit en specificiteit, optimale effectorfuncties en goede oplosbaarheid en stabiliteit [14]. Vooral antilichaam humanisering en affiniteit maturatie zijn twee van de meest toegepaste technische processen tijdens de ontwikkeling van therapeutische antilichamen kandidaten. Immunogeniciteit van therapeutische antilichamen beperkt de klinische bruikbaarheid en effectiviteit bij de productie van anti-drug antilichamen [15], en de humanisering van antilichamen van muizen of andere species is nu een standaardprocedure voor de ontwikkeling van therapeutische antilichamen. Enkele humanisering werkwijzen ontwikkeld die ofwel rationele en empirische benadering [16] te gebruiken. De complementariteit-bepalend gebied (CDR) enten benadering als methode om de humane anti-chimere antilichaam (HACA) respons [17] te overwinnen is een gevestigde methode humanisering. Echter, directe enting van muriene CDR's naar een humaan raamwerk acceptorsequentie leidt vaak tot een verlies van affiniteit, zodat back-mutaties van residuen raamwerkgebied (Vernier zone resten) ondersteunende structuur van de CDR-lussen vaak noodzakelijk [18]. Voor In vitro
affiniteit rijping, drie diversificatie benaderingen worden doorgaans gebruikt: willekeurige mutagenese door bijv. fouten gevoelige PCR, randomisatie gerichte residuen behulp van gedegenereerde oligonucleotiden en herverdeling van ketens. In de doelgerichte randomisatie benadering CDRs zijn de loze doel voor randomisatie meestal vanwege somatische hypermutatie geëvolueerd mutaties begunstigen in CDR's van antilichamen [19], en CDR-H3 en CDR-L3 neiging om de antilichaam-antigen interacties [domineren ,,,0],20]. Een van de belangrijkste problemen bij de beoogde randomisatie is het selecteren van de posities die niet essentieel zijn voor de antigeenbinding, maar die de affiniteit te verbeteren wanneer optimale substitutie van aminozuur wordt gemaakt. Alanine-scanning kan helpen bij het bepalen van de residuen willekeurig, vooral wanneer CDR's zijn lang. Soms alanine mutatie zelf verhoogt de affiniteit van antilichamen [21].

We eerder ontwikkelde een muizenantilichaam gericht HER2 (kloon 1E11) dat synergistische antitumor activiteit in combinatie met trastuzumab in HER2 overexpressie maagkanker cellijnen [22 toont ]. In dit rapport beschrijven we hoe we geoptimaliseerd de 1E11 voor een therapeutische antilichamen door CDR enten voor de menselijke kiemlijn immunoglobuline variabele genen en affiniteit rijping door gerichte randomisatie van CDR-H3 en CDR-L3. De geoptimaliseerde 1E11 antilichaam (kloon 1A12) toont synergetische antitumor activiteit in HER2-positieve maagkanker xenograft modellen in combinatie met trastuzumab. Waargenomen werd dat de kloon 1E11, kiembaan variabele genen zijn geschikt acceptoren voor humanisering zonder affiniteit vermindering, en de vervanging van CDR-L3 residuen die niet essentieel zijn voor antigeenbinding was genoeg om de affiniteit met meer dan 10-voudig verbeterd.

materialen en Werkwijzen

Cellijnen en materialen

NCI-N87-cellen werden gekocht bij American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) en OE-19 cellen werden verkregen van de Europese Collection of Cell Culture (ECACC, Porton down UK). Het celkweekmedium was RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica en cellen werden gekweekt bij 37 ° C onder 5% CO _{2. Trastuzumab en palivizumab werd geproduceerd door Genentech (South San Francisco, CA, USA) en MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA), respectievelijk. ChromPure humaan IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) werd gebruikt als controle humaan IgG antilichaam voor
in vitro assays. IgG-antilichamen werden geproduceerd met het vrije slag 293 systeem (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en gezuiverd met proteïne-A affiniteitschromatografie (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Endotoxine werd verwijderd met een endotoxine Removal Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA) en endotoxine werden bepaald onder toepassing van een endotoxine Detection Kit (GenScript). Recombinante eiwitten werden geproduceerd als uitgescheiden eiwitten met het Freestyle 293 systeem gezuiverd met proteïne-A of Ni-NTA chromatografie (Qiagen, Valencia, CA, USA) voor Fc-gelabelde of His-gemerkte eiwitten, respectievelijk.}

alanine-scanning mutagenese en Fab zuivering

Plaatsgerichte mutagenese van alanine scanning werd uitgevoerd door PCR mutagenese met behulp QuickChange Site-Directed mutagenese Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Mutant Fab eiwitten werden tot expressie gebracht en gezuiverd tot het belang van elke rest voor antigeenbindingsactiviteit evalueren. Kortom, Escherichia coli
DH5a cellen getransformeerd met de vector die pComb3X Fab mutante genen werden bij 28 ° C in SB bouillon. Expressie werd geïnduceerd met 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 1 wanneer de optische dichtheid (600 nm) van de kweek bereikte 0,8. Celpellets werden geresuspendeerd in gekoeld extractiebuffer (120 mM Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA en 300 mM sucrose) en geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten periplasmatische extractie. Magnesiumchloride (2,5 mM) werd aan het geklaarde extract toegevoegd na centrifugatie vrij EDTA voorafgaand aan geïmmobiliseerd metaalion affiniteitschromatografie (IMAC) zuivering vangen. Gezuiverde Fab eiwitten werden gebruikt voor ELISA bindingsassay en k
_{off analyse met behulp van surface plasmon resonance (SPR).}

Affiniteit maturatie

Het vermenselijkte 1E11 gekloond in pComb3X vector Fab formaat werd gebruikt als matrijs voor overlappende verlenging polymerasekettingreactie (PCR) mutagenese zoals eerder beschreven [23]. De gedegenereerde oligonucleotiden (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(omgekeerde) en 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Forward) werden gebruikt voor L-NNK en H-XXS bibliotheek, respectievelijk. Geeft N A, C, G of T; M C of A; en S G of C. genummerde baseposities geven hand gemengde nucleotiden bestaande uit 70% van een base en 10% elk van de andere drie basen: 70% frequentie base G, A, T, C en gedurende 1, 2, 3 en 4, respectievelijk. Voor de H-2AA bibliotheek, een equimolair mengsel van de volgende voorwaartse mutagene oligonucleotiden werden gebruikt: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 'en 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K geeft G of T. Na twee overlappende extensie PCR, Fab bibliotheek DNA met een gerandomiseerd CDR werd geknipt met SfiI, geligeerd in de Sfil gedigereerde faagmide vector pComb3X en geëlektroporeerd in E
.
coli stam ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

Hoge affiniteit binders werden geselecteerd met oplosbare gebiotinyleerde HER2 ECD-eiwit. Bead bindmiddelen werden vooraf uitgeput door het incuberen van de antilichaamsfaagbank met 100 ul van pre-geblokkeerde Dynabeads M-280 Streptavidin (Invitrogen) gedurende 1 uur onder langzame rotatie bij kamertemperatuur. Gebiotinyleerd HER2 ECD-eiwit (100 NM- 12:01) werd de pre-verarmde antilichaambibliotheek toegevoegd en gedurende 1 uur onder rotatie bij kamertemperatuur. Vervolgens werd 50 ul van geblokkeerde streptavidine-magnetische parels werden toegevoegd en geïncubeerd op de rotator gedurende 15 minuten. Parels werden 10 maal gewassen met 1 ml Tris-gebufferde zoutoplossing Tween-20 (TBST) en tweemaal met 1 ml PBS. Gebonden fagen werden geëlueerd door incubatie van de korrels met 1 ml 100 mM triethylamine gedurende 8 minuten en geneutraliseerd met 0,5 ml 1 M Tris, pH 7,4.

bindende ELISA activiteitstest

Antilichamen werden toegevoegd naar Costar 96-well half area platen (Corning, Corning, NY, USA productnummer 3690) gecoat met 1 ug /ml van het antigeen. Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 1 uur werden de platen driemaal gewassen met TBST en geïncubeerd met konijn anti-humaan antilichaam-mierikswortelperoxidase (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) voor IgG-antilichamen en rat anti-HA-HRP (Clone F10, Roche Life Science, Basel, Zwitserland) voor Fab antilichamen, respectievelijk. De platen werden driemaal gewassen, tetramethylbenzidine (TMB) peroxidasesubstraat (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) werd toegevoegd en de reacties werden gestopt door toevoegen van 1 N zwavelzuur (Duksan Ansan, Korea). De absorptie bij 450 nm werd gemeten met een Victor X3 instrument (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Surface plasmon resonance analyse

Voor k
_{off analyse Fab eiwitten, HER2-ECD His-eiwit geïmmobiliseerd op het oppervlak van een CM5 sensorchip (GE Healthcare) met de amine koppelingswerkwijze ongeveer 2000 respons eenheden (RU). Gezuiverde Fab eiwitten werden geïnjecteerd met 2 ug /ml concentratie en een stroomsnelheid van 50 pl /minuut. Voor k
off analyse van IgG-antilichamen, geiten anti-humaan IgG (γ) (Invitrogen, Cat. No. H10500) werd geïmmobiliseerd op de CM5 sensorchip via aminekoppeling, en antilichamen werden gevangen bij 1 ug /ml gedurende 4 minuten en gestabiliseerd 5 minuten bij een stroomsnelheid van 50 pl /minuut. HER2-ECD His-eiwit werd geïnjecteerd in een concentratie van 160 nM. Voor affiniteitsmetingen werd gevangen antilichamen bij ongeveer 50 RU door geiten anti-humaan IgG (γ) geïmmobiliseerd op een CM5 chip. HER2-ECD His-eiwit werd geïnjecteerd in concentraties variërend 0-640 nM. Sensorgrammen werden bepaald bij elke concentratie en geëvalueerd met behulp van de BIAevaluation software. Voor epitoop binning, IgG vorm van hz1E11 werd geïmmobiliseerd op separate CM5 sensorchip oppervlakken op ongeveer 1.000 reactie-eenheden. HER2-ECD-His (320 nM) en antilichamen (1 pg /ml) werden achtereenvolgens toegevoegd 4 minuten gestabiliseerd 5 minuten bij een stroomsnelheid van 50 pl /minuut.}

Cellevensvatbaarheid assay

de cellen werden gezaaid in 96-well platen (Corning) in 10% FBS bevattend medium en voorgekweekt gedurende 24 uur. De cellen werden behandeld met antilichamen in de aangegeven concentraties en cultuur gedurende 4 dagen. WST-1-reagens (Dogen EZ-Cytox; Daeil Lab Dienst, Seoul, Korea) werd gebruikt om de levensvatbaarheid van de cellen te meten. Relatieve levensvatbaarheid werd berekend door de absorptie van elke put te delen door de gemiddelde absorptie van PBS-behandelde putjes in elke plaat.

xenograft studie

Athymische naakt vrouwtjesmuizen (Daehan Biolink, Chungbuk, Korea ) werden subcutaan geïnjecteerd in de linker flank met 5 x 10 ^{6 NCI-N87 cellen in Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Men liet de tumoren groeien tot ongeveer 200 mm 3 groot en muizen werden vervolgens gerandomiseerd in groepen. Dieren kregen intraperitoneale toediening van antilichamen bij de aangegeven doses tweemaal per week. Tumorvolumes werden berekend met de formule (L x B x W) /2, waarbij L de grootste diameter tumor en W de kleinste diameter tumor. Twee-weg herhaalde metingen ANOVA gevolgd door Bonferroni na de test werd uitgevoerd voor de statistische analyse van de tumor growth.All dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het NIH de "Gids voor de zorg en het gebruik van dieren" en een goedgekeurd protocol ontvangen door het bedrijf de instelling Animal Care en gebruik Comite.}

Resultaten

Humanisering van 1E11 uitgevoerd door CDR-enten voor de menselijke kiembaan genen

om het gehumaniseerde antilichaam, de VH en VL ontwikkelen sequenties van de murine 1E11 werden vergeleken met humane kiemlijn V en J-gen repertoires behulp IMGT /V-Quest analyse instrumenten [24]. Voor de zware keten IGHV3-48 * 03 * 01 en IGHJ4 vertoonde de hoogste homologie met het 1E11 tegenhangers delen 85% en 87% identiteit, respectievelijk. Voor de lichte keten, die wordt weergegeven menselijk IGKV1-39 * 01 en IGKJ1 * 01 genen identiteit van 80% en 81%, respectievelijk. Deze menselijke genen werden geselecteerd als acceptor sequenties voor het enten van de murine CDR's. Van de Vernier zone, bestaande uit resten in het skeletgebied die zijn betrokken bij de presentatie van de CDR-structuren door ondersteuning van de CDR-lussen [18, 25], maar één rest op positie 49 _{H uit zware keten verschillen tussen muizen en humane sequenties. Derhalve gehumaniseerde 1E11, hz1E11, slechts één murine resten in de raamwerkgebieden (figuur 1).}

bindingsactiviteit van hz1E11 extracellulaire gebied (ECD) van HER2 gelijkwaardig aan die van ch1E11 (figuur 2A) was, en de affiniteit van trastuzumab, ch1E11 en hz1E11 was 3 nM, 23 nM en 23 nM. We hebben ook bevestigd dat hz1E11 gebonden aan sub-domein IV, zoals de ouderlijke ch1E11. Trastuzumab bindt ook aan subdomein IV [26]. De In vitro
antiproliferatieve activiteiten van hz1E11 als monotherapie en in combinatie met trastuzumab waren ook gelijkwaardig aan die van ch1E11 (figuur 2C). In de vorige studie [22] werd gemeld dat ch1E11 had In vivo
antitumor activiteit vergelijkbaar met die van trastuzumab als een agent, en de combinatie van ch1E11 en trastuzumab resulteerde in de tumor regressie-index (TGI) van 95,1%. Ook hz1E11 als een agent had soortgelijke In vivo
antitumoractiviteit voor trastuzumab (S1 FIG) en de combinatie van hz1E11 met trastuzumab toonde ook dosis-afhankelijke anti-tumor activiteit in de NCI-N87 xenograft muismodel ( figuur 2D). Antilichaam combinatiebehandeling bij 1 mg /kg elke hz1E11 en trastuzumab resulteerde in soortgelijke antitumoractiviteit met trastuzumab enkele behandeling bij 10 mg /kg, en bij de 2,5 mg /kg bedraagt ​​en boven de vastgestelde tumor gestabiliseerd en begon achteruit (geen statistisch significant verschil [ P
< 0,05] werd waargenomen bij 2,5, 5 en 10 mg /kg combinaties). Deze resultaten tonen dat hz1E11 heeft de affiniteit en biologische overeenstemmende activiteit ch1E11 en dat hz1E11 verbetert de antitumoractiviteit van trastuzumab bij gebruik in combinatie.

Alanine scanning van CDR-H3 en CDR-L3

de kritische residuen voor antigeen-antilichaam interacties te identificeren, werd alanine scanning mutagenese in CDR3 gebieden van zware en lichte ketens (CDR-H3 en CDR-L3) uitgevoerd. De effecten van de mutaties werd bepaald door het analyseren van de bindingsactiviteit van gezuiverd Fab eiwitten door indirecte ELISA. CDR-H3, alanine substitutie op positie Gly98 _{H schafte de binding van Fab aan HER2 en G97 HA en T99 HA mutanten vertoonden verminderde bindingsactiviteit (Figuur 3A). CDR-L3, de alanine substituties hadden veel kleiner effect (Figuur 3B). De k
off waarden van alanine scanning mutanten werden geanalyseerd met behulp van SPR tegen immbolized HER2-ECD-eiwit. We hebben bevestigd dat de zware keten G98A mutant volledig verloren binding activiteiten, en de naburige T99 HA en G97 HA mutanten resulteerde in 32-voudig en 17-voudig verhoogd k
off-waarden respectievelijk (figuur 3C). Deze resultaten geven aan dat de zware keten Gly98 H functioneel kritisch en de aangrenzende residuen zijn ook functioneel belang voor antigeen-antilichaam interacties.}

affiniteit maturatie van hz1E11

affiniteit maturatie van hz1E11 uitgevoerd door de constructie van zware of lichte keten CDR3 variant bibliotheken, gevolgd door het evenwicht selectie van de faag antilichaam bibliotheken. Voor de lichte keten, glutamine residuen op posities 89 _{L en 90 L waren niet gediversifieerd omdat glutamine vaak wordt gevonden op deze posities van negen aminozuur-longCDR-L3 sequenties op 59% en 73% frequenties van respectievelijk [ ,,,0],27]. Posities 91 L-94 L werden gerandomiseerd met behulp van een NNK gedegenereerde codon (L-NNK). Voor de zware keten, posities 95 H -100a H werden gerandomiseerd met een XXS codon (H-XXS), zodanig ontworpen dat de eerste en tweede nucleotideposities gediversifieerde codon wildtype base optraden met 70 % kans, elk van de andere drie basen trad op bij 10% frequentie en de derde letter van de codons werden gesynthetiseerd onder toepassing van een equimolair mengsel van G en C (figuur 4A). Hoge affiniteit binders geselecteerd uit hoog-stringente of lage stringentie panning (tabel 1).}

Ten opzichte van de lage-stringentie panning van de L-NNK-bibliotheek waarin 100% van de tweede, derde, en vierde ronde uitgang klonen gescreend waren ELISA positief voor de hoge-stringentie panning de vierde ronde uitgang leverde geen bindmiddel helemaal, en slechts een derde van de derde ronde uitgang ELISA klonen positief (Tabel 1). De gekozen klonen uit de CDR-L3 bibliotheek omvatte vele sequenties die had vier gerandomiseerde CDR-L3 posities gemuteerd tegenstelling CDR-H3 bibliotheken waaruit het merendeel van de geselecteerde klonen behield de wildtype sequentie op posities 97 _{H -100 H (zie hieronder). Verschillende panning strategieën leverde andere volgorde verrijking patronen. Bijvoorbeeld, de lichte keten variant kloon 1A12 (Q 89LQNAYAPWT 97L) werd geïsoleerd uit de hoge-stringentie panning maar niet van de lage-stringentie panning en de zware keten variant kloon 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) werd ook alleen geselecteerd uit de high-stringente panning. Interessant is dat 59% van unieke antilichamen in 4 ^{e output met lage stringentie panning van L-NNK-bibliotheek had een alanine op positie 92 L, overeenkomstig alanine scanning analyse (Figuur 4B).}}

Bijna alle klonen die werden geïsoleerd uit de H-XXS bibliotheek hadden dezelfde sequentie op 97 _{H -100 H als de parentale kloon, en vertoonden een duidelijke verrijking van Asn-Tyr sequentie bij 95-96. Om de bijdrage van de CDR-H3 resten verder te beoordelen op antigeen-antilichaambinding werd een aanvullende CDR-H3 bibliotheek geconstrueerd met twee willekeurige codon NNK doorzoeken van CDR-H3 (H-2AA, figuur 4A). In laag-stringente panning, mutanten op posities 95 H, 96 H, 99 H, 100 H, en 100 A H werden geselecteerd in de eerste ronde panning, maar alleen mutanten op posities 95 H en 96 H werden verrijkt in de vierde ronde uitgang (tabel 1). We konden niet de mutanten te detecteren op de posities Gly97 H en Gly98 H in elke panning strategieën en uitgangen.}

Affiniteit en bindende activiteit van geselecteerde klonen

Om de combinatie effect te beoordelen van de affiniteit gerijpte zware en lichte keten varianten IgG antilichamen met combinaties van affiniteit-gerijpte zware en lichte ketens werden geproduceerd en hun k
_{off-waarden te bepalen volgens SPR-analyse (Tabel 2). Onder de twee lichte keten varianten en twee zware keten varianten, 1A12 afgeleid van L-NNK toonde de grootste verbetering (16-voudig). De combinatie van de lichte keten van 1A12 met de geoptimaliseerde zware keten van de kloon 1B12 resulteerde in een 24-voudige verbetering in k
uit over de ouderlijke hz1E11, terwijl voor de andere combinaties van de k
off-waarden waren vergelijkbaar met of groter dan die van 1A12. Omdat het 1,5-voudige extra verbetering van het L-1A12 + H-1B12 combinatie niet significant groot, klonen 1A12 en 1F11 (lichte keten varianten) werden gekozen voor verdere karakterisering het verschil in sequentie van de affiniteit-gerijpte antilichamen uit de ouderlijke minimaliseren kloon. De dissociatieconstanten voor de affiniteit gerijpte klonen, ook bepaald door SPR analyse werden meer dan 10-voudig lager dan die van de ouderlijke kloon hz1E11 en vergelijkbaar met die van trastuzumab (tabel 3).}

Om te bepalen of affiniteit -matured hz1E11 klonen binden aan hetzelfde epitoop als het ouderlijke hz1E11 de binding van 1A12 en 1F11 de HER2-ECD dat werd vooraf gebonden aan hz1E11 werd geanalyseerd door SPR. Beide klonen waren niet in staat om te binden aan de monomere HER2-ECD-His eiwit gevangen genomen door geïmmobiliseerd 1E11 terwijl trastuzumab kon (Fig 4C). Bovendien werd bevestigd dat de 1A12 epitoop niet overlapt met die van trastuzumab (figuur 4D). Klonen 1A12 en 1F11 ook binden aan subdomein IV als hun ouderlijke kloon hz1E11 (figuur 4E). Deze gegevens aan dat epitopen van 1A12 en 1F11 werden niet gewijzigd door de affiniteit rijpingsproces.

Werkzaamheid van met affiniteit gerijpte klonen hz1E11

Zowel 1A12 en 1F11 antilichamen vertoonden licht verhoogde antiproliferatieve activiteiten als monotherapie vergeleken hz1E11 op NCI-N87 en OE-19 maagkanker cellijnen die HER2 (figuur 5A en 5B) overexpressie, terwijl in combinatie met trastuzumab, hun antiproliferatieve activiteiten was superieur aan dat trastuzumab staan ​​gelijk aan hz1E11 plus trastuzumab . De anti-proliferatieve activiteit van 1A12 en 1F11 werd bevestigd In vivo
in NCI-N87 xenograft model. Superior antitumoractiviteit was duidelijk in combinatie met trastuzumab is aan die van elke agent alleen in beide xenograft modellen (figuur 5C).

Discussie

Ondanks bemoedigende klinische resultaten verkregen met het HER2 gericht antilichaam trastuzumab in de behandeling van maagkanker, er nog steeds behoefte aan krachtiger HER2 gerichte therapieën [6]. Combinatie van niet-concurrerende antilichamen gericht receptoren, zoals HER2, EGFR en VEGFR3 kunnen antitumoractiviteit in preklinische modellen [11-13, 28] te verhogen. Pertuzumab, een targeting-HER2 antilichaam, is goedgekeurd voor gebruik in combinatie met trastuzumab bij de behandeling van metastatische borstkanker [29]. In een eerdere studie, ontwikkelden we een nieuwe HER2 gericht antilichaam, 1E11, waarbij werd aangetoond significante anti-tumor activiteit als een agent en synergetisch effect in combinatie met trastuzumab In vitro Kopen en In vivo
[22]. De antitumoractiviteit van de 1E11 plus trastuzumab superieur niet alleen trastuzumab enkele behandeling, maar ook voor de combinatie van pertuzumab en trastuzumab. In dit rapport wordt de vermenselijking en daaropvolgende affiniteitsrijping van de muis hybridoma verkregen monoklonale antilichaam 1E11 beschreven.

Initiële benaderingen voor potentiële immunogeniciteit van niet-menselijke variabele gebieden verminderen door CDR-enten in een menselijk raamwerk significante daling van de immunogeniciteit therapeutische antilichamen [15, 17]. Superhumanization waarbij menselijke kiemlijn roosters als template is voorgesteld als een superieure vermenselijking methode om vermeende effector T-celepitopen afgeleid door somatische hypermuations van humane skelet [30-32] vermijden. Er is gesuggereerd dat antilichamen gecodeerd door kiemlijn gensegmenten structureel flexibel en in staat binding aan te passen aan verschillende antigenen [33-35]. De CDR's van murine antilichaam 1E11 als één rest in de Vernier zone V _{H (Ala49 H) werden geënt op het humane kiembaan variabele en verbinden genen met de hoogste homologie met het ouderlijke antilichaam (figuur 1). Het resulterende gehumaniseerde antilichaam hz1E11 vertoonde vrijwel identieke affiniteit en biologische activiteit van de ouderlijke antilichaam (figuur 2).}

Selectie van residuen voor randomisatie is een kritische stap in doelgerichte randomisatie benadering affiniteitrijping vanwege de praktische beperkingen antilichaam omvang bibliotheek en selectietechnieken. Alaninescanning en
in silico analyse van het antilichaam sequentie, vooral in CDR's zijn bruikbaar voor het selecteren van de randomisatie doelresiduen en vergemakkelijken de affiniteit rijpingsproces. In alanine scanning analyse van CDR-H3 van hz1E11, het G98A mutant volledig verloren bindende activiteit en het G97A mutant vertoonden verminderde bindende activiteit (figuur 3A). Directe wijziging van wezenlijke paratoop residu resulteert gewoonlijk in het totale verlies van bindingsvermogen van het antilichaam [26, 33, 36]. Daarom is een meer conservatieve benadering van CDR-H3 randomisatie werd gebruikt, met behulp van een hand-gemengde oligonucleotide dat is beïnvloed naar de ouderlijke sequentie, of de dubbele NNS willekeurige codon scannen van CDR-H3. Zoals verwacht van de alanine scanning analyse bijna alle klonen die werden geïsoleerd uit de CDR-H3 bibliotheken had de sequentie 97 _{H-100a H hetzelfde als de parentale kloon (G 97HGTAS 100 Ah) .}

de alaninescanning resultaten suggereren dat alle CDR-L3 resten overbodig, hoewel sommige van de mutaties lijkt de affiniteit (figuur 3B) verlagen. Daarom werden vier posities van CDR-L3 (91 _{L-94 L) volledig gerandomiseerd met de gedegenereerde codon NNK. De sequentieanalyse van het geselecteerde klonen bevestigde de alanine scanning analyse; de meeste van de geselecteerde klonen van de CDR-L3 bibliotheek had vier gerandomiseerde CDR-L3 van positie van de ouderlijke residu, anders dan de CDR-H3 optimalisatie resulteert waarin de meeste van de geselecteerde klonen uit de bibliotheek hadden dezelfde sequentie als ouderlijke hz1E11 in het middendeel van de CDR (tabel 1). De klonen met de meeste verbetering affiniteit kwam van de CDR-L3 bibliotheek. Het is waarschijnlijk dat de CDR-H3 van hz1E11 reeds buurt van de optimale meeste mutaties, met name in het gebied 97 H-100 H, zijn nadelig voor de bindingsaffiniteit, terwijl de CDR-L3 sequentie niet zo optimaal en de mutatie in dit gebied kan leiden tot een aanzienlijke verbetering van de affiniteit. De L-NNK-bibliotheek uitgangen panning verrijkt met klonen met een hydrofoob aminozuur op positie 91 L, een klein aminozuur op 92 L, en een aromatisch aminozuur op 93 L. Dit patroon verschilt enigszins van de ouderlijke CDR-L3 sequentie van Q 89LQLYSTPWT 97L weer suggereert dat de CDR-L3 sequentie van het ouderlijke 1E11 antilichaam suboptimaal en had dus ruimte voor affiniteit verbeteren.}