Plos ONE: Affinity Zorenje monoklonsko protitelo 1E11 s ciljnimi popačenosti v CDR3 regij optimizira Terapevtsko protitelo ciljanje na HER2-pozitivnega Rak želodca

Povzetek

Anti-HER2 mišje 1E11 monoklonsko protitelo ima močne in sinergistično aktivnost proti tumorjem in-HER2 želodčnih rakavih celic, kadar se uporablja v kombinaciji s trastuzumabom. Mi trenutno optimizirana ta protitelesa človekovih zdravljenja. Prvi, ki določajo komplementarnost (CDR) iz murinega protitelesa smo cepljen na človeške zarodne linije imunoglobulina variabilnih genov. opazili nobene razlike v afiniteti in biološke aktivnosti med himernega 1E11 (ch1E11) in humanizirano 1E11 (hz1E11). Dalje je afiniteta zorenje hz1E11 opravlja naključnih ostankov CDR-L3 in H3 sledi strogim izborom bioselekcije. Blažji selekcijski pritisk prednost izbiro več različnih klonov, medtem ko večji izbor strogost privedla do konvergence potuje po uličici izhod na manjše število klonov z izboljšano afiniteto. Klon 1A12 imeli štiri substitucij aminokislin v CDR-L3, in pokazala 10-kratno povečanje afiniteto v primerjavi s starševskim klona in poveča moč v vitro
antiproliferativno testu aktivnosti z rakom želodca HER2 overepxressing celice. Clone 1A12 inhibira rast tumorskih NCI-N87 ksenotransplantskih modela z enako učinkovitostjo do samega trastuzumab, in kombinirane terapije z 1A12 in trastuzumaba popolnoma odstranili ugotovljenih tumorje. Ti rezultati kažejo, da humanizirano in afinitetno zrel monoklonsko protitelo 1A12 je zelo optimizirana molekula za prihodnjo terapevtsko razvoj proti HER2-pozitivnih tumorjev

Navedba. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT et al. (2015) Affinity Zorenje monoklonsko protitelo 1E11 s ciljnimi popačenosti v CDR3 regij optimizira Terapevtska protiteles usmerjenost HER2-pozitivnega želodca raka. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10,1371 /journal.pone.0134600

Urednik: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, UNITED STATES

Prejeto: April 14, 2015; Sprejeto: 12. julij 2015; Objavljeno: 30. julij 2015

Copyright: © 2015 Ko et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. Ta študija je bila podprta z AbClon Inc., in National Research Foundation of Korea (NRF) nepovratnih sredstev HS za ZDRAVILA Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) . Komercialni financer (AbClon Inc.) zagotovil podporo v obliki plač za avtorje (BKK, SC, LGC, YHL, študij v, KTK in JSL), vendar ni imel nobene dodatne vloge pri oblikovanju študije, zbiranje podatkov in analizo, odločitev o objavi, ali priprava rokopisa. Posebne vloge teh avtorjev zglobni v razdelku "Avtor prispevkov"

nasprotujočimi si interesi:. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK in JSL so vsi zaposleni, ki jih AbClon Inc. in lahko lastnica zalog. HS je na plačano svetovanje na AbClon Inc. in ima v lasti tudi svoje zaloge. Abclon opravlja patentov in razvoj izdelkov na spojine, ki so omenjeni v tem prispevku. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK in JSL so vsi trenutno zaposleni komercialni financerja teh raziskav AbClon Inc. in ima lahko svoje zaloge. HS je trenutno na plačano svetovanje za AbClon Inc. in ima v lasti tudi svoje zaloge. AbClon ima registriran patent v Koreji (KR10-1453462 protitelesa sposoben vezave posebej na HER2) in vložila prijavo PCT (PCT /KR2014 /004317, Protitelesa specifično veže na HER2), v kateri BKK, YHL, ISH, KTK in JSL so navedeni kot izumitelji. AbClon je tudi nadaljeval razvoj izdelkov na humaniziranih,-afiniteto dozorela protiteles, ki so omenjeni v tem prispevku. To ne spremeni pripadnost avtorjev do vseh PLoS ONE politike o izmenjavi podatkov in materialov.

Uvod

monoklonskih protiteles, ki so mainstream zdravljenje v onkologiji in avtoimunskih bolezni, in pričakuje se, da igrajo pomembno vlogo v prihodnosti zdravljenju bolezni [1, 2]. Več kot 30 rekombinantna protitelesa trenutno odobri ZDA Food and Drug Administration, od tega je približno polovica protitelesa proti raku. želodčni rak je eden izmed najpogostejših rakov in je tretji najpogostejši vzrok smrti zaradi raka svetu [3]. V raka želodca, čezmernim epidermalni rastni faktor receptor (EGFR), rastnega faktorja humani epidermalni receptorja 2 (HER2), in HER3 je v korelaciji s slabo prognozo [4, 5]. V zadnjem času se je HER2 ciljanje monoklonsko trastuzumab protiteles odobreno za zdravljenje HER2-pozitivnega metastatskega raka želodca in gastroezofagealnem prehodu, ki temelji na rezultatih trastuzumab s kemoterapijo v HER2 pozitivno napredno Rak želodca (toga) kliničnem preskušanju [6].

Posebne kombinacije med seboj noncompetitive protiteles, ki so namenjeni enako povečanje receptor aktivnost proti tumorjem in vitro
in in vivo
. Kombinacija HER2 ciljanje protitelesa, trastuzumab in pertuzumab, kaže povečano učinkovitost pri HER2-prekomerno ekspresijo raka dojk [7]. Koristi kombinacije pertuzumab in trastuzumabom so nadalje kaže v predkliničnih in kliničnih preskušanj [8, 9]. Drugi HER2 ciljanje protitelesa, ki kažejo večjo učinkovitost v kombinaciji kot o posameznih agentov, in so pokazale dosledno navzdol ureditev ravni HER2 in pozitivnih učinkov kombinacij pri modelih miško [10]. Večja učinkovitost kombinacije protiteles je bila dokazana tudi z-EGFR ciljanje protiteles [11, 12] in žilnega endotelija receptor rastnega faktorja 3 (VEGFR3) -targeting protiteles [13].

Terapevtske protitelesa običajno se v veliki meri zasnovan tako, da imajo zaželene biološke in fizikalno-kemijske lastnosti, kot so nizke imunogenosti, veliko afiniteto in specifičnostjo, optimalnih efektor funkcij in dobro topnost in stabilnost [14]. Še posebej, humanizacijo protitelesa in afiniteta zorenje sta dva od najbolj pogosto uporabljenih tehničnih procesov v razvoju terapevtskih kandidatov protiteles. Imunogenost terapevtskih protiteles omejuje klinično koristnost in učinkovitost s proizvodnjo protiteles proti drogam [15], in humanizacije protiteles z miško ali druge vrste, je zdaj standardni postopek za razvoj terapevtskih protiteles. Nekaj ​​metod humanizacije so bile razvite, da zaposlujejo bodisi racionalne in empirične pristope [16]. Regija, ki določa komplementarnost (CDR), cepljenje pristop kot metoda za premagovanje humano anti-himerno protitelo (HACA) odziv [17], je dobro uveljavljena metoda humanizacijo. Vendar pa neposredna cepitev mišje CDR na okvirno akceptorsko sekvenco humanega pogosto povzroči izgubo afinitete, da back-mutacije ostankov okvir regije (ostanki Vernier cone) podporne strukture CDR zank je pogosto potrebno [18]. Za in vitro
afiniteto zorenje, se običajno uporabljajo trije pristopi razpršenosti: naključno mutagenezo jih npr error-prone PCR, naključnost usmerjenih ostankov uporabljajo degenerirane oligonukleotide in verige prelaganja. V ciljnem pristopu popačenosti, CDR so logični cilj za naključnih v večini primerov zato, ker je somatsko hypermutation razvijala, da prednost mutacij v CDR protiteles [19], in CDR-H3 in CDR-L3 ponavadi prevladujejo protiteles-antigen interakcijo [ ,,,0],20]. Eden izmed glavnih problemov, povezanih s ciljno naključnih je izbira položaje, ki niso bistveni za vezavo antigena, ki pa se lahko izboljša afiniteto ko je narejen optimalno substitucija amino kisline. Alanin skeniranje lahko pomagajo določiti ostanke naključen, še posebej, če so CDR dolgo. Včasih, alanin mutacija sam poveča afiniteto protiteles [21].

smo že razvili mišje protitelo ciljanje HER2 (klon 1E11), ki kaže sinergistično protitumorsko delovanje v kombinaciji s trastuzumabom v HER2 želodčni rak celičnih linij [22 ]. V tem poročilu smo opisali, kako smo optimizirali 1E11 za terapevtsko protitelesa, ki ga CDR cepljenje humane zarodne linije imunoglobulina variabilnih genov in afinitetno zorenje skozi ciljno naključnih iz CDR-H3 in CDR-L3. Optimiziran 1E11 protitelesa (klon 1A12) kaže sinergistično protitumorsko aktivnost v HER2-pozitivnega želodca modelih raka ksenotransplantskih v kombinaciji s trastuzumabom. Ugotovljeno je bilo, da so človeške zarodne spremenljivi geni za klon 1E11 primerni prejemniki za humanizacijo brez afinitetni redukcijo in nadomestitev ostankov CDR-L3, ki niso bistveni za vezavo antigena bilo dovolj za izboljšanje afiniteto za več kot 10-krat.

materiali in metode

celičnih linij in materiali

NCI-N87 celice so bile kupljene pri American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ZDA) in OE 19-celice smo pridobili iz Evropskega Collection of Cell kulturo (ECACC, Porton dol, UK). celične kulture medij je RPMI-1640, dopolnjenem z 10% fetalni goveji serum (FBS) in antibiotiki in celice smo gojili pri 37 ° C pod 5% CO _{2. Trastuzumab in palivizumab je produciral Genentech (South San Francisco, CA, ZDA) in MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, ZDA), v tem zaporedju. ChromPure človeški IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, ZDA) je bila uporabljena kot človeško kontrolnega protitelesa IgG za in vitro
testih. IgG protitelesa so bili proizvedeni z uporabo sistema Freestyle 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) in očistimo s pomočjo beljakovin-A afinitetno kromatografijo (GE Healthcare, Piscataway, NJ, ZDA). Endotoksini je bil odstranjen z endotoksinom odstranitev Kitom (GenScript, Piscataway, NJ, ZDA), in ravni endotoksinom bile določene z uporabo Detection Kit endotoksin (GenScript). Rekombinantni proteini so bili proizvedeni kot izločajo proteine ​​uporabljajo Freestyle 293 sistem in očistimo z uporabo protein-A ali Ni-NTA kromatografije (Qiagen, Valencia, CA, ZDA) za Fc označijo ali njegovih-označenih proteinov oz.}

alanin-skeniranje mutageneza in Fab čiščenje

-Site usmerjena mutageneza za alanin-skeniranje je bila izvedena s PCR mutagenezo uporabo QuickChange Site-usmerjena mutageneza Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA). Mutant Fab proteini so izrazili in očistili oceniti pomen posameznih ostankov za antigen vezave. Na kratko, Escherichia coli
DH5α celic transformiranih z pComb3X vektorja zatočišča mutant Fab gene smo gojili pri 28 ° C v SB juho. Ekspresijo induciramo z 1 mM isopropil P-D-1-tiogalaktopiranozid, ko je optična gostota (600 nm) kulture dosegel 0,8. Celične pelete smo ponovno suspendirali v ohlajeni ekstrakcijskega pufra (120 mM Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA in 300 mM saharoze) in inkubiramo na ledu 30 minut periplazmatski ekstrakcijo. Magnezijev klorid (2,5 mM) dodamo očiščene ekstrakta po centrifugiranju očistiti prost EDTA pred imobiliziran kovinski ion afinitetne kromatografije (IMAC) čiščenja. Očiščene Fab proteini so bili uporabljeni za ELISA testa vezave in k
_{off analiza, ki uporablja površinska plazmonska resonance (SPR).}

Affinity zorenje

Humanizirano 1E11 klonirali v pComb3X vektorju kot so Fab obliki uporabimo kot šablono za podaljšanje prekrivanje polimerazne verižne reakcije (PCR) mutageneze kot je opisano zgoraj [23]. Degenerirane oligonukleotidi (Integrated DNA tehnologije, Coralville, IA, ZDA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(nazaj) in 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Naprej) so bili uporabljeni za L-NNK in H-XXS knjižnice oz. N pomeni A, C, G ali T; M je C ali A; in S G ali C. Oštevilčene baznih položaji kažejo ročno mešano nukleotide, sestavljene iz 70% ene baze in vsako od ostalih treh podlagah 10%: 70% frekvenca baza G, A, T in C za 1, 2, 3 in 4, v tem zaporedju. Za knjižnice H-2aa, uporabili smo ekvimolarno mešanica naslednjih naprej mutagenih oligonukleotidi: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 'in 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K označuje G ali T. Po dveh krogih razširitev prekrivajo PCR, Fab knjižnice DNK z randomizirani CDR je razrezane z Sfil vezan v na Sfil-prebavi phagemid vektorja pComb3X in elektroporiranega v E
. coli
sev ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, ZDA).

veliko afiniteto veziva, so bile izbrane z topnega biotinilirano HER2-ECD beljakovin. Noge veziva so bile predhodno osiromašen z inkubacijo protiteles fagni knjižnico z 100 ml vnaprejšnjega blokiran Dynabeads M-280 Streptavidin (Invitrogen) 1 uro s počasnim vrtenja pri sobni temperaturi. Biotinilirana HER2-ECD proteina (100 nM- 12:01) dodamo vnaprej izčrpani knjižnico protiteles in inkubiramo 1 uro z vrtenjem pri sobni temperaturi. Nato dodamo 50 xl blokiranih Streptavidin-magnetne kroglice in inkubirali na rotor 15 minut. Kroglice izperemo 10-krat z 1 ml Tris-pufrom-Tween 20 (TBST) in dvakrat z 1 ml PBS. Vezane fage eluiramo z inkubacijo kroglice z 1 ml 100 mM trietilamina 8 minut, nato nevtraliziramo z 0,5 ml 1 M Tris, pH 7,4.

ELISA vezavo test aktivnosti

Protitelesa dodamo na Costar 96 vdolbinami pol plošč območja (Corningovimi, Corning, NY, ZDA vozila No. 3690), prevlečene z 1 ug /ml antigena. Po inkubaciji pri sobni temperaturi 1 uro, smo plošče sprali trikrat s TBST in inkubirali z kuncev protiteles-hrenovo peroksidazo anti-humani (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) na protitelesa IgG in podgane anti-HA-HO (Clone F10, Roche Life Science, Basel, Švica) za Fab protitelesa, oz. Plošče smo sprali trikrat tetrametilbenzidina (TMB) peroksidaza substrat (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) dodamo in reakcije smo prekinili z dodatkom 1 N žvepleno kislino (DUKSAN, ANSAN, Koreja). Absorbanco pri 450 nm smo merili z uporabo Victor X3 instrument (PerkinElmer, Waltham, MA, ZDA).

Površinska plazmonska resonanca analiza

k
_{off analizo Fab proteinov, HER2-ECD-His protein smo imobilizirali na površino senzorja CM5 čipa (GE Healthcare) metodi amin sklopke pri približno 2,000 odzivnih enot (RU). Očiščene Fab proteine ​​smo injicirali v 2 ig koncentracije /ml in s pretokom 50 ml /minuto. Za k
off analizo protiteles IgG, kozji anti-človeški IgG (γ) (Invitrogen, Kat. Št H10500) je imobiliziran na senzorski čip CM5 uporabo amin sklopke in protitelesa so zajeti v 1 mg /ml 4 minute in stabiliziran 5 minut pri pretoku 50 ml /minuto. HER2-ECD-His protein smo injicirali v koncentraciji 160 nM. Za afiniteto meritve, so protitelesa zajeti na približno 50 RU s kozjim anti-človeški IgG (y) imobiliziran na CM5 čipu. HER2-ECD-His protein smo injicirali v koncentracijah v območju od 0 do 640 nM. Sensorgrams so bili pridobljeni pri vsaki koncentraciji in ovrednotili z uporabo programske opreme BIAevaluation. Za epitop binning, je bil IgG oblika hz1E11 imobiliziramo na ločenih CM5 senzor čip površine na približno 1000 odzivne enote. HER2-ECD-His (320 nm) in protitelesa (1 mg /ml) smo zaporedoma dodamo 4 minute in stabiliziran 5 minut pri pretoku 50 ml /minuto.}

preživetja celic test

Celice smo zasejali v 96-vdolbinami (Corningovimi) v 10% FBS, ki vsebuje medij in pre-kultiviramo 24 ur. Celice so zdravili s protitelesi v navedenih koncentracijah in kulture za 4 dni. WST-1 reagent (Dogna EZ-Cytox; Daeil Lab storitev, Seoul, Korea) je bila uporabljena za merjenje sposobnosti preživetja celic. Relativna viabilnost celic smo izračunali tako, da se absorbanca za vsak ter s povprečne absorbance PBS, zdravljenih vrtin v vsako ploščo.

ksenotransplantskih študija

gole ženske miši (Daehan BioLink, Chungbuk, Korea ) so subkutano injiciramo v levem delu bok s 5 x 10 ^{6 NCI-N87 celic v Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA). Tumorji pustimo, da rastejo do približno 200 mm 3 velikosti in miši so nato naključno razdelili v skupine. Živali so prejele intraperitonalno protiteles na označenih dozah dvakrat na teden. volumne tumorjev smo izračunali po formuli (L x W x W) /2, pri čemer L predstavlja največji premer tumorja in W predstavlja najmanjši premer tumorja. Dvosmerni ponavljajoče se ukrepe ANOVA sledi Bonferroni pošti testu je bila izvedena za statistično analizo študij tumorskih growth.All živali so bile izvedene v skladu s smernicami NHI "priročnik za oskrbo in uporabo živali" in odobrenim protokolom ga prejeli Odbor družbe Zavod za varstvo živali in uporaba.}

Rezultati

Humanizacija od 1E11 s CDR-cepljenjem človekovih reproduktivnih genov

za razvoj humanizirano protitelo, VH in VL izvedla sekvence glodalca 1E11 smo primerjali s človeško zarodne linije v in J genov repertoarjev uporabo IMGT /v-Quest analize orodij [24]. Za težke verige, IGHV3-48 * 03 in IGHJ4 * 01 razstavljena najvišjo homologijo do 1E11 kolegi, delitev 85% in 87% identitete oz. Za lahke verige, človeške IGKV1-39 * 01 in IGKJ1 * 01 geni prikazana identiteto 80% in 81% oz. Ti človeški geni so bili izbrani kot akceptor sekvenc za cepitev murinih CDR. Med Vernier območja, ki je sestavljena iz ostankov v okvirnem regiji, ki so vključene v predstavitvi CDR struktur s podpiranjem CDR zanke [18, 25], le en ostanek na položaju 49 _{H težke verige razlikovala med mišjim in človekovih zaporedja. Zato, humanizirano 1E11, hz1E11, ima samo eno mišje ostanek v okvirnih regijah (slika 1).}

Vezava dejavnost hz1E11 na zunajcelične regije (ECD) o bili HER2 ki je enakovredna ch1E11 (slika 2A), in afiniteta trastuzumaba je ch1E11 in hz1E11 3 nM, 23 nM, in 23 nM. Prav tako so potrdili, da hz1E11 vezan na sub-domene IV, kot je starševski ch1E11. Trastuzumab se veže tudi na sub-domene IV [26]. vitro
antiproliferativne dejavnosti hz1E11 kot edino sredstvo in v kombinaciji s trastuzumabom so bili tudi enakovredna tistim ch1E11 (slika 2C). V prejšnji raziskavi [22] se je poročalo, da je ch1E11 in vivo
protitumorsko aktivnost primerljiva s trastuzumaba kot edino sredstvo, in kombinacija ch1E11 in trastuzumaba je povzročilo indeksu tumor regresije (TGI) z dne 95,1%. Podobno hz1E11 saj so imeli eno samo sredstvo podobna in vivo
protitumorsko aktivnost trastuzumab (S1 Fig) in kombinacijo hz1E11 s trastuzumabom je pokazala tudi od odmerka odvisno aktivnost proti tumorjem v modelu NCI-N87 ksenogenskega miške ( fig 2D). Protitelesa kombinirano zdravljenje z 1 mg /kg vsaka od hz1E11 in trastuzumab povzročila podobno anti-tumorske dejavnosti s trastuzumabom samim zdravljenjem pri 10 mg /kg, in na 2,5 mg /kg kombinaciji in nad sedež tumor stabilizirani ali začeli mine (statistično znatne razlike [ P
< 0,05] opazili med 2,5, 5 in /kg kombinacije 10 mg). Ti rezultati kažejo, da ima hz1E11 z afiniteto in biološka aktivnost enakovreden ch1E11 in da hz1E11 poveča protitumorsko aktivnost trastuzumaba, kadar se uporablja v kombinaciji.

alanin skeniranje CDR-H3 in CDR-L3

za identifikacijo kritičnih ostanke interakcije antigen-protitelo, je alanin skeniranje mutageneza izvaja v CDR3 regije težkih in lahkih verig (CDR-H3 in CDR-L3). Učinki mutacij so bili ocenjeni z analizo vezavno aktivnost očiščenih Fab proteinov s posrednim ELISA. V CDR-H3, alanin zamenjavo na položaju Gly98 _{H ukiniti vezavo Fab na HER2 in G97 HA in T99 HA mutanti so kazali zmanjšano aktivnost vezave (slika 3A). V CDR-L3, imeli alanin substitucije precej manjše učinke (slika 3b). k
off vrednosti alanin skeniranja mutanti so bili analizirani s SPR proti immbolized HER2-ECD beljakovin. Potrdili smo, da je težka veriga G98A mutant povsem izgubila zavezujoče dejavnosti in sosednjih T99 HA in G97 HA mutanti povzročila 32-kratno in 17-krat povečala k
Mejne vrednosti oziroma (slika 3C). Ti rezultati kažejo, da H je težka veriga Gly98 funkcionalno kritična in njegove sosednje ostanki so tudi funkcionalno pomembne za interakcijo antigen-protitelo.}

Affinity zorenje hz1E11

je bila izvedena Affinity zorenje hz1E11 z gradnjo težkih ali lahkih verig CDR3 variantnih knjižnic, ki mu sledi izbor ravnotežne knjižnic faga protiteles. Za lahke verige, ostanki glutamin na položajih 89 _{L in 90 L niso raznovrsten, saj je glutamin pogosto pojavljajo na teh položajih devetih amino kislin longCDR-L3 zaporedja na 59% in 73% frekvenc oz [ ,,,0],27]. Položaji 91 L-94 L so bili randomizirani uporabo NNK degenerirano kodon (L-NNK). Za težke verige, pozicionira 95 H -100a H bile naključno pomočjo XXS kodon (H-XXS), zasnovano tako, da je na prvi in ​​drugi nukleotidne položaje raznovrsten kodon baze divjega tipa pojavili pri 70 % možnosti, vsaka od ostalih treh podlagah pojavile pri 10% frekvenci, in tretje črke kodone sintetiziramo z uporabo ekvimolarne zmesi G in C (slika 4A). Visoko afiniteto veziva, so bili izbrani iz visoko strogosti ali nizko strogosti potuje po uličici (tabela 1).}

Glede na nizko strogost potuje po uličici z L-NNK knjižnice, v katerem 100% pri drugem, tretje, in četrte okrogle izhodne kloni pregledani so bili ELISA je pozitiven, za visoke strogost obračanje četrti krog izhod ni prineslo vezivo na vse, in le ena tretjina tretjega kroga izhodnih kloni so ELISA pozitiven (tabela 1). Izbrani klonov iz knjižnice CDR-L3 vključene številne sekvence, ki so imele vse štiri randomizirane pozicije CDR-L3 mutiral, za razliko od CDR-H3 knjižnic od katerih je večina izbranih klonov obdržal vtipkajte zaporedje narave v položajih 97 _{H -100 H (glej spodaj). Različne strategije slikanje panorame prinesla različne vzorce bogatenja zaporedje. Na primer, lahka veriga varianta klon 1A12 (Q 89LQNAYAPWT 97L) smo izolirali iz visoko strogosti izpiranje vendar ne iz nizko strogosti izpiranje in težka veriga varianta klon 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) je bila tudi izbrana le iz visoko strogost potuje po uličici. Zanimivo je, da 59% edinstvenih protiteles v 4 ^{th imela izhod z nizko strogosti potuje po uličici L-NNK knjižnice za alanin na položaju 92 L, v skladu z analizo alanin skeniranja (slika 4B).}}

Skoraj vsi kloni, ki so bili izolirani iz knjižnice H-XXS imel isto sekvenco na 97 _{H -100 H kot starševsko klon, in jasno pokazala obogatitev Asn-Tyr sekvence na 95-96. Nadalje ocenili prispevek ostankov CDR-H3, da antigen-protitelo vezave smo dodaten CDR-H3 knjižnica izdelani z dvojnim NNK naključno kodonskega skeniranje CDR-H3 (H-2aa, slika 4A). V nizko strogosti slikanje panorame, mutanti na položajih 95 H, 96 H, 99 H, 100 H in 100a H so bili izbrani v prvem krogu panorama, vendar le mutanti na položajih 95 H in 96 H so obogatene z izhodom na četrtem krogu (tabela 1). Nismo mogli odkriti mutanti na položajih Gly97 H in Gly98 H v vseh strategijah slikanje panorame in izhodov.}

afinitete in vezavo aktivnost izbranih klonov

Za oceno kombinacijsko učinek of-afiniteto dozorela variante za težke in lahke verige, so bili proizvedeni IgG protitelesa s kombinacijami afiniteto dozorela težkih in lahkih verig in njihovo k
_{off vrednosti so bile določi s pomočjo SPR analize (tabela 2). Med dvema svetlobnima variant verige in dveh težkih variant verige, 1A12 pridobljen iz L-NNK pokazali največje izboljšanje (16-kratno). Kombinacija lahke verige 1A12 z optimizirano težke verige klona 1B12 je povzročila 24-kratno izboljšanje k
off preko starševskega hz1E11, medtem ko je za druge kombinacije k
off vrednosti so bile podobne ali večji od 1A12. Ker je 1,5-krat dodatne izboljšave s kombinacijo L-1A12 + H-1B12 ni bistveno velik bili kloni 1A12 in 1F11 (variante lahke verige) izbrana za nadaljnjo karakterizacijo zmanjšali razliko zaporedno protiteles afiniteto poravnana s starševsko klon. Disociacija konstante za afiniteto dozorela klonov, prav tako določena z SPR analizo, je bilo več kot 10-krat nižja od starševskega klon hz1E11 in primerljiv s tistim trastuzumaba (tabela 3).}

Da bi ugotovili, ali je afiniteta -matured hz1E11 kloni se vežejo na isti antigen, kot je starševski hz1E11, vezavo 1A12 in 1F11 s HER2-ECD, ki je bil predhodno vezan na hz1E11 smo analizirali s SPR. Oba kloni niso mogli veže na monomerne HER2-ECD-njegovega proteina z imobiliziranim 1E11 ker trastuzumab lahko (slika 4C) ujet. Poleg tega je bilo potrjeno, da je 1A12 epitop ne sovpada z trastuzumaba (slika 4D). Kloni 1A12 in 1F11 tudi veže na sub-domene IV kot starševske klon hz1E11 (slika 4E). Ti podatki kažejo, da epitopi 1A12 in 1F11 niso spremenili v postopku afiniteto dozorevanja.

Učinkovitost afiniteto dozorela hz1E11 klonov

Tako 1A12 in 1F11 protitelesa so pokazale nekoliko povišane antiproliferativne dejavnosti kot monoterapiji v primerjavi z hz1E11 na NCI-N87 in OE-19 vrstic želodčni rak celic, ki izražajo HER2 (slika 5a in 5b), ker je bil v kombinaciji s trastuzumabom njihove anti-proliferativnih dejavnosti boljše od tega trastuzumab sam in enakovredno hz1E11 plus trastuzumab . je bil potrjen antiproliferativno aktivnost 1A12 in 1F11 in vivo
in NCI-N87 ksenotransplantskih modelu. Superior protitumorsko aktivnost je bila očitno v kombinaciji s trastuzumabom tistemu samo vsako sredstvo v obeh modelih ksenotransplantskih (slika 5C).

Pogovor

Kljub nekaterim spodbudnim kliničnih rezultatov, doseženih s HER2 ciljanje trastuzumab protiteles v zdravljenje raka želodca, še vedno so potrebe za bolj močne HER2 ciljno terapij [6]. Kombinacija, ki niso konkurenčna protitelesa, ki ciljajo receptorje, kot HER2, EGFR in VEGFR3, lahko poveča protitumorsko aktivnost v predkliničnih modelih [11-13, 28]. Pertuzumab, drugo-HER2 ciljanje protitelesa, je odobrena za uporabo v kombinaciji s trastuzumabom za zdravljenje metastatskega raka dojke [29]. V prejšnji raziskavi, smo razvili nov HER2 ciljanje protitelesa, 1E11, ki je bilo dokazano, da ima znatno protitumorsko aktivnost kot edino sredstvo in sinergijski učinek v kombinaciji s trastuzumabom in vitro
in in vivo
[22]. aktivnost anti-tumor 1E11 in trastuzumab kombinacija je boljša ne le trastuzumab samega zdravljenja, ampak tudi na kombinacijo pertuzumab in trastuzumaba. V tem poročilu je humanizacijo in kasnejše afiniteta zorenjem miške-hibridoma pridobljen 1E11 monoklonskih protiteles opisano.

Začetni pristope za zmanjšanje možnosti imunogenost nehumanih variabilnih regij, ki jih CDR-cepljenjem v človeški okvir bistveno zmanjša imunogenost terapevtskih protiteles [15, 17]. Superhumanization uporabo okvire človeške zarodne kot predlogo je bila predlagana kot vrhunski metodologijo humanizacije se izognili domnevni efektornih T-celične epitope, pridobljene s somatskimi hypermuations človeškega okvira [30-32]. Predlagano je bilo, da so protitelesa, kodirane z reproduktivnih genskih segmentov strukturno prožen in sposoben prilagoditi vezavo na različne antigene [33-35]. CDR iz mišje 1E11 protiteles, kakor tudi en ostanek v Vernier območju V _{H (Ala49 H) so bili cepljeni na zarodne spremenljivke ljudi in spajanja genov z najvišjo homologijo do starševskega protitelesa (slika 1). Nastali humanizirano protitelo, hz1E11, je pokazala skoraj enako afiniteto in biološko aktivnost do starševskega protitelesa (slika 2).}

Izbor ostankov za naključnega je pomemben korak v ciljni popačenosti pristopu afinitetno zorenje zaradi praktičnih omejitev od protiteles velikosti knjižnice in tehnologije za izbor. Alanin skeniranje in silico
analizi zaporedja protitelesa, zlasti v KOP, so uporabni za izbiro ciljnih ostankov naključnih in olajšati proces zorenja afiniteto. Alanin analizi skeniranja CDR-H3 za hz1E11 je G98A mutant popolnoma izgubil aktivnost vezave in G97A mutant kazali zmanjšano aktivnost vezave (slika 3A). Neposredna sprememba bistvenega ostanka paratope običajno za posledico popolno izgubo sposobnosti vezave protitelesa [26, 33, 36]. Zato smo uporabili bolj konzervativen pristop k CDR-H3 naključnih uporabo bodisi ročno mešano oligonukleotid, da je pristranski proti starševski zaporedju, ali twin NNS naključno kodon skeniranje CDR-H3. Kot je bilo pričakovati od analize alanin skeniranje, skoraj vsi kloni, ki so bili izolirani iz knjižnice CDR-H3 imel sekvenca 97 _{H-100a H enaka kot starševsko klon (G 97HGTAS 100Ah) .}

alanin rezultati skeniranja kažejo, da so vsi ostanki CDR-L3 zanemarljiva, čeprav so nekatere od mutacij se zdi, da zniža afiniteto (slika 3B). Zato so bili štirje položaji CDR-L3 (91 _{L-94 L) povsem naključno uporabo NNK degenerirano kodon je. Analiza sekvence izbranih klonov potrdili alanin analizo skeniranje; Večina izbranih klonov iz knjižnice CDR-L3 so vsi štirje randomizirane pozicije CDR-L3 spremenila iz starševskega ostanka, v nasprotju s CDR-H3 rezultate optimizacije, v kateri je večina izbranih klonov iz knjižnice imele enako zaporedje kot starševski hz1E11 v srednjem delu CDR (tabela 1). Kloni z večino izboljšanje afinitetno prišla iz knjižnice CDR-L3. Verjetno je, da je CDR-H3 hz1E11 že blizu optimalne in najbolj mutacij, zlasti v regiji 97 H-100 H, je škodljiv za vezavno afiniteto, medtem ko je zaporedje CDR-L3 ne optimalno in mutacija v tej regiji lahko privede do bistvenega izboljšanja afinitete. knjižnice Premikanje okna izhodi so L-NNK bila obogatena s kloni s hidrofobno aminokislino na položaju 91 L majhno amino kisline na 92 ​​ L, in aromatske aminokisline pri 93 L. Ta vzorec je nekoliko drugačna od staršev CDR-L3 zaporedja Q 89LQLYSTPWT 97L in spet kaže, da je bil CDR-L3 zaporedje starševskega 1E11 protitelesa optimalna in tako imeli prostor za afinitetno izboljšave.}