PLoS ONE: Ein neuer Polymorphismus Biomarkern rs629367 Verbunden mit erhöhtem Risiko und Schlechte Überleben von Magenkrebs in der chinesischen durch hochreguliert miRNA-let-7a Expression

Abstrakt

Hintergrund

Variant in pri -miRNA könnte beeinflussen miRNA-Expression und reifen Prozess oder Spleißeffizienz, so dass die erbliche Anfälligkeit und Prognose von Krebs zu verändern. Wir wollten miRNA-let-7 Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) mit dem Risiko und Prognose von Magenkrebs (GC) als Vorhersage von Biomarkern und darüber hinaus seine mögliche Mechanismen verbunden sind, bewerten.

Methoden

Ein zweistufiges Fall-Kontroll-Studie wurde konzipiert, vier miRNA SNPs (pri-let-7a-2 rs629367 und rs1143770, pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7f-2 rs17276588) in 107 GC Patienten zu screenen , 107 atrophische Gastritis (AG) und 124 steuert unter Verwendung von PCR-RFLP abgestimmt. Zwei vielversprechende SNPs wurden in weiteren unabhängigen 1949 Proben (einschließlich 579 Magenkrebs-Patienten, 649 atrophische Gastritis und 721 Kontrollen) validiert mit Sequenom Massarray-Plattform und Sequenzierung.

Ergebnisse |

Wir fanden, dass pri-let -7a-2 rs629367 CC Variante Genotyp wurde mit einem erhöhten Risiko von Magenkrebs und atrophische Gastritis von 1,83-fache und 1,86-fach zugeordnet sind. Für Magenkrebs Prognose bei Patienten mit rs629367 CC-Genotyp hatten eine signifikant schlechtere Überlebenszeit als Patienten mit AA-Genotyp (log-rank P
= 0,004). Wir untersuchten weiter die let-7a-Expressionsniveaus in Serum und festgestellt, dass let-7a Ausdruck allmählich für rs629367 AA, CA, CC-Genotyp in der atrophischen Gastritis Gruppe erhöht ( P
= 0,043). Darüber hinaus bestätigte wir diese Erkenntnisse in-vitro-Studie von überexprimierenden let-7a tragen pri-let-7a-2-Wildtyp A oder polymorph-Typ C-Allel ( P
< 0,001).

Schlussfolgerungen

pri-let-7a-2 rs629367 CC-Genotyp das Risiko von Magenkrebs sowie atrophische Gastritis und wurde auch im Zusammenhang mit einer schlechten Überleben von Magenkrebs erhöhen könnte, die möglicherweise durch die reife let-7a zu beeinflussen Ausdruck, und als die Vorhersage Biomarker für die mit hohem Risiko und einer schlechten Prognose von Magenkrebs dienen könnte

Citation:. Xu Q, Dong Q, He C, Liu W, Sun L, Liu J, et al. (2014) Eine neue Polymorphism Biomarkern rs629367 Verbunden mit erhöhtem Risiko und Schlechte Überleben von Magenkrebs in der chinesischen durch hochreguliert miRNA-let-7a Expression. PLoS ONE 9 (4): e95249. doi: 10.1371 /journal.pone.0095249

Editor: Qing-Yi Wei, Herzog Cancer Institute, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 26. Januar 2014; Akzeptiert: 24. März 2014; Veröffentlicht: 23. April 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit durch Zuschüsse aus dem National Key Grundlagenforschung Programm von China unterstützt wird (973 Programm Bezugsnr. 2010CB529304), der National Natural Science Foundation of China (Ref-Nr 31200968) und die Wissenschaft Technologie-Projekt in der Provinz Liaoning (Ref-Nr 2011225002) . Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

MicroRNAs (miRNAs) sind 18-25 Nukleotid (nt) -long, einsträngige nichtkodierende RNA [1]. Jede Veränderung in pri-miRNA, pre-miRNA oder reifen miRNA können sich auf die reifen Prozess und die Funktion der miRNA, was die Expression von hunderten von Proteinen in der Interaktion Weg beeinflussen könnten [2]. Zu einem gewissen Grad spielte die Variante von miRNA einen Teil als "Onkogen" oder "Tumor-Suppressor-Gen" indirekt [3].

let-7 ist die zweite identifizierte miRNA nach der Entdeckung des ersten miRNA, lin -4 [4] - [6]. Die let-7-Familie hat 10 Mitglieder, darunter let-7a-7G lassen, let-7i, miR-98 und miR-202. Die let-7-Familie spielt eine entscheidende Rolle bei der normalen physiologischen Funktion des menschlichen aufrechterhalten wird. Zum Beispiel ist die pri-miRNA von let-7-Familie mit Lin28 kombinieren könnten und unterdrücken das Spleißen Verfahren von Drosha und Dicer, zwei wichtige Restriktionsenzyme im reifen Prozess, der für alle miRNA [7]. Darüber hinaus kann durch Klopfen des Drosha Enzym ganz nach unten miRNA reifen Prozess umfassend zu unterdrücken, fand Kumar et al, dass der Hauptgrund für die Aktivierung und Förderung der malignen Transformation der Zelle die Herabregulation von let-7-Familie Ausdruck war [8]. Obwohl viele frühere Studien weitgehend die biologischen Funktionen von let-7-Familie zu veranschaulichen, beigetragen haben, haben nur wenige Studie über genetische Varianten von Mitgliedern der Familie konzentriert. wenn zwei Individuen ausgewählt wurden zufällig in der Tat können ihre Genome etwa 0,1% Vielfalt zeigen, von denen die häufigste Vielfalt war SNP [9]. Aufgrund der Existenz dieser Verschiedenheiten kann das gleiche Gen zu verschiedenen Genexpression Produkten führen, die in verschiedenen Krankheitsanfälligkeit, erbliche Phänotyp und die Prognose der Erkrankung [10].

Frühere Studien zeigten, dass die pri-miRNA führen könnte SNPs als genetische Marker für die Vorhersage des Krebsrisikos verwendet werden. Zum Beispiel wurde pri-miR-185 rs2008591 mit Risiko für Brustkrebs assoziiert [11]; pri-miR-34b /c rs4938723 wurde mit dem Risiko von hepatozellulären Krebs in Verbindung gebracht [12]. In der vorliegenden Studie, die von Daten von NCBI Bioinformatik Datenbanken, abgeschirmt wir alle SNPs in der primären Vorläuferbereich let-7-Familie (600 bp ±), und fand heraus, dass nur 4 SNPs (pri-let-7a-1 rs10739971, pri -let-7a-2 rs629367 und rs1143770, pri-let-7f-2 rs17276588) hatte Minor Allelfrequenz (MAF) > 5% in der chinesischen Bevölkerung, und sie waren alle tagSNPs in HapMap-Datenbank. Bisher wenige Studien haben die Beziehung zwischen den vier tagSNPs und krankheits Risikoprädiktion Ausnahme schizophrenen Erkrankung [13], nicht-kleinzelligem Lungenkrebs [14] und diabetischer Nephropathie [15] genannt. Ihre mögliche Rolle des Krebsrisikos bei der Vorhersage bleibt weitgehend unbekannt

Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit und eines der am häufigsten vorkommenden Krebs Osten asiatischen und chinesischen Bevölkerung [16] - [18].. Studien haben gezeigt, dass mehrere miRNA SNPs mit Magenkrebsrisiko assoziiert waren [19] - [22]. Ob jedoch die oben erwähnten vier tagSNPs in pri-miRNA-Gene von let-7 wurden mit dem Risiko von Magenkrebs und atrophischer Gastritis in chinesischen Bevölkerung verbunden sind, ob sie als prädiktive genetische Biomarker für Magenkrebs verwendet werden kann, und die spezifische Mechanismus, wie sie die Krankheit Risiko noch geklärt werden müssen regulieren.

in dieser Studie haben wir den Zusammenhang zwischen diesen vier Kandidaten tagSNPs in pri-let-7a und die Anfälligkeit von Magenkrebs und dessen Vorläufer zuerst beurteilt durch die Durchführung ein zweistufiges Fall-Kontroll-Studie in Chinesisch. Inzwischen haben wir untersucht, ob das Risiko-assoziierten Polymorphismus Magenkrebs-Patienten das Überleben trägt zu. Darüber hinaus untersuchten wir die Wirkung des Risikoassoziierten Polymorphismus auf seiner reifen miRNA-Expression im Serum und Magengewebe sowie erforscht seine möglichen regulatorischen Mechanismus Regulierung Krankheitsrisiko und das Überleben bei der Modulation. Durch die vorliegende Studie leiten, hoffen wir, die mögliche Anwendung Aussicht auf die untersuchten SNP als Vorwarnstufe Biomarker für Personen mit hohem Risiko von Magenkrebs und seine präkanzeröse Erkrankung (atrophische Gastritis).

Methoden vorzuschlagen

Patienten und Studiendesign

Dieses Forschungsprojekt wurde von der Ethikkommission des Ersten Affiliated Hospital der China Medical University genehmigt und die Studie wurde in drei unabhängigen, aber miteinander verbundene Teile, einschließlich Risiko, Prognose und Mechanismen Forschung . Das Risiko Teil war zwei Stufen entwickelt, ist man Screening-Phase und die andere Phase validiert. Zur Untersuchung der Assoziation von Kandidaten SNPs mit Magenkrebs und atrophische Gastritis Risiken aufzuklären, retrospektiv die Siebstufe rekrutierte Proben, darunter 338 Fälle, bestehend aus 107 Magenkrebs-Patienten, 107 atrophische Gastritis Fälle und 124 Kontrollpersonen aus dem Ersten Affiliated Hospital der China Medical University zwischen 2005 und 2010. in der validierten Phase untersuchten wir insgesamt 1949 Fälle einschließlich 579 Magenkrebs, 649 atrophische Gastritis und 721 gesunden Kontrollpersonen aus einem Programm Gesundheitscheck für das Screening von Magenkrebs in Zhuanghe der Provinz Liaoning, China oder von den Patienten in der Erste Affiliated Hospital der China Medical University, zwischen 2002 und 2013 alle Themen in dieser Studie wurden endoskopisch und histologisch bestätigt. Die Klassifizierung von Magenkrebs wurde in Darm-Typ und diffus-Typ für Subgruppenanalyse unterteilt, die auf Lauren-Klassifikation beruht [23], [24]. Die Klassifizierung und Sortierung von Gastritis auf dem aktualisierten Sydney-System basiert [25], [26]. Probanden, die endoskopisch und histologisch mit normaler Schleimhaut oder nur minimal Gastritis ohne andere systemische Krankheit oder andere Magen-Krankheiten dienten als Kontrollen bestätigt. Eine schriftliche Zustimmungen wurden von den Patienten gesammelt und Krankengeschichten (wie Alter, Geschlecht, Rauchen und Alkoholkonsum), erhalten durch Fragebogen und die Aufzeichnungen wurden computerisiert als vorherige beschrieben [24].

Um die Assoziation untersuchen Risiko-assoziierten Polymorphismus mit klinisch-pathologische Parameter und das Überleben bei Patienten mit Magenkrebs, wir Daten von 150 Magenkrebs-Fälle verwendet, deren Informationen von Tod oder Überleben zur Verfügung stand. Der Tumor histologischen Grad von der Weltgesundheitsorganisation Kriterien bewertet und Tumoren wurden mit der 7. Auflage des TNM der International Union Against Cancer (UICC) /American Joint Committee on Cancer (AJCC) (2010), basierend auf der postoperativen pathologischen Untersuchung statt . Die Patienten (i) mit Fernmetastasen präoperativ gefunden, (ii) die präoperative Strahlentherapie oder Chemotherapie, oder (iii) mit unvollständigen pathologischen Dateneingaben ausgeschlossen wurden aus der Überlebensanalyse unterzogen. Follow-up wurde 2013 schließlich im August abgeschlossen, 150 Patienten wurden in die Überlebensanalyse einbezogen.

Für die Bewertung der Korrelation zwischen Risiko-assoziierten Polymorphismus und seine miRNA-Expression im Serum, 364 Fälle einschließlich 164 Magenkrebs, 100 atrophische Gastritis und 100 gesunden Kontrollpersonen untersucht. Die Eigenschaften der eingeschlossenen Probanden wurden in Ergänzungs Tabelle S1 gezeigt. Darüber hinaus ist für die Beurteilung der Korrelation zwischen Risiko-assoziierten Polymorphismus und seine miRNA-Expression im Magengewebe, 97 nicht canceous Proben und 94 Magenkrebs Proben wurden von 97 Patienten, die zwischen 2009 Gastrektomie im First Affilicated Hospital of China Medical University unterzog und 2013

Subjekt-Genotypisierung

Genomic DNA extrahiert wurde, wie zuvor mit einigen Modifikationen beschrieben [27]. Der Genotypisierungsassay wurde von CapitalBio (Beijing, China) mit der Sequenom Massarray-Plattform (Sequenom, San Diego, CA, USA) durchgeführt, wie zuvor beschrieben [24]. 5% der gesamten Proben wurden wiederholt Genotypisierung und die Konkordanzrate betrug 100%, was zeigt, dass die Genotypisierung richtig war. Die genauen Materialien wurden in den Ergänzungsmethoden gezeigt.

Der Nachweis von H.pylori Serum-IgG-Titer

Gemäß dem Verfahren in der Literatur beschrieben [28], Serum H. pylori
-IgG-Titer wurde durch Enzym erkannt linked immunosorbent assay (ELISA, Helicobacter pylori IgG-Kit; Biohit, Helsinki, Finnland). Die detaillierten Materialien wurden in den Ergänzungsmethoden gezeigt.

RNA-Extraktion und Echtzeit-PCR-Reaktion für miRNA-Expression in vivo

Das extrahierte miRNA-Methode aus dem Serum und Gewebe verwendet wurde, wie es durch die beschriebene Literatur [29] mit einigen Modifikationen. Die reverse Transkriptionsreaktion wurde One Step Prime Script miRNA cDNA (Perfect Real Time) Kit (Takara Biotechnology Co., Ltd, Dalian, China) und Real-time PCR-Reaktion verwendet miRcute miRNA qPCR-Nachweis-Kit (SYBR) verwendet (TIANGEN Biotech Co ., Ltd, Beijing, China). Die detaillierten Materialien wurden in den Ergänzungsmethoden gezeigt.

Die transiente Transfektion und Echtzeit-PCR-Reaktion für miRNA-Expression in vitro

Die kommerzielle Expressionsplasmid pCMV-MIR-let-7a-2 rs629367- C wurde aus Origene Company (Origene Biotech Co., Ltd, Shanghai, China) erworben. Dieses Plasmid wurde eine ortsspezifische Mutagenese bei -216 von C nach A (pCMV-let-7a-2 rs629367-A) von Sainuo Company (Sainuo Biotech Co., Ltd, Beijing, China) und bestätigt durch Sequenzierung durchgeführt. Und die Kandidaten-Zelllinien wurden die pri-let-7a-2 rs629367 Website Genotyp sequenziert, um zu erforschen, ob eine Variante dieses rs629367 Polymorphismusortes da war. Dann werden die Zelllinien der Wildtyp und auch die niedrigsten zwei let-7a Ausdruck, SGC-7901 und AGS, wurden für die Transfektion ausgewählt (Weitere Details siehe Zusatz Methoden und Ergänzungs Abbildung S2). Die menschlichen Magenkarzinomzelllinie, AGS wurde von der ATCC, American Type Culture Collection, USA und SGC-7901 wurde aus der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China gekauft gekauft. Nach 72 Stunden wurde die Gesamt-RNA aus Zellen extrahiert und Real-time PCR wurde erkannt let-7a-Expression nach der reversen Transkription, um die reife let-7a hergestellt von pCMV-let-7a-2 rs629367-A vs. zum Vergleich verwendet pCMV-let-7a-2 rs629367-C.

Statistik

Die untersuchten vier miRNA-Polymorphismen für Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) unter den Kontrollen getestet wurden. Die kontinuierlichen Variablen wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) und verglichen durch Varianzanalyse dargestellt, während die diskreten Variablen als Frequenzen und Prozentsätze und Vergleich von χ2 Test [24] dargestellt werden können. Multivariate logistische Regression mit Anpassungen für Alter, Geschlecht und H. pylori
Infektion wurde verwendet, um die Assoziation zwischen miRNA Polymorphismen und Krankheitsrisiken zu bewerten. Da Rauchen und Alkoholkonsum fast ein Drittel fehlende Daten hatten, waren als Anpassungsfaktoren nicht geeignet, nur als geschichtete Faktoren für die Analyse der Assoziation zwischen den miRNA-Polymorphismen und Krankheitsrisiken. Univariate und multivariate Analysen wurden von der Log-Rank-Test und dem Proportional-Hazards-Modell Cox durchgeführt. Die Überlebenskurven wurden unter Verwendung der Kaplan-Meier-Methode abgebildet. Multivariaten Analyse wurde durch Zugabe von SNP zu allen klinischen Parametern mit P
<durchgeführt; 0,05. Darüber hinaus wurden die Kopien der miRNA verwendet lg Wert für eine Normalverteilung, und die Wirkung der miRNA-Polymorphismen auf der Expressionsniveaus wurden durch die Varianzanalyse (ANOVA) -Test getestet. Die Korrelation von let-7a-Expression im Serum und Gewebe wurde als Korrelationskoeffizient durch die Korrelationsanalyse gezeigt. Die statistische Analyse wurde mit SPSS Version 16.0 Software durchgeführt (SPSS, Chicago, IL, USA) und in der Screening-Phase, p-Werte < 0,10 wurde als signifikant angesehen, während alle anderen Analysen p-Werte <betrachtet wurde;. 0,05 als signifikant

Ergebnisse |

der Haupteffekt der miRNA-Polymorphismen auf Magenkrebs und atrophische Gastritis Risiko

die Genotyp Frequenzen des untersuchten SNP in der Screening-Phase sind in Tabelle 1 und die Elektrophoretogramms und Sequenzierung Abbildung von diese vier miRNA-Polymorphismen Genotypen wurden in Ergänzungs Abbildung S1 gezeigt. pri-let-7f-2 rs17276588 wurde von der weiteren Analyse ausgeschlossen, weil sie von HWE abgewichen. Zwei SNPs wurden verheißungsvoll betrachtet mit Krankheitsrisiken in Verbindung gebracht werden: die Variante Genotyp Frequenzen von pri-let-7a-1 rs10739971 zwischen atrophische Gastritis und Kontrollgruppe zeigte statistisch signifikanter Unterschied (27,1% vs. 13,7%, P
= 0.018, Tabelle 1) und die Variante Genotyp Frequenzen von pri-let-7a-2 rs629367 zwischen Magenkrebs und Kontrollgruppe zeigte auch Unterschied (1,9% vs.6.5%, P
= 0,094, Tabelle 1) . Wir betrachteten p-Wert < 0,10 als signifikant und ausgewählt diese zwei vielversprechende SNP-Stellen in der validierten Stufe

Um die Zuordnung von pri-let-7a-1 rs10739971 und pri-let-7a-2 rs629367 Polymorphismen bestätigen. mit Magenkrebs und /oder atrophischen Gastritis Risiken, wir diese beiden SNPs in weiteren 1.949 Fällen in der erweiterten validierten Stufe neu bewertet. Die Frequenzen der Polymorphismen in allen Proben wurden in Ergänzungstabelle S2 gezeigt. Gesunde Kontrollen waren Frequenz abgestimmt auf Magenkrebs und atrophische Gastritis Fälle nach Alter (± 5 Jahre) und Geschlecht (01.01 Uhr). Nach der Frequenzanpassung, wurden nur 501 Magenkrebs und 501 Kontrollen für Magenkrebs Risikoanalyse und 612 atrophische Gastritis und 612 Kontrollen für atrophische Gastritis Risikoanalyse schließlich enthalten. In der erweiterten validiert Stufe die Variante Genotyp Frequenzen von pri-let-7a-2 rs629367 zwischen Magenkrebs und Kontrollgruppe waren statistisch signifikant (6,4% vs. 4,0%, Tabelle 1). Wenn es mit dem gemeinsamen AA-Genotyp verglichen wurde die Variante CC-Genotyp mit einem 1,83-fach erhöhtes Risiko für Magenkrebs assoziiert ( P
= 0,048, 95% CI = 1,01-3,32, Tabelle 1), und war auch in Verbindung mit einem 1,86-fach erhöhtes Risiko für atrophische Gastritis ( P
= 0,032, 95% CI = 1,06-3,28, Tabelle 1). Darüber hinaus wurde die Variante CC-Genotyp mit einem 1,93-fach erhöhtes Risiko für atrophische Gastritis im Vergleich mit dem (AA + AC) Genotypen assoziiert ( P
= 0,021, 95% CI = 1,11-3,36, Tabelle 1) , wir haben jedoch nicht statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen pri-let-7a-1 rs10739971 und Krankheitsrisiken in der validierten Stadium beobachten.

Stratifizierte Analyse und interation Analyse

Um den möglichen Einfluss untersuchen von Alter, Geschlecht und Umweltfaktoren wie Status von H.pylori
Infektion, Rauchen und Alkoholkonsum auf genetischer Effekt, führten wir geschichtete Analysen für pri-let-7a-1 rs10739971 und pri-let-7a-2 rs629367-Polymorphismen auf der Basis dieser Faktoren (Tabelle 2). Wir beobachteten verschiedene Effekte von pri-let-7a-2 rs629367 auf das Krankheitsrisiko in verschiedenen Untergruppen. Statistische Assoziation zwischen CC-Genotyp und erhöhte atrophische Gastritis Risiko wurden bei Frauen ( P
= 0,025, OR [95% CI] = 2,59 [1,13-5,92]), H gefunden. pylori
Serologie-negativen Untergruppe ( P
= 0,036, OR [95% CI] = 1,97 [1,05-3,73]) und in nicht trinken Untergruppe ( P
= 0,023 , OR [95% CI] = 2,44 [1,13-5,26]). Darüber hinaus wurde der CC-Genotyp in Verbindung gebracht werden mit einem erhöhten Magenkrebsrisiko bei Patienten mit alters ≦ 50 Jahre alt ( P
= 0,026, OR [95% CI] = 6,02 [1,24 bis 29,10]) gefunden und H. pylori
Serologie-negativen Subpopulation ( P
= 0,036, OR [95% CI] = 2,02 [1,05-3,90]). Wenn wir jedoch die Wechselwirkungsanalyse zwischen rs629367 SNP und H durchgeführt. pylori
Infektion, Rauchen und Alkohol trinken, keine Wirkung statistische Interaktion gefunden wurde ( P
_{Interaktion = 0,786 und 0,382 bzw. siehe Zusatz Tabelle S3). Kein signifikanter Zusammenhang wurde zwischen pri-let-7a-1 rs10739971 und Magenkrebs oder atrophische Gastritis Risiken in jeder geschichtete Analyse.}

Die Korrelation zwischen pri-let-7a-2 rs629367 Polymorphismus und klinisch-pathologische Parameter und die Länge des Überlebens gefunden von Magenkrebs-Patienten

Durch die Beobachtung von statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen rs629367 und Magenkrebs und atrophische Gastritis Risiko in der Hauptwirkungsanalysen und geschichteten Analysen wir weiter untersucht, ob das Risiko-assoziierten rs629367 mit dem klinisch-pathologische Phänotyp korreliert und prognostische Überleben von Magenkrebs. Die Ergebnisse zeigten, dass keine signifikante Korrelation dieser SNP mit klinisch-pathologischen Parametern, einschließlich der Größe des Tumors, Tumorlokalisation, Borrmann Typ, histologischen Typ, Lauren Typ, TNM-Stadium, Wachstumsmuster, die Tiefe der Invasion, lymphatischen Metastasen gefunden wurde, H.pylori
Infektionsstatus, Rauchen, trinken und Familiengeschichte ( P
> 0,05, siehe Zusatz Tabelle S4), aber dieser SNP wurde im Zusammenhang mit Magenkrebs Überleben gefunden. Die CC-Genotyp Träger zeigte ungünstige Überleben (CC vs. AA 22,2 Monate gegenüber 32,0 Monate) und erhöhte HRs für Magenkrebs-Patienten in univariaten Analyse (CC vs. AA: P
= 0,011, HR [95% CI] = 3,39 [1,33-8,65]; CC vs. AA + AC: P
= 0,005, HR [95% CI] = 3,51 [1,45-8,49]; Tabelle 3 und Abbildung 1-A und - B). Durch mehrere klinisch-pathologischen Parameter anpassen, die mit Magenkrebs Überleben korreliert mögliche Störfaktoren waren (
P ≤0.0001 für Tumorgröße, Borrmann Typ, TNM-Stadium, die Tiefe der Invasion und lymphatischen Metastasierung, siehe Zusatz Tabelle S5), statistisch erhöhte HRs wurden auch für CC-Träger in der multivariaten Analyse (CC vs. AA erhalten: P
= 0,004, HR [95% CI] = 4,48 [1,60 bis 12,60]; CC vs. AA + AC: P
= 0,001, HR [95% CI] = 4,69 [1,84 bis 11,95], Tabelle 3).

Die Korrelation zwischen rs629367 und reifen lassen-7a-Expression im Serum und Magengewebe

um den möglichen Mechanismus rs629367 Polymorphismus zu studieren, um zu Magenkrebs im Zusammenhang untersuchten wir weiter die reife let-7a-Expression in vivo und vitro. Die Patientencharakteristika für die Untersuchung der Expression in Serum und Gewebe ausgewählt wurden, in Tabelle Ergänzungs S6 gezeigt. In Serumspiegel, die von verschiedenen Krankheiten geschichtete fanden wir, dass in atrophische Gastritis Gruppe, die reife let-7a Expression rs629367 AA, CA, CC-Genotyp eine Tendenz der allmählich zunehmenden zeigte, und dieser Unterschied war statistisch signifikant (3,30 ± 0,56 Vs . 3,52 ± 0,55 vs. 3,76 ± 0,34, P
= 0,043, Tabelle 4, Abbildung 2-A). In Gewebeebene untersuchten wir die Auswirkungen auf die let-7a SNP Genotypen auf seiner reifen let-7a-Expression in Gewebe Magenkrebs, und rs629367 AA gefunden, CA, CC-Genotyp zeigte auch eine Tendenz allmählich gesteigert wird, obwohl dieser Unterschied statistisch nicht erreicht Bedeutung (Tabelle 4).

Die reifen Ausdruck let-7a von pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-A und -C

Als erstes wurden die Kandidaten-Zelllinien sequenziert die pri-let-7a-2 rs629367 Website Genotyp und fanden heraus, dass diese Kandidaten-Zelllinien alle rs629367 waren Wildtyp (siehe Zusatz Abbildung S3). Im vitro Ebene, SGC-7901 und AGS-Zelllinien wurden transinfected in zwei Plasmide pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-A und pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-C. Nach 72 Stunden reifen lassen-7a Ausdruck statistische Signifikanz in SGC-7901-Zelllinie ( P
< 0,001, 2-B) hatte. Die Variante C-Allel ausgedrückt eine höhere let-7a, wenn sie mit dem alten A-Allel verglichen. Die AGS-Zelllinie erhielt keine statistische Signifikanz und nur Tendenz in Übereinstimmung mit SGC-7901 zeigte (siehe Zusatz Abbildung S4).

Diskussion

Auf der Basis verschiedener Studien zu reifen miRNAs Funktionen [30], es ist gut anerkannt, dass miRNA eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Krebs als "Onkogen" oder "Tumor-Suppressor-Gen" [31] spielen. Allerdings muss die Beziehung zwischen miRNA-Varianten und das Krebsrisiko sowie die Prognose noch geklärt werden [32]. In der vorliegenden Studie haben wir berichtet, zum ersten Mal, die Verteilungsfrequenzen von vier miRNA tagSNPs (pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7a-2 rs629367 und rs1143770, pri-let-7f-2 rs17276588) in Nord Chinesisch. Wir weiter unabhängig die vielversprechenden Polymorphismusorte validiert und Proben erweitert und fand die Variante CC-Genotyp von pri-let-7a-2 rs629367 erhöht das Risiko von Magenkrebs und atrophische Gastritis bis 1,83 und 1,86-fache, als auch mit einem schlechten Überleben von Magenkrebs-Patienten. Wir erforschten die Wirkung von pri-let-7a-2 rs629367 auf seinen Ausdruck und die möglichen Mechanismen, und darauf hingewiesen, dass der Mechanismus zum Wechsel des reifen let-7a Ausdruck zurückzuführen könnte, die schließlich die Empfindlichkeit und die Prognose für Magen verändern können Krebs. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht über die Beziehung von rs629367 SNP mit der Anfälligkeit und die Prognose von Magenkrebs.

Wie wir wissen, genetische Variationen, die in miRNA Gene einschließlich deren erster und prä-miRNA-Regionen entstehen hätte Gelegenheit mehrere biologische Pfade und Einfluss Krankheitsinzidenz [33] zu beeinflussen. So für die Vorhersage Krebsrisiko [32], [34] in erster und pre-miRNA-Polymorphismen als genetische Marker können, die mehr Vorteile und Stärken haben als Gen-Polymorphismen Codierung bei der Vorhersage von potentiellen verwendet werden, da miRNAs häufig in Krebs-assoziierte genomische gelegen Regionen [35] und konnte fast alle kodierenden Gene [36] regeln. Vor kurzem verschiedene Studien konzentrierten sich auf die prä-miRNA-Polymorphismen auf der Stamm-Schleife befindet, wie Pre-mir-196a2 rs11614913 [37], Pre-mir-146a rs2910164 [38], pre-mir-499 rs3746444 [39], [40], Pre-mir-149 rs2292832 [41], rs895819 pre-mir-27a [42]. Aufgrund der Komplexität der RNA-Raumstruktur, zunehmende Aufmerksamkeit hatte SNP auf pri-miRNA gezahlt worden ist. Der Vertreter pri-miRNA SNPs waren pri-miR-185 rs2008591 mit Brustkrebs in Verbindung gebracht [11], pri-miR-34b /rs4938723 c mit hepatozellulärem Krebs in Verbindung gebracht [12], pri-miR-30c rs928508 [22] und pri-miR -938 rs2505901 [43] mit Magenkrebs in Verbindung gebracht. let-7-Familien waren die meisten früheren identifizierten miRNAs [4] und eine entscheidende Rolle spielen, um die normale physiologische Funktion des menschlichen aufrechtzuerhalten. Durch die Verwendung von NCBI Bioinformatik Datenbanken, fanden wir vier SNPs in der primären Vorläuferbereich let-7-Familie (pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7a-2 rs629367 und rs1143770, pri-let-7f-2 rs17276588) hatte Minor Allelfrequenz (MAF) > 5% in der chinesischen Bevölkerung, die alle tagSNPs aber ihr Potenzial Vorhersage- Rollen waren unklar waren. In der vorliegenden Studie wurde durch das Screening und die Validierung von zwei Stufen Studie fanden wir zunächst, dass unter 4 tagSNPs, pri-let-7a-2 rs629367 Polymorphismus mit Anfälligkeit von Magenkrebs (die Variante CC-Genotyp von pri-let-7a-2 verbunden war rs629367 erhöht das Risiko von Magenkrebs und atrophische Gastritis bis 1,83 und 1,86-fach). Diese pri-let-7a-2 rs629367 SNP in Downstream-3'-UTR angeordnet wurde, die die nächste SNP mit den reifen miRNA Gene unter den vier Screening-SNPs war, und es wäre ein neuer Biomarker bei der Vorhersage von Magenkrebsrisiko sein.

Wir führten weitere eindimensionale und mehrdimensionale proportional-Hazards-Regression Cox-Analyse der Follow-up-Daten, die die Verbände der pri-let-7a-2 rs629367 SNP mit Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit Magenkrebs zu erkunden. Konsequent signifikante Ergebnisse wurden von uni- und multivariaten Cox-Modelle (Tabelle 3) beobachtet. Die pri-let-7a-2 rs629367 Variante CC-Genotyp Träger zeigten erhöhte HR mit einem P
-Wert von 0,011 (HR = 3,39) und 0,005 (HR = 3,51), wenn sie mit AA-Wildtyp und AA im Vergleich + AC Genotyp jeweils in univariaten Analyse. Da mehrere klinischen Parametern wesentlich zur Gesamtmagenkrebs Überleben beigetragen ( P ≤0.0001 für Tumorgröße
, Borrmann Typ, TNM-Stadium, die Tiefe der Invasion und lymphatischen Metastasierung), führten wir Analyse mit Anpassung für die potenziellen Störfaktoren in die multivariate Analyse. Schließlich fanden wir die P
-Wert dieses rs629367 SNP war signifikant und statistische HRs wurden ebenfalls erhöht (CC vs. AA: P
= 0,004, HR = 4,48; CC vs. AA + AC: P
= 0,001, HR = 4,69, respectively), was darauf hindeutet, dass pri-let-7a-2 rs628367 kann ein unabhängiger Risikofaktor für Magenkrebs Prognose sein

Mehrere Studien. ergab, dass miRNA-Polymorphismen miRNA Verarbeitung und die Expression von reifen miRNA und spielen eine Rolle in der Karzinogenese [12], [33] nicht beeinträchtigen. Um den möglichen Mechanismus rs629367 Polymorphismus zu studieren, um zu Magenkrebs im Zusammenhang, die in dieser Studie untersuchten wir die Wirkung von pri-let-7a SNP auf dem reifen let-7a-Expression in vivo und vitro. Controlling für den Krankheitsfaktor, wir im Serum atrophische Gastritis Gruppe gefunden, die reife let-7a Ausdruck rs629367 AA, CA, zeigte CC-Genotyp einen signifikanten Anstieg allmählich ( P
= 0,043, Tabelle 3). Dies könnte teilweise das Phänomen zu erklären, dass die Variante CC-Genotyp des rs629367 einer höheren Frequenz Verteilung hatte in atrophische Gastritis Gruppe als in der Kontrollgruppe (6,2% vs. 3,9%, Tabelle 1). Die Beziehung von rs629367 CC-Genotyp mit erhöhter atrophische Gastritis Risiko gezeigt, dass dieses SNP mit atrophischer Gastritis und sogar Magenkrebs möglicherweise durch den Wechsel des reifen miRNA-Expression, die dadurch die Anfälligkeit für Magenkrebs beeinflusst assoziiert war. Auf der Grundlage des Expressionsniveaus in vivo weiter wir die exprimierten Plasmid, das pri-let-7a-2 rs629367 Wildtyp-A-Allel und Variante C-Allel, um die reife let-7a-Expression der beiden unterschiedlichen Allel zu beobachten, konstruiert. Wir fanden, daß nach transinfection, SGC-7901-Zellen enthalten, pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-C-Allel höher demonstrierten reifen let-7a-Expression als die eines Allels ( P
< 0,001, Abbildung 1). Das Ergebnis aus dem vitro Experiment erhalten wurde mit der des vivo übereinstimmend, die auch zeigen, dass die pri-let-7a-2 rs629367 Polymorphismus die reife let-7a-Expression beeinflussen könnten und die Anfälligkeit für Magenkrebs zu verändern. Mehrere Studien berichtet, dass let-7a Tumorsuppressor war [44], [45]. Wir vermuteten, dass die Variation von A bis C könnte seine ursprüngliche Funktion des Tumors unterdrückende Verlust, der für die Prognose Magenkrebsanfälligkeit und was zu einer schlechten Überleben verändern könnten.

Magenkrebs eine multifaktorielle Erkrankung, die durch genetische Veranlagung verursacht wird, sowie Umweltfaktoren [46]. Um den möglichen Einfluss von Alter, Geschlecht und Umweltfaktoren wie Status von H.pylori
Infektion, Rauchen und Alkohol untersuchen auf genetische Wirkung trinken, untersuchten wir die Effekte möglicher Einflussfaktoren auf dieser pri-let-7a -2 rs629367 SNP und fand pri-let-7a-2 rs629367 wurde nur mit der Krankheit verbundenen Risiken in H. pylori
Serologie-negativen Patienten-Gruppe und bei abstinenten Gruppe. In H. pylori
Serologie-negativen Patienten, die OPs für die Vereinigung von rs629367 SNP und atrophische Gastritis und Magenkrebs erhöhten Risiken 2,12 und 1,97-fach zu sein, die höher sind als die RUP in den ganzen Fällen war (1,83 und 1,86-fache, beziehungsweise) . Jedoch gab es keine statistische Signifikanz in H. pylori
Serologie-positiven Patienten. In ähnlicher Weise wurde dieses Phänomen auch in der geschichteten Analyse durch das Trinken beobachtet: in abstinenten Gruppe, die OR für die Assoziation von rs629367 SNP und atrophische Gastritis Risiko erhöht 2.39 Falte zu sein, während es keine statistische Signifikanz in Trink-Gruppe war. Dies kann sein, weil die H.pylori
und Trinken mit dem Auftreten von Magenkrebs in Verbindung gebracht wurden. Brenner et al. war eine notwendige Ursache für Magenkrebs [47], und Tramacere et al hatte die Hypothese aufgestellt, dass H.pylori
. festgestellt, dass es eine starke Verbindung zwischen trinken und das Auftreten von Magenkrebs war [48], [49]. Daher machte die Entfernung dieser beiden Umweltfaktoren die OPs höher als die gesamten Proben zu analysieren.

• PLoS ONE: Die NOD-like Rezeptor Signalgebung Pathway in Helicobacter-pylori-Infektion und verwandte Magenkrebs: Eine Fall-Kontroll-Studie und Gene Expression Analysen
• PLoS ONE: Die laparoskopische Spleen-Preserving Splenic Hilar Lymphadenektomie Aufgeführt von den perigastrischen Fascias Nach und die intrafaszialen Raum für erweiterte Ober-Dritte Magenkrebs