PLOS NËMMEN: Affinitéit Maturation vun Monoclonal Antibody 1E11 duerch geziilte Randomization zu CDR3 Regiounen Optimizes therapeutesch Antibody Reklamme vun HER2-Positiv Gastric Cancer

Wat VerfÜgung

Anti-HER2 murine monoclonal antibody 1E11 huet staark an synergistic anti-entholl Aktivitéit zu HER2-overexpressing Zellen gastric Kriibs wann a Kombinatioun mat Stad benotzt. Mir weideres dëser antibody fir Mënscherechter therapeutics optimiséiert. Éischt, déi complementarity Bestëmmung Regiounen (CDRs) vun der murine antibody sech op Mënscherechter germline immunoglobulin Variabel Genen näischt Bäigeprafftes. Keen Ënnerscheed zu Affinitéit a biologescher Aktivitéit war tëscht chimeric 1E11 (ch1E11) an humanized 1E11 (hz1E11) observéiert. Next, Affinitéit maturation vun hz1E11 war vun der randomization vun CDR-L3 an H3 Reschter gefollegt vun streng biopanning Auswiel gesuergt. Milder Auswiel Drock ëmfonnt der Auswiel vun méi verschiddenste clones hierkommen héich Auswiel stringency vun der Konvergenz vun der panning Wasserstoff fir eng kleng Zuel vun clones mat verbessert Affinitéit duerchgesat. Klon 1A12 no véier Aminosaier Auswiesselungen an CDR-L3, a weisen eng 10-fantastesch Erhéijung vun Affinitéit am Verglach zu den Elteren Klon a fräi as vun enger kënschtlech VerfÜgung anti-proliferative Aktivitéit assay mat HER2-overepxressing gastric Kriibs Zellen. Klon 1A12 inhibited entholl Wuesstem vun NCI-N87 xenograft Modell mat ähnlechen Efficacitéit ze Stad gehalen, an der Kombinatioun Behandlung vun 1A12 an Stad acquis erhéijen komplett geläscht. Dës Resultater hindeit, datt humanized a Bezuch jiddfereen monoclonal antibody 1A12 ass eng absolut optimiséiert Protein fir Zukunft therapeutesch Entwécklung géint HER2-positiv erhéijen VerfÜgung

Fro:. Ko BK, Choi S, CUI LG, Lee YH, Hwang ASS, Kim KT, et al. (2015) Affinitéit Maturation vun Monoclonal Antibody 1E11 duerch geziilte Randomization zu CDR3 Regiounen Optimizes therapeutesch Antibody Reklamme vun HER2-Positiv Gastric Cancer. PLoS NËMMEN 10 (7): e0134600. Doi: 10.1371 /journal.pone.0134600 VerfÜgung

Redakter: Mitchell Ho, National Cancer Institut, NIH, USA VerfÜgung

Arnaque: 14. Abrëll 2015; Akzeptéiert: 12 Juli, 2015; Publizéiert: 30. Juli 2015 zu

Copyright: © 2015 Ko et al. Dëst ass eng oppen Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz CC BY verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt si vum original Auteur an d'Quell Kaiser VerfÜgung

Data Disponibilitéit: All Daten sinn bannent de Pabeier a seng Ennerstëtzung Informatiounen Fichieren VerfÜgung

Funding:. Dës Etude vun AbClon Galaxy, an déi National Research Foundation vun Korea (NRF) Zouschoss ze t fir Medikamenter Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) ënnerstëtzt gouf . Déi kommerziell funder (AbClon Galaxy) gëtt Ënnerstëtzung an der Form vun de Salairen fir Auteuren (BKK, SC, LGC, YHL, nemen, KTK, an JSL) mee hat keng zousätzlech Roll an der Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun ze publizéieren, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft. Déi spezifesch Roll vun dësen Auteuren sinn am "Auteur Contributiounen 'Sektioun bezéie VerfÜgung

Wettsträit Interessen:. BKK, SC, LGC, YHL, nemen, KTK, an JSL sinn all déi AbClon Galaxy Employé an hir kënne selwer opfëllen. T ass op bezuelt Consultancy zu AbClon Galaxy a gehéiert och seng Bourse. Abclon ass Verfollegung Patenter an Produit Entwécklung wollt awer, datt an dësem Pabeier ugeschwat ginn. BKK, SC, LGC, YHL, nemen, KTK, an JSL si all Moment vun der kommerziell funder vun dëser Fuerschung AbClon Galaxy geschafft a kann seng Bourse eegenen. T ass am Moment op Consultancy zu AbClon Galaxy bezuelt a gehéiert och seng Bourse. AbClon huet e ugemellt Brevet zu Korea (KR10-1453462, Antibodies kapabel bindend Speziell un HER2) an Diffamatioun engem PCT Applikatioun (PCT /KR2014 /004317, Antibody speziell verbindlech bis HER2) an déi BKK, YHL, nemen, KTK, an JSL sinn als inventors opgezielt. AbClon ass Verfollegung och Produit Entwécklung op der humanized, Affinitéit-jiddfereen antibodies datt an dësem Pabeier ugeschwat ginn. Dës do ofzeänneren net de onvergläichleche 'Auteuren op all PLOS NËMMEN Politiken op sharing Daten a Material. VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Monoclonal antibodies sinn Mainstream Behandlungen an Zukunft an autoimmune Krankheeten, a si erwaarden wichteg Roll spillen vun der Zukunft vun Krankheet Behandlung [1, 2]. Méi wéi 30 recombinant antibodies sinn am Moment vun der USA Food a Cargolux Administration, vun deem ronn d'Halschent sinn Anti-Kriibs antibodies guttgeheescht. Gastric Kriibs ass eent vun de meescht genannten Cancers an ass den drëtten Virwaat Ursaach vum Kriibs Doud weltwäit [3]. An gastric Kriibs, overexpression vun epidermal Wuesstem Faktor receptor (EGFR), Faktor Mënsch epidermal Wuesstem receptor 2 (HER2), an HER3 ass mat aarmséileg hätt soll [4, 5]. Viru Kuerzem, huet den Traitement vun HER2-positiv metastatic gastric an gastroesophageal menaarbecht Kriibs guttgeheescht der HER2 monoclonal antibody Stad op Basis vun de Resultater vun der Stad mat Chimiotherapie zu HER2-positiv fortgeschratt Gastric Cancer (ToGA) Medeziner Prozess [6]. VerfÜgung

Wann Kombinatioune vun Géigesäitegkeet noncompetitive antibodies der selwechter receptor Erhéijung anti-entholl Aktivitéit gezielt kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung. Kombinatioun vun der HER2 antibodies, Stad an pertuzumab gezielt, weist Efficacitéit vun HER2-overexpressing Broscht Cancers fräi [7]. D'Virdeeler vun der pertuzumab an Stad geschéckt weider goufen an preclinical a Krankheete Prozesser bewisen [8, 9]. Aner HER2-gezielt antibodies besser Efficacitéit vun geschéckt wéi als Single Agenten weist, a muss konsequent verwandelt-Regulatioun vun HER2 Niveauen a nëtzlechen geschéckt Effekter an Maus Modeller dës [10]. Déi grouss Efficacitéit vun antibody Kombinatioune huet och mat EGFR-gezielt antibodies [11, 12] a wiere endothelial Wuesstem Faktor receptor 3 (VEGFR3) -targeting antibodies [13]. VerfÜgung

therapeutesch antibodies typesch sinn extensiv esou ze Gewise ginn Besëtz wënschenswäert biologescher an physicochemical Eegeschaften, wéi niddreg immunogenicity, héich Affinitéit a Spezifizitéit, optimal effector Funktiounen, an gutt Creme a Stabilitéit [14]. Besonnesch, antibody humanization a Bezuch maturation sinn zwee vun de meeschte dacks applizéiert Ingenieur Prozesser während der Entwécklung vun therapeutesch antibody Kandidaten. Immunogenicity vun therapeutesch antibody Limite de Medeziner Déngscht an Efficacitéit vun Produktioun vun Anti-Drogen antibodies [15], an der humanization vun der antibodies aus Maus oder aner Art ass elo e Liewesniveau Prozedur fir d'Entwécklung vun therapeutesch antibodies. E puer humanization Methoden goufen entwéckelt, datt entweder konsequent oder empiresche Approche [16] beschäftegen. D'complementarity-Bestëmmung Regioun (CDR) grafting Approche wéi eng Method déi mënschlech anti-chimeric antibody (HACA) Äntwert ze iwwerwannen [17] ass e gutt etabléiert humanization Method. Allerdéngs, Resultater direkt grafting vun murine CDRs op engem Mënsch Kader acceptor Haaptrei dacks zu engem Verloscht vu Affinitéit, sou zeréck-Projet'en vun Kader Regioun Reschter (VERNIER Zone Reschter) ënnerstëtzen d'Struktur vun CDR Persounen oft néideg ass [18]. Fir kënschtlech VerfÜgung Affinitéit maturation, sinn dräi Diversifikatioun Approche generell benotzt: zoufälleg mutagenesis vun e.g. Feeler-ufälleg Hinnen alleguer, randomization vun geziilte Reschter benotzt Zeien oligonucleotides, a Kette passéieren. An der randomization Approche viséieren, sinn CDRs den logeschen Zil fir d'randomization am meeschte Fäll well somatic hypermutation kennen CDRs vun antibodies zu Gonschten [19], an CDR-H3 an CDR-L3 der antibody-antigen Interaktioun dréchen éischter Perséinlechkeeten huet [ ,,,0],20]. Ee vun den Haapt Problemer mat der geziilte randomization assoziéiert ass Auswiel vun de Positiounen déi net wichteg fir d'antigen sinn obligatoresch, awer wat d'Affinitéit revaloriséiert ka wann optimal Wiessel vun Aminosaier feieren ass. Alanine Scannen kann de Reschter hëllefen, festzestellen zu randomize, besonnesch wann CDRs laang sinn. Heiansdo, Erhéijunge alanine stattfannen selwer d'Affinitéit vun antibodies [21]. VerfÜgung

Mir entwéckelt virdrun eng murine antibody HER2 gezielt (Copie 1E11) déi a Kombinatioun mat Stad synergistic antitumor Aktivitéit weist an HER2 gastric Kriibs Zell Linnen overexpressing [22 ]. An dësem Rapport, beschreiwen mir, wéi mir d'1E11 fir eng therapeutesch antibody vun CDR grafting zu Mënsch germline immunoglobulin Variabel Genen a Bezuch maturation duerch geziilte randomization vun CDR-H3 an CDR-L3 optimiséiert. D'optimiséiert 1E11 antibody (Copie 1A12) weist synergistic antitumor Aktivitéit zu HER2-positiv mat Stad gastric Kriibs xenograft Modeller vun geschéckt. Et war fir de Klon 1E11, Mënsch germline Variabel Genen Photonen acceptors fir humanization ouni Bezuch Reduktioun, an de Wiessel vun CDR-L3 Reschter datt net wichteg fir antigen bindend gouf genuch ze verbesseren d'Affinitéit vun méi wéi 10-fantastesch observéiert dat. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

Zell Linnen a Material zur VerfÜgung

NCI-N87 Zellen aus American Type Kultur Collection kaaft huet (ATCC, Manassas, VA, USA) an OE-19 Zellen sech aus der Europäescher Collection vun Zell Kultur (ECACC, Porton Down, UK) kritt. D'Zell Kultur mëttelfristeg war RPMI-1640 mat 10% An et Bovine serum (FBS) ergänzt, an Antibiotiken an Zellen sech cultured bei 37 ° C ënner 5% CO _{2. Stad an palivizumab war vun Genentech (South San Francisco, CA, USA) an MedImmune, Firmechef (Gaithersburg, MD, USA) produzéiert, respektiv. ChromPure Mënsch IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) war als Mënsch IgG Kontroll antibody fir kënschtlech VerfÜgung assays benotzt. IgG antibodies sech mat der Freestyle 293 System produzéiert (Invitrogen, Karlsbad CA, USA) a sidd mat FAQ-A Bezuch chromatography (GE Gesondheetswiesen, Piscataway, NJ, USA). Endotoxin war mat enger Endotoxin ewechhuelen Kit geläscht (GenScript, Piscataway, NJ, USA), a endotoxin Niveauen mat engem Endotoxin Detektioun Kit (GenScript) alles. Recombinant Proteinen sech als secreted Proteinen produzéiert der Freestyle 293 System benotzt a sidd mat FAQ-A oder Ni-ss chromatography (QIAGEN, Valencia, CA, USA) fir Fc-afp oder Seng-afp Proteinen, bzw.. VerfÜgung}

alanine-Scannen mutagenesis an Fab Offäll VerfÜgung

Site-Direkter mutagenesis fir alanine Scannen war vun Hinnen alleguer mutagenesis benotzt QuickChange Site-Direkter mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) gesuergt. Mann- Fab Proteinen sech ausdrécke a sidd d'Bedeitung vun all Ermächtegung fir antigen bindend Aktivitéit ze diskutéieren. An dowéinst, Escherichia belaascht VerfÜgung DH5α Zellen mat der pComb3X transforméiert Vecteure Mann- Fab Genen waren um 28 ° C an SB läschen ausser ugebaut. Ausdrock war entschlof mat 1 mm isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside wann d'optesch Dicht (600 nm) vun der Kultur 0,8 erreecht. Zell Pellets sech an ausklénge Extraktioun Prellbock (120 mm Tris, pH 8.0, 0.3 mm héich, an 300 mm sucrose) an incubated op Äis fir 30 Minutten fir periplasmic Extraktioun resuspended. Magnesium Chlor (2,5 mm) war no centrifugation fir d'Keess Extrait dobäi gratis héich virum Sommet Metal ioun Affinitéit chromatography (iMac) Offäll ze scavenge. Sidd Fab Proteinen sech fir Elisa bindend assay benotzt a k VerfÜgung _{ugefaangen Analyse mat Uewerfläch plasmon Resonanz (, kann). VerfÜgung}

Affinitéit maturation VerfÜgung

Humanized 1E11 gekloonten zu pComb3X Vecteure wéi Fab Format wéi d'Skelett fir iwwerlageren Extensioun polymerase Kette Reaktioun (Hinnen alleguer) mutagenesis geheescht huet ewéi virdrun [23]. Den Zeien oligonucleotides (Integréiert DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 "(ëmgedréint) an 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (No) huet fir L-NNK an H-XXS Bibliothéik benotzt, bzw.. N ADR A, C, G oder T; M ass C oder E; an S as G oder C. nummeréiert huel Positiounen auszeschaffen Hand-gemëscht nucleotides komponéiert vun 70% vun ee Risiko an 10% jiddereng vun den aneren dräi Base: 70% Frequenz huel ass G, A, T, an C fir 1, 2, 3 a 4, respektiv. Fir d'H-2AA Bibliothéik, eng equimolar Mëschung vun de folgende vir mutagenic oligonucleotides sech benotzt: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ", 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3", 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ", 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3" , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 ", an 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3". K ADR G oder T. No zwou Ronnen vun iwwerlageren Extensioun Hinnen alleguer, Fab Bibliothéik DNA mat engem zoufälleg CDR war mat SfiI Géigewier, an der SfiI-verdaut phagemid Vecteure pComb3X, an electroporated an E VerfÜgung Jonglenster. belaascht VerfÜgung Deformatioun ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). VerfÜgung

Héich Affinitéit binders benotzt soluble biotinylated HER2-ECD FAQ ausgewielt. Kuerze Been binders sech duerch incubating der antibody phage Bibliothéik mat 100 μL vun Pre-gespaart Dynabeads M-280 Streptavidin (Invitrogen) fir 1 Stonn mat lues Rotatioun bei Raumtemperatur Pre-do ass. Biotinylated HER2-ECD FAQ (100 nM- 0,1 Auer) war fir d'Pré-do ass antibody Bibliothéik kommen an fir 1 Stonn mat Rotatioun bei Raumtemperatur incubated. Dunn, 50 μL vun blockéiert streptavidin-Magnéitfeld Glaspärelen goufen ugebaut a fir 15 Minutten op der rotator incubated. Glaspärelen waren 10 mol mat 1 ml vun Tris-gefiermt Salins-Tween 20 (TBST) an zweemol mat 1 ml vun PBS gewäsch. Bound phages sech duerch incubating der Glaspärelen mat 1 ml vu 100 mm triethylamine fir 8 Minutten duerno mat 0,5 ml vun 1 M Tris, pH 7.4 neutraliséiert eluted. VerfÜgung

Elisa bindend Aktivitéit Test VerfÜgung

Antibodies bäigebaut zu ëmsou 96-gutt Halschent Géigend Placke (Corning, Corning, NY, USA Product Nr 3690) mat 1 μg /ml vun der antigen bedeckt. No incubation fir 1 Stonn bei Raumtemperatur, goufen d'Telleren dräimol mat TBST gewäsch a incubated mat Kanéngchen anti-Mënsch antibody-horseradish peroxidase (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) fir IgG antibodies a Grenzwäerter anti-ha-HRP (Copie F10, Roche Life Science, Basel, Schwäiz) fir antibodies Fab, bzw.. Placke dräi Mol gewäsch waren, tetramethylbenzidine (TMB) peroxidase Realitéiten (SurModics, Eden Prairie, Punktzuel, USA) ugebaut a Reaktioune waren déi Schan 1 N heiansdo Schwiewel-Seier (DukSan, Ansan, Korea) gestoppt. Absorbance bei 450 nm huet mat enger Victor X3 Instrument (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) gemooss. VerfÜgung

Fläch plasmon Resonanz Analyse VerfÜgung

Fir k VerfÜgung _{ugefaangen Analyse vun Fab Proteinen, war HER2-ECD-seng FAQ op der Uewerfläch vun engem CM5 éichter Chip (GE Gesondheetswiesen) mat der Amine Kopplung Method bei ongeféier 2.000 Äntwert Eenheeten (lachen) Sommet. Sidd Fab Proteinen sech bei 2 μg /ML Konzentratioun an eng onkontrolléiert Taux vun 50 μL /Minutt heijen. Fir k VerfÜgung ugefaangen Analyse vun IgG antibodies, Geess anti-Mënsch IgG (γ) (Invitrogen, Cat. Nr H10500) op der CM5 éichter Chip benotzt Amine Kopplung Sommet war, an antibodies ageholl goufen um 1 μg /ml fir 4 Minutten a stabiliséiert fir 5 Minutten op engem Flux Taux vun 50 μL /Minutt. HER2-ECD-Seng FAQ war bei enger Usammlung vu 160 nm heijen. Fir Affinitéit Miessunge, bei ronn 50 lachen vun antibodies sech Geess ageholl anti-Mënsch IgG (γ) op engem CM5 Chip Sommet. HER2-ECD-Seng FAQ war um Konzentratioune vun 0 bis 640 nm rangéiert heijen. Sensorgrams sech bei all Konzentratioun kritt a bewäert der BIAevaluation Software benotzen. Fir epitope binning, war IgG Form vun hz1E11 op getrennten éichter CM5 Chip Fläch Sommet ongeféier 1000 Äntwert Unitéiten. HER2-ECD-Seng (320 nm) an antibodies (1 μg /ml) huet fir 4 Minutten Rei derbäi a stabiliséiert fir 5 Minutten op engem Flux Taux vun 50 μL /Minutt. VerfÜgung}

Zell Nuetsvolen assay VerfÜgung

BTS sech zu 96-gutt Placke (Corning) an der 10% FBS wouvun mëttel- a Précoce-cultured fir 24 Stonnen rakommen. D'Zellen sech mat antibodies um uginn Konzentratioune a Kultur fir 4 Deeg behandelt. WST-1 reagent (DoGen EZ-Cytox; Daeil déngt Service, Seoul, Korea) war benotzt Zell Nuetsvolen ze moossen. Relativer Zell Nuetsvolen war vun Partitur der absorbance vun all gutt vun der heeschen absorbance vun PBS-behandelt Wells zu all zappen berechent. VerfÜgung

Xenograft Etude VerfÜgung

Athymic Sauna weiblech Mais (Daehan Biolink, Chungbuk, Korea subcutaneously vun der lénker Säit Beräich) sech mat heijen 5 × 10 6 vun NCI-N87 Zellen zu Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Erhéijen sech erlaabt op ronn 200 mm 3 zu Gréisst ze wuessen, an Mais sech dann an Gruppen zoufälleg. Déiere scho intraperitoneal Administratioun vun antibodies um uginn Schrëtt zweemol Wochenzeitung. Entholl Bänn sech mat der Formel berechent (L × W × W) /2, wou L de gréisste entholl Duerchmiesser duerstellt a W stellt de klengste entholl Duerchmiesser. Zwee-Manéier widderholl Mesuren ANOVA gefollegt vun Bonferroni Post Test war fir statistesch Analyse vun der entholl growth.All Déier Studien standing laut gehaal huet mat de Richtlinne vun der NIH de "Guide fir Care an Uwendung vun Déieren" an en Accord Protokoll scho vun der Steierberoder Déieren Care an Benotzt d'Gesellschaft ugeschnidden. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Humanization vun 1E11 Leedung vum CDR-grafting zu Mënsch germline Genen VerfÜgung

fir d'humanized antibody, déi VH an VL entwéckelen Message vun der murine 1E11 sech mat mënschlechen germline V an J Gentherapie repertories benotzt IMGT /V-QUEST Analyse Handwierksgeschir [24] Verglach. Fir d'Schwéierindustrie Hamburger, IGHV3-48 * 03 an IGHJ4 * 01 Schatzkummer der héchster homology zu der 1E11 Kollegen, 85% an 87% Identitéit sharing, bzw.. Fir d'Liicht kommen, Mënsch IGKV1-39 * 01 an IGKJ1 * 01 Genen ugewisen Identitéit vun 80% an 81%, respektiv. Dës mënschleche Genen huet den acceptor Message fir d'grafting vun der murine CDRs ausgewielt. Ënnert der VERNIER Zone, déi vun Pestiziden am Kader Regioun besteet, datt an der Presentatioun vun CDR Strukturen Équipe sinn duerch d'CDR ënnerstëtz Persounen [18, 25], nëmmen ee lafenden op Positioun 49 _{H vu robuste Kette ënnerscheet tëscht murine an Mënsch Message. Demno, humanized 1E11, hz1E11, huet nëmmen een murine Ermächtegung am Kader Regiounen (Lalumi 1). VerfÜgung}

bindend Aktivitéit vun hz1E11 zu extracellular Regioun (ECD) vun HER2 fir datt vun ch1E11 (Lalumi 2A) géigeniwwer war, an d'Affinitéit vun Stad, ch1E11, an hz1E11 war 3 nm, 23 nm, an 23 nm, bzw.. Mir confirméiert och, datt hz1E11 gebonnen un Sous-Domain IV wéi d'Elteren ch1E11. Stad Photo'en och zu sub-Domain IV [26]. D' kënschtlech VerfÜgung anti-proliferative Aktivitéite vun hz1E11 als eenzeg Agent a Kombinatioun mat Stad goufen och gläichwäerteg zu deene vun ch1E11 (Lalumi 2C). An der leschter Etude [22], et gouf confirméiert, datt ch1E11 haten zu VIVO VerfÜgung antitumor Aktivitéit ähnlecher fir dass d'Stad als eenzegen Agent, an der Kombinatioun vun ch1E11 an Stad schéinen der entholl Réckgang index (TGI) vun 95,1%. Ähnlech, wéi hz1E11 enger eenzeger Agent haten ähnlechen zu VIVO VerfÜgung antitumor Aktivitéit ze Stad (S1 Lalumi) an der Kombinatioun vun hz1E11 der Stad och zougedréckt Portioun-ofhängeg Aktivitéit anti-entholl an der NCI-N87 xenograft Maus Modell ( Figebam 2D). Antibody geschéckt Behandlung bei 1 mg /kg all vun hz1E11 an Stad duerchgesat an ähnlech Aktivitéit anti-entholl mat Stad Single Behandlung um 10 mg /kg, an op der 2,5 mg /kg geschéckt a virun der etabléierter entholl stabiliséiert oder huet regressing (Nee statistesch groussen Ënnerscheed [ P VerfÜgung &Si besteet; 0,05] war ënner 2,5, 5, an 10 mg /kg Kombinatioune observéiert). Dës Resultater weisen, datt hz1E11 d'Affinitéit a biologescher Aktivitéit entsprécht ch1E11 huet, an datt hz1E11 verbessert der anti-entholl Aktivitéit vun Stad wou an alleng benotzt. VerfÜgung

Alanine Scannen vun CDR-H3 an CDR-L3 VerfÜgung

der kritescher Reschter fir antigen-antibody Interaktioun, alanine Scannen mutagenesis fir identifizéiere sech am CDR3 Regioune vun der Schwéierindustrie an Liichtjoer Ketten (CDR-H3 an CDR-L3) duerchgefouert. D'Auswierkunge vun der kennen sech duerch analyséiert d bindend Aktivitéit vun sidd Fab Proteinen vun indirekter Elisa évaluéieren. An CDR-H3, ofgeschaf alanine Wiessel um Positioun Gly98 _{H déi décisiv vun der Fab zu HER2, an G97 ophaalen an T99 ophaalen mutants zougedréckt bindend Aktivitéit (Lalumi 3A) reduzéiert. An CDR-L3 no der alanine Auswiesselungen vill kleng Effekter (Lalumi 3B). D' k VerfÜgung ugefaangen Wäerter vun alanine Scannen mutants sech benotzt, kann géint immbolized HER2-ECD FAQ analyséiert. Mir confirméiert, datt d'Schwéierindustrie Kette G98A Mann- misst verbindlech Aktivitéiten verluer, an den Nopeschlänner T99 ophaalen an G97 ophaalen mutants beim 32-fantastesch a 17-fantastesch fräi k VerfÜgung ugefaangen Wäerter bzw. (Lalumi 3C). Dës Resultater unzeginn dat schwéiert Kette Gly98 H System kritesch ass a sengem bascht Reschter sinn och System wichteg fir antigen-antibody Interaktioun. VerfÜgung}

Affinitéit maturation vun hz1E11 VerfÜgung

Affinitéit maturation vun hz1E11 gehaal huet duerch de Bau vun der Schwéierindustrie oder Liicht Kette CDR3 Variant Bibliothéiken, déi vun der Gläichgewiicht Auswiel vun der phage antibody Bibliothéiken gefollegt. Fir d'Liicht kommen, glutamine Pestiziden um Positiounen 89 _{L a 90 L net diversifizéiert goufen well glutamine Toast op dës Positiounen vun néng Aminosaier-longCDR-L3 Message bei 59% an 73% Ofstänn fonnt ass, bzw. [ ,,,0],27]. Positiounen 91 L-94 L zoufälleg sech e NNK Zeien codon (L-NNK) benotzt. Fir d'Schwéierindustrie Hamburger, Positiounen 95 H -100a H zoufälleg sech mat engem XXS codon (H-XXS), sou ugeluecht, datt bei der éischter an zweeter Nukleotid Positioune vun der diversifizéiert codon huel wëll Typ mat 70 Doudesfäll % Chance, fir jiddereng vun den aneren dräi Base Priedegt 10% Frequenz, an déi drëtt Bréiwer vun der codons huet mat enger equimolar Mëschung vun G an C (Lalumi 4A) Wierderbuch. Héich Affinitéit binders sech aus héich-stringency ausgewielt oder niddereg-stringency panning (Table 1). VerfÜgung}

Am Verglach zu de niddereg-stringency vun den L-NNK Bibliothéik an déi 100% vun der Sekundärrohstoffer panning, third-, an véiert-Ronn Wasserstoff clones opgefouert goufen Elisa positiv, fir déi héich-stringency panning de véiert-Ronn Wasserstoff Kriseperiod kee Bindemëttel bei all, an nëmmen een-Drëttel vun der drëtter-Ronn Wasserstoff clones sech Elisa positiv (Table 1). Déi gewielte clones vum CDR-L3 Bibliothéik dorënner vill Message, datt all véier zoufälleg CDR-L3 Positiounen mutated haten, am Géigesaatz CDR-H3 Bibliothéiken aus wéi déi meescht vun der gewielter clones der Wëllschwäin Typ Haaptrei zréckbehalen zu Positiounen 97 _{H -100 H (kuckt hei ënnendrënner). Verschidde panning Strategien Kriseperiod verschiddene Haaptrei Beräicherung zeréckzeféieren. Zum Beispill, d'Liicht Kette Variant Klon 1A12 (Q 89LQNAYAPWT 97L) war vun der Héich-stringency isoléiert panning awer net aus der niddereg-stringency panning, an der Schwéierindustrie Kette Variant Klon 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) war och panning nëmmen aus dem héich-stringency ausgewielt. Spannen, 59% vun eenzegaarteg antibodies zu 4 September Wasserstoff mat niddereg-stringency panning vun L-NNK Bibliothéik haten eng alanine op Positioun 92 L, zu Linn mat alanine Scannen Analyse (Lalumi 4B). VerfÜgung}

bal all clones datt aus der H-XXS Bibliothéik haten d'selwecht Haaptrei um 97 _{H -100 H wéi d'Elteren Klon, a weisen eng kloer Beräicherung vun ASN-Tyr Haaptrei bei 95-96 isoléiert huet. Fir weider de Bäitrag vun CDR-H3 Reschter bewäerten ze antigen-antibody bindend, eng zousätzlech CDR-H3 Bibliothéik war mat Zwillingsbridder NNK zoufälleg codon Scannen vun CDR-H3 (H-2AA, Lalumi 4A) gebaut. An niddereg-stringency panning, mutants um Positiounen 95 H, 96 H, 99 H, 100 H, an 100a H am éischte-Ronn panning ausgewielt goufen, awer nëmmen mutants um Positiounen 95 H an 96 H waren an der véiert-Ronn Wasserstoff (Table 1) beräichert. Mir konnten net de mutants um Positiounen Gly97 H an Gly98 H an all panning Strategien an accordéieren z'entdecken. VerfÜgung}

Affinitéit a verbindlech Aktivitéit vun ausgewielt clones VerfÜgung

der Kombinatioun Effekt ze bewäerten vun der Affinitéit-jiddfereen schwéier a Liicht Kette Varianten, IgG antibodies mat Kombinatioune vun Affinitéit-jiddfereen schwéier a Liicht Ketten goufen produzéiert an hire k VerfÜgung _{ugefaangen Wäerter waren festzestellen, kann Analyse (Table 2) benotzen. Vun zwou Liicht Kette Varianten an zwee schwéier Kette Varianten, 1A12 ofgeleet vu L-NNK zougedréckt a dem gréisste Verbesserung (16-fantastesch). D'Kombinatioun vun der Luucht Kette vun 1A12 mat der optimiséiert schwéier Kette vun de Klon 1B12 e 24-fantastesch Verbesserung vun k VerfÜgung ugefaangen iwwer d'Elteren hz1E11, während fir déi aner Kombinatioune vun k VerfÜgung ugefaangen Wäerter sech gläicht oder méi grouss wéi déi vun 1A12. Well den 1.5-fantastesch zousätzlech Verbesserung vun den L-1A12 + H-1B12 alleng net vill grouss war, clones 1A12 an 1F11 (Liicht Kette Varianten) goufen fir weider characterization gewielt der Haaptrei Differenz vun de Bezuch-jiddfereen antibodies aus dem Congé ze minimiséieren Klon. D'dissociation léisst fir d'Affinitéit jiddfereen clones, och déi, kann Analyse sech, méi waren wéi 10-fantastesch niddreg wéi déi vun den Elteren Klon hz1E11 an ähnlecher fir dass d'Stad (Table 3). VerfÜgung}

Fir erauszefannen, ob Affinitéit -matured hz1E11 clones kruet zu der selwechter epitope wéi d'Elteren hz1E11, déi verbindlech vun 1A12 an 1F11 zu der HER2-ECD datt Précoce-gebonnen war bis hz1E11 duerch, kann analyséiert huet. Béid clones gedanzt der monomeric HER2-ECD-Seng FAQ vun Sommet 1E11 hierkommen Stad kéint (Lalumi 4C) ageholl ze kruet. Ausserdeem, et gouf confirméiert, datt de 1A12 epitope net mat, datt et iwwerlageren d'Stad (Lalumi 4D). Clones 1A12 an 1F11 kruet och zu sub-Domain IV wéi hir Elteren Klon hz1E11 (Lalumi 4E). Dës Donnéeë weisen, datt epitopes vun 1A12 an 1F11 sech net duerch d'Affinitéit maturation Prozess geännert. VerfÜgung

Efficacitéit vun Affinitéit jiddfereen hz1E11 clones VerfÜgung

Béid 1A12 an 1F11 antibodies zougedréckt gehumpelt fräi anti-proliferative Aktivitéiten als eenzege Agent Verglach zu hz1E11 op NCI-N87 an OE-19 gastric Kriibs Zell Linnen datt HER2 (Lalumi 5A an 5B) overexpress hierkommen, a Kombinatioun mat Stad, hir anti-proliferative Aktivitéiten war ausféieren zu datt Stad gehalen an entsprécht hz1E11 plus Stad . D'Anti-proliferative Aktivitéit vun 1A12 an 1F11 gouf confirméiert zu VIVO VerfÜgung zu NCI-N87 xenograft Modell. Ieweschte antitumor Aktivitéit war an Kombinatioun mat Stad datt vun all Agent dësen zwou xenograft Modeller (Lalumi 5C) evident. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

Trotz encourageant Medeziner Resultater kritt mat der antibody Stad HER2 gezielt an der Traitement vun gastric Kriibs, et sinn nach brauch fir méi mächtegst Therapien HER2 geziilte [6]. Kombinatioun vun Net-Competitioun antibodies gezielt kenne, wéi HER2, EGFR, an VEGFR3, kann anti-entholl Aktivitéit Erhéijung vun preclinical Modeller [11-13, 28]. Pertuzumab, aner HER2-gezielt antibody, ass fir Asaz a Kombinatioun mat Stad an der Behandlung vun metastatic Broscht Kriibs guttgeheescht [29]. An enger viregter studéieren, entwéckelt mir e Roman HER2 gezielt antibody, 1E11, déi bedeitendst anti-entholl Aktivitéit als eenzeg Agent an synergistic Effekt a Kombinatioun mat Stad kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO ze hunn jo bewisen huet VerfÜgung [22]. D'Anti-entholl Aktivitéit vun der 1E11 plus Stad geschéckt ass entstoen, net nëmme fir eenzel Behandlung Stad, mee och fir d 'Kombinatioun vu pertuzumab an Stad. An dësem Rapport, ass de humanization a Kierzunge Affinitéit maturation vun der Maus hybridoma-ofgeleet 1E11 monoclonal antibody beschriwwen. VerfÜgung

Ufanksniveau Approche Potential immunogenicity vun nonhuman Variabel Regiounen ze reduzéieren duerch CDR-grafting an engem Mënsch Kader vum immunogenicity däitlech erofgoen vun therapeutesch antibodies [15, 17]. Superhumanization benotzt Mënsch germline Kaderen als Skelett gouf als ausféieren humanization Methodik proposéiert vun somatic hypermuations vum Mënsch Kader [30-32] ofgeleet putative effector T-Zell epitopes ze verhënneren. Et gëtt ugeholl, datt duerch germline Gentherapie Segmenter encoded antibodies strukturell flexibel sinn an der Lag ze vill verschidden antigens bindend ze aménagéieren [33-35]. D'CDRs vun murine antibody 1E11 souwéi eng Ermächtegung am VERNIER Zon vun V _{H (Ala49 H) waren op der mënschlecher germline Variabel näischt Bäigeprafftes a vereente Genen mat héchsten homology de Congé antibody (Lalumi 1). Déi doraus resultéierend humanized antibody, hz1E11, awer bal derselwechter Affinitéit a biologescher Aktivitéit fir d'Elteren antibody (Lalumi 2). VerfÜgung}

selektionéiert vun Reschter fir randomization ass eng kritesch Schrëtt an cibléiert randomization Approche vun Affinitéit maturation well vun der praktescher Aschränkungen vun antibody Bibliothéik Gréisst an d'Auswiel Technologien. Alanine Scannen an zu silico VerfÜgung Analyse vun der antibody féieren, virun allem an CDRs, si nëtzlech fir d'randomization Zil- Reschter auswielen an erliichtert d'Affinitéit maturation Prozess. An alanine Scannen Analyse vun CDR-H3 vun hz1E11, misst d'G98A Mann- bindend Aktivitéit an der G97A Mann- zougedréckt bindend Aktivitéit (Lalumi 3A) reduzéiert verluer. Direct Verfall vun e wesentleche paratope Ermächtegung Resultater normalerweis am Ganzen Verloscht vun Fähegkeet vun der antibody bindend [26, 33, 36]. Dofir, war e méi konservativ Approche zu CDR-H3 randomization agestallt, entweder eng Hand-gemëscht oligonucleotide benotzt dass bei der Elternhaus Haaptrei Buergermeeschter ass, oder de Brudder NNS zoufälleg codon Scannen vun CDR-H3. Wéi aus der alanine Scannen Analyse erwaart, bal all clones datt aus der CDR-H3 Bibliothéiken haten d'Haaptrei 97 _{H-100a H selwecht wéi d'Elteren Klon (G 97HGTAS 100aH) isoléiert sech . VerfÜgung}

d'alanine Scannen Resultater hindeit, datt all CDR-L3 Reschter dispensable sinn, obwuel e puer vun de Projet'en schéngt d'Affinitéit (Lalumi 3B) ze niddreg. Dofir, véier Positioune vun CDR-L3 (91 _{L-94 L) sech komplett zoufälleg den Zeien codon NNK benotzt. D'Haaptrei Analyse vun der gewielter clones confirméiert alanine Scannen Analyse; der Majoritéit vun der gewielter clones aus der CDR-L3 Bibliothéik déi all véier zoufälleg CDR-L3 Positioune aus dem Congé Ermächtegung, contrairement zu den CDR-H3 Akeef Resultater an déi verännert Meeschter vun der gewielter clones vun de Bibliothéiken an der selwechter Haaptrei wéi d'Équipe Elteren hz1E11 an der Mëtt Deel vun der CDR (Table 1). D'clones mat meeschte Affinitéit Verbesserung koum aus der CDR-L3 Bibliothéik. Et ass wahrscheinlech, datt d'CDR-H3 vun hz1E11 fir optimal a Meeschter kennen schon no ass, virun allem an der Regioun 97 H-100 H, sinn Liewer an der bindend Affinitéit, iwwerdeems d'CDR-L3 Haaptrei net ass wéi optimal an der stattfannen an dëser Regioun kënnt an däitlech Verbesserung am Bezuch Resultat. D'L-NNK Bibliothéik panning accordéieren sech um Positioun mat engem hydrophobic Aminosaier mat clones beräichert 91 L, eng kleng Aminosaier um 92 L, an aromatesche Aminosaier um 93 L. Dëst Muster aus der Elternhaus CDR-L3 Haaptrei vun Q bëschen anescht ass 89LQLYSTPWT 97L an mobiliséiert nees datt d'CDR-L3 Haaptrei vun den Elteren 1E11 antibody war sub-optimal an dofir hu Sall fir Affinitéit Verbesserung.}