PLoS One: un nuevo polimorfismo rs629367 biomarcador asociado con un aumento del riesgo y escasa supervivencia del cáncer gástrico en China hasta reguladas por la expresión de los genes miARN-let-7a

Extracto

Antecedentes

Variant en pri-miRNA podrían afectar a la expresión de los genes miARN y el proceso de madurez o la eficiencia de empalme, alterando así la susceptibilidad hereditaria y pronóstico del cáncer. El objetivo fue evaluar los genes miARN-let-7 polimorfismos de nucleótido único (SNP) asociados con el riesgo y pronóstico del cáncer gástrico (CG) como la predicción de biomarcadores, y además, sus posibles mecanismos.

Métodos

Un estudio de casos y controles en dos etapas fue diseñado para la detección de cuatro miARN SNPs (pri-let-7a-2 rs629367 y rs1143770, pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7F-2 rs17276588) en 107 pacientes con cáncer gástrico , 107 gastritis atrófica (AG), e igualó 124 controles usando PCR-RFLP. Dos SNPs prometedores fueron validados en otros independientes de 1949 muestras (incluyendo 579 pacientes con cáncer gástrico, gastritis atrófica 649 y 721 controles) que utilizan la plataforma Sequenom MassARRAY y secuenciación.

Resultados

Se encontró que el pri-let -7 bis-2 rs629367 genotipo CC variante se asoció con un mayor riesgo de cáncer gástrico y gastritis atrófica por 1,83 veces y 1,86 veces, respectivamente. Para el pronóstico del cáncer gástrico, los pacientes con genotipo CC rs629367 tenían una supervivencia significativamente peor que los pacientes con genotipo AA (log-rank P
= 0,004). Además, investigó los let-7a niveles de expresión en suero y encontró que la expresión let-7a eleva gradualmente para rs629367 AA, CA, genotipo CC en el grupo de gastritis atrófica ( P = 0,043
). Por otra parte, se confirmó estos resultados en estudios in vitro mediante la sobreexpresión de let-7a llevar pri-let-7a-2 de tipo salvaje o un alelo de tipo polimórfico C ( P Hotel < 0,001)

Conclusiones

pri-let-7a-2 genotipo CC rs629367 podría aumentar el riesgo de cáncer gástrico, así como la gastritis atrófica y también se asoció con una pobre supervivencia de cáncer gástrico, lo que posiblemente afectando a la madura let-7a expresión, y podría servir como un biomarcador para predecir de alto riesgo y el mal pronóstico del cáncer gástrico

Visto:. Xu Q, Q Dong, Él C, Liu W, L Sun, Liu J, et al. (2014) Un nuevo biomarcador polimorfismo rs629367 asocia con mayor riesgo y escasa supervivencia del cáncer gástrico en China por arriba Regulado-expresión de los genes miARN-let-7a. PLoS ONE 9 (4): e95249. doi: 10.1371 /journal.pone.0095249

Editor: Qing Yi-Wei, el Instituto del Cáncer de Duke, Estados Unidos de América

Recibido: 26 Enero, 2014; Aceptado: March 24, 2014; Publicado: 23 Abril 2014

Derechos de Autor © 2014 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo con el apoyo de subvenciones del Programa de Investigación básica clave Nacional de China (973 Programa Ref. 2010CB529304), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Ref Nº 31.200.968), y el Proyecto de Tecnología de la Ciencia en la provincia de Liaoning (Ref Nº 2011225002) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Los microARN (miRNA) son 18-25 nucleótidos -long (nt), el ARN no codificante de una sola cadena [1]. Cualquier variación en el pri-miARN, pre-miARN o miARN maduro puede afectar el proceso de madurez y la función de los genes miARN, lo que podría afectar aún más la expresión de cientos de proteínas en la vía de la interacción [2]. En cierta medida, la variante de los genes miARN jugó un papel como un "oncogén" o "gen supresor tumoral" indirectamente [3].

let-7 es la segunda miARN identificado tras el descubrimiento de la primera miARN, lin -4 [4] - [6]. La familia let-7 tiene 10 miembros incluyendo let-7a a let-7 g, let-7i, miR-98 y miR-202. La familia let-7 desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la función fisiológica normal del ser humano. Por ejemplo, el pri-miARN de let-7 de la familia podría combinar con Lin28 y suprimir el procedimiento de empalme de Drosha y Dicer, dos importantes enzimas de restricción que involucran en el proceso maduro para todos los genes miARN [7]. Además, derribando la enzima Drosha la supresión de todo el proceso madura miARN integral, Kumar et al encontró que la razón principal para la activación y la promoción de la transformación maligna de las células fue la regulación a la baja de la expresión let-7 de la familia [8]. Aunque muchos estudios anteriores han contribuido ampliamente para ilustrar las funciones biológicas de let-7 de la familia, pocos estudios se han centrado en las variaciones genéticas de los miembros de la familia. De hecho, si se seleccionaron dos individuos al azar, sus genomas pueden demostrar aproximadamente 0,1% diversidad, de los cuales la diversidad más común fue SNP [9]. Debido a la existencia de esta diversidad, el mismo gen puede dar lugar a diferentes productos de expresión de genes que podrían resultar en diferente susceptibilidad a la enfermedad, fenotipo hereditario y el pronóstico de la enfermedad [10].

Estudios anteriores demostraron que la pri-miARN SNPs se puede usar como marcadores genéticos para predecir el riesgo de cáncer. Por ejemplo, pri-miR-185 rs2008591 se asoció con el riesgo de cáncer de mama [11]; rs4938723 pri-miR-34b /c se asoció con el riesgo de cáncer hepatocelular [12]. En el presente estudio, mediante el uso de los datos de las bases de datos de bioinformática NCBI, hemos examinado todos los SNPs en la zona principal precursor de let-7 de la familia (± 600 pb), y encontró que sólo el 4 SNPs (pri-let-7a-1 rs10739971, pri rs629367 -let-7a-2 y rs1143770, pri-let-7F-2 rs17276588) tuvieron menor frecuencia de alelos (MAF) > 5% de la población china, y todos ellos eran tagSNPs en la base de datos HapMap. Hasta ahora, pocos estudios han mencionado la relación entre los cuatro tagSNPs y predicción de enfermedad de riesgo con excepción de la enfermedad esquizofrénica [13], el cáncer de pulmón de células no pequeñas [14] y la nefropatía diabética [15]. Su papel potencial en la predicción del riesgo de cáncer sigue siendo en gran parte desconocido

El cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo y uno de los cánceres más frecuentes en Asia Oriental y las poblaciones chinas [16] -. [18]. Los estudios han mostrado que varios genes miARN SNPs se asocia con el riesgo de cáncer gástrico [19] - [22]. Sin embargo, si los cuatro tagSNPs antes mencionado en pri-miARN genes de let-7 se asocia con el riesgo de cáncer gástrico y gastritis atrófica en la población china, si puede ser utilizado como un biomarcador genético predictivo para el cáncer gástrico, y la específica mecanismo de cómo regulan el riesgo de la enfermedad todavía necesita ser aclarado.

en este estudio, se evaluó por primera vez la asociación entre estas cuatro tagSNPs candidatos en pri-let-7a y la susceptibilidad del cáncer gástrico y su precursor mediante la realización de un estudio de casos y controles en dos etapas en chino. Mientras tanto, se investigó si el polimorfismo riesgo asociado contribuye a la supervivencia de pacientes con cáncer gástrico. Por otra parte, hemos examinado el efecto del polimorfismo riesgo asociado en la regulación de su expresión miARN maduro en el suero y el tejido gástrico, así como explorar su posible mecanismo de regulación en la modulación de riesgo de enfermedad y la supervivencia. Mediante la realización de este estudio, esperamos proponer el potencial prospecto aplicación del SNP estudiado como un biomarcador de preaviso para las personas con alto riesgo de cáncer gástrico y su enfermedad precancerosa (gastritis atrófica).

Métodos

pacientes y diseño del estudio

Este proyecto de investigación fue aprobado por el Comité ético de la primer hospital Afiliado de la Universidad médica de china y el estudio se divide en tres partes independientes pero relacionados, incluido el riesgo, pronóstico y los mecanismos de investigación . La parte del riesgo fue dos etapas diseñadas, uno es el cribado fase y el otro se valida el escenario. Para dilucidar la asociación de SNPs candidatos con cáncer gástrico y riesgos gastritis atrófica, la etapa de clasificación reclutó a posteriori muestras incluyendo 338 casos, que consiste en 107 pacientes con cáncer gástrico, 107 casos de gastritis atrófica y 124 controles emparejados desde el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China entre 2005 y 2010. en la etapa validado, se investigó un total de 1949 casos incluyendo 579 cáncer gástrico, gastritis atrófica 649 y 721 controles sanos a partir de un programa de control de salud para la detección del cáncer gástrico en Zhuanghe de la provincia de Liaoning, china o de los pacientes en el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de china, entre 2002 y 2013. Todos los sujetos de este estudio fueron por vía endoscópica e histológicamente confirmado. La clasificación del cáncer gástrico se divide en tipo intestinal y difuso de tipo para el análisis de subgrupos, que se basa en la clasificación de Lauren [23], [24]. La clasificación y la clasificación de la gastritis se basan en el Sistema de Actualización de Sydney [25], [26]. Los sujetos que fueron endoscópica e histológicamente confirmado con la mucosa normal o gastritis única mínima sin otras enfermedades sistémicas u otras enfermedades del estómago sirvieron como controles. consentimientos informados escritos fueron recogidos de los pacientes y las historias médicas (incluyendo edad, sexo, tabaquismo y consumo de alcohol) obtenida mediante un cuestionario y los registros fueron informatizadas anterior se describe [24].

Para investigar más a fondo la asociación polimorfismo de riesgo asociado con los parámetros clínico-patológicas y la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico, hemos utilizado los datos de 150 casos de cáncer gástrico, cuya información de la muerte o la supervivencia estaba disponible. El grado histológico del tumor se evaluó mediante criterios de la Organización Mundial de la Salud y los tumores se clasifican empleando la 7ª edición del sistema de estadificación TNM de la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC) /Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC) (2010) basada en un examen patológico postoperatorio . Los pacientes (i) con metástasis a distancia se encuentra antes de la operación, (ii) que se sometieron a radioterapia o quimioterapia preoperatoria, o (iii) con las entradas de datos patológicos incompletos fueron excluidos del análisis de supervivencia. El seguimiento fue completado para agosto de 2013. Finalmente, 150 pacientes fueron incluidos en el análisis de supervivencia.

Para la evaluación de la correlación entre el polimorfismo riesgo asociado y su expresión miARN en el suero, incluyendo 364 casos de cáncer gástrico 164, 100 gastritis atrófica y 100 controles sanos fueron examinados. Las características de los sujetos incluidos se muestran en el cuadro complementario S1. Además, para la evaluación de la correlación entre el polimorfismo riesgo asociado y su expresión miARN en el tejido gástrico, 97 muestras no canceous y 94 muestras cancerosas gástricas se obtuvieron de 97 pacientes que se sometieron a gastrectomía en el Primer Hospital Affilicated de la Universidad Médica de China entre 2009 y 2013.

Asunto del genotipado

El ADN genómico se extrajo como se ha descrito anteriormente con algunas modificaciones [27]. El ensayo de genotipificación se realizó por CapitalBio (Pekín, China) usando la plataforma Sequenom MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, EE.UU.) como se describe anteriormente [24]. 5% de la totalidad de las muestras se genotipo en repetidas ocasiones, y la tasa de concordancia fue del 100%, lo que demuestra que la determinación del genotipo era correcta. Los materiales detallados se muestran en los métodos suplementarios.

La detección de H. pylori en suero-título de IgG

De acuerdo con el método descrito en la literatura [28], suero H. pylori
título -IgG fue detectado por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, kit de IgG contra Helicobacter pylori; Biohit, Helsinki, Finlandia). Los materiales detallados se muestran en los métodos suplementarios.

La extracción de RNA y la reacción de PCR en tiempo real para la expresión de los genes miARN in vivo

Se utilizó el método extraída miARN a partir del suero y el tejido como se describe por el literatura [29] con algunas modificaciones. Se utilizó la reacción de transcripción inversa Un paso Primer Guión miARN ADNc (Perfecto Tiempo Real) Kit (Takara Biotecnología Co., Ltd, Dalian, China) y la reacción de PCR en tiempo real se utilizó el kit de detección miRcute miARN qPCR (SYBR) (Tiangen Biotech Co ., Ltd, Beijing, china). Los materiales detallados se muestran en los métodos suplementarios.

La transfección transitoria y la reacción de PCR en tiempo real para la expresión de los genes miARN in vitro

El plásmido de expresión comercial pCMV-MIR-let-7a-2 rs629367- C se adquirió de la empresa Origene (Origene Biotech Co., Ltd, Shanghai, china). Este plásmido se llevó a cabo una mutagénesis dirigida a -216 de C a A (pCMV-let-7a-2-rs629367 A) por Sainuo Company (Sainuo Biotech Co., Ltd, Beijing, China) y confirmado por secuenciación. Y las líneas de células candidatas se secuenciaron para determinar el genotipo del sitio rs629367-let-7a-2 pri explorar si había alguna variante de este sitio de polimorfismo rs629367. A continuación, las líneas celulares de la de tipo salvaje y también la expresión más baja de dos let-7a, SGC-7901 y AGS, se seleccionaron para la transfección (Más detalles ver Métodos complementarios y Figura suplementaria S2). La línea celular de carcinoma gástrico humano, AGS se adquirió de ATCC, American Type Culture Collection, EE.UU. y SGC-7901 se adquirió en el Banco de Células de la Academia de Ciencias de China, Shanghai, China. Después de 72 horas, el ARN total de células se extrajo y PCR en tiempo real se utilizó para la expresión de let-7a detectado después de la transcripción inversa con el fin de comparar la madura let-7a producido por pCMV-let-7a-2 rs629367-A vs. pCMV-let-7a-2 rs629367-C.

Estadísticas

los cuatro polimorfismos estudiados miARN se pusieron a prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) entre los controles. Las variables continuas se muestran como media ± desviación estándar (SD) y se compararon por análisis de varianza, mientras que las variables discretas fueron representados como frecuencias y porcentajes y se compararon mediante la prueba χ2 [24]. multivariante de regresión logística con ajustes por edad, sexo y H. pylori
la infección se utilizó para evaluar la asociación entre polimorfismos de genes miARN y los riesgos de enfermedades. Debido a que el consumo de tabaco y alcohol tenía casi una tercera faltan datos no eran adecuados como factores de ajuste, como únicos factores de estratificación para el análisis de la asociación entre los polimorfismos de los genes miARN y los riesgos de enfermedades. la supervivencia univariante y multivariante análisis se llevaron a cabo mediante la prueba de log-rank y el modelo de riesgos proporcionales de Cox. Las curvas de supervivencia se asignan mediante el método de Kaplan-Meier. análisis de supervivencia multivariante se llevó a cabo mediante la adición de SNP a todos los parámetros clínico con P Hotel < 0,05. Además, las copias de los genes miARN se utilizaron valor lg para una distribución normal, y el efecto de los polimorfismos de los genes miARN en sus niveles de expresión fueron probados por el análisis de la prueba de varianza (ANOVA). La correlación de la expresión de let-7a en el suero y el tejido se muestra como coeficiente de correlación por el análisis de correlación. El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS versión 16.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.) y en la etapa de clasificación, los valores de p < 0,10 fue considerado significativo, mientras que todos los demás análisis se consideraron los valores de p. < 0,05 como significativo

resultados

principal efecto de los polimorfismos de los genes miARN en el cáncer gástrico y gastritis atrófica riesgo

las frecuencias genotípicas del SNP estudiado en la etapa de clasificación se muestran en la Tabla 1 y la electroforeto- y la secuencia de la figura estos cuatro polimorfismos de los genes miARN genotipos se muestran en la Figura complementario S1. pri-let-7F-2 rs17276588 se excluyó del análisis adicional porque se desvió de HWE. Dos SNPs se consideraron prometedora para ser asociado con los riesgos de enfermedades: las frecuencias de genotipo variante de pri-let-7a-1 rs10739971 entre la gastritis atrófica y el grupo control mostraron diferencia estadística (27,1% vs. 13,7%, P =
0,018, Tabla 1), y la variante frecuencias genotípicas de pri-let-7a-2 rs629367 entre el cáncer gástrico y el grupo de control de la diferencia también mostró (1,9% vs.6.5%, P = 0,094
, Tabla 1) . Se consideró el valor de p < 0,10 como significativo y seleccionaron estos dos SNP sitios prometedores en la etapa validado

Para confirmar la asociación de pri-let-7a-1 rs10739971 y rs629367 polimorfismos pri-let-7a-2. con el cáncer gástrico y /o riesgos gastritis atrófica, que re-evaluado estos dos SNPs en otros casos de 1949 en la etapa de validación ampliada. Las frecuencias de los polimorfismos en todas las muestras se muestran en el cuadro complementario S2. Controles sanos fueron emparejados con el cáncer gástrico y de casos de gastritis atrófica por edad (± 5 años) y sexo (01:01). Después de igualación de frecuencia, únicamente 501 cáncer gástrico y 501 controles para el análisis del riesgo de cáncer gástrico y gastritis atrófica 612 y 612 controles para el análisis de riesgos gastritis atrófica fueron finalmente incluidos. En la etapa validado ampliada, las frecuencias de genotipo variante de pri dejar 7a-2--rs629367 entre cáncer gástrico y grupo de control fueron estadísticamente diferentes (6,4% vs. 4,0%, Tabla 1). Cuando se compara con el genotipo AA común, el genotipo CC variante se asoció con un mayor riesgo 1,83 veces mayor de cáncer gástrico ( P
= 0,048, IC del 95% = 1,01 a 3,32, Tabla 1), y era también asociado con un mayor riesgo 1,86 veces mayor de gastritis atrófica ( P = 0,032
, IC del 95% = 1.6 a 3.28, Tabla 1). Además, el genotipo CC variante se asoció con un mayor riesgo 1,93 veces mayor de gastritis atrófica en comparación con los genotipos (AC AA +) ( P = 0,021
, IC del 95% = 1,11 a 3,36, Tabla 1) sin embargo, no se observó asociación estadísticamente significativa entre-let-7a-1 pri rs10739971 y enfermedades riesgos en la etapa de validación.

análisis estratificado y un análisis iteración

Para investigar más a fondo la influencia potencial de la edad, el sexo y los factores ambientales, como el estado de H. pylori
infección, tabaquismo y consumo de alcohol en efecto genético, se realizó un análisis estratificado por pri-let-7a-1 rs10739971 y pri-let-7a-2 polimorfismos rs629367 en base a los factores (Tabla 2). Hemos observado diferentes efectos de dejar pri-2-7a-rs629367 en el riesgo de enfermedad en diferentes subgrupos. La asociación estadística entre el genotipo CC y un mayor riesgo gastritis atrófica se encontraron en las mujeres ( P
= 0,025, OR [IC del 95%] = 2,59 [1,13-5,92]), H. pylori
subgrupo serología negativa ( P = 0,036
, OR [IC del 95%] = 1,97 [1,05-3,73]), y en el subgrupo de no beber alcohol ( P = 0,023
O [IC del 95%] = 2,44 [1.13 a 5.26]). Además, se encontró el genotipo CC para ser asociado con un mayor riesgo de cáncer gástrico en pacientes con edad ≦ 50 años de edad ( P
= 0,026, OR [IC del 95%] = 6,02 [1,24 a 29,10]) y H. pylori
subpoblación serología negativa ( P = 0,036
, OR [IC del 95%] = 2,02 [1,05-3,90]). Sin embargo, cuando se realizó el análisis de la interacción entre el SNP rs629367 y H. , Se encontró pylori
infección, tabaquismo y consumo de alcohol no afecta la interacción estadística ( P
_{interacción = 0,786 y 0,382, respectivamente, véase el cuadro complementario S3). No se encontró asociación significativa entre el pri-let-7a-1 rs10739971 y cáncer gástrico o riesgos gastritis atrófica en cualquier análisis estratificado.}

Correlación entre el pri-let-7a-2 rs629367 y polimorfismo clínico-patológicas parámetros y duración de la supervivencia de los pacientes con cáncer gástrico

Debido a la observación de asociación estadísticamente significativa entre rs629367 y el cáncer gástrico y el riesgo de gastritis atrófica en el efecto principal analiza y análisis estratificados, que investigó además si el rs629367 riesgo asociado se correlaciona con el fenotipo clínico patológica y la supervivencia de pronóstico del cáncer gástrico. Los resultados mostraron que hay una correlación significativa de este SNP se encontró con clinicopathological parámetros, incluyendo el tamaño del tumor, la localización del tumor, el tipo Borrmann, tipo histológico, el tipo Lauren, estadio TNM, el patrón de crecimiento, profundidad de la invasión, metástasis linfática, H.pylori
estado de infección, fumar, beber, y la historia familiar ( P Hotel > 0,05, véase el cuadro complementario S4), pero este SNP se encontró asociado con la supervivencia del cáncer gástrico. Los portadores del genotipo CC mostraron supervivencia desfavorable (CC vs AA: 22,2 meses frente a 32,0 meses) y el aumento de los CRI para los pacientes con cáncer gástrico en el análisis univariado (CC vs AA: P = 0,011
, HR [95% IC] = 3,39 [1,33-8,65]; CC vs AA + AC: P = 0,005
, HR [IC del 95%] = 3,51 [1,45-8,49]; Tabla 3 y Figura 1-A y - SEGUNDO). Mediante el ajuste de varios parámetros clínico que eran posibles factores de confusión se correlacionaba con la supervivencia del cáncer gástrico ( P
≤0.0001 para el tamaño del tumor, el tipo Borrmann, estadio TNM, la profundidad de la invasión y la metástasis linfática, véase el cuadro complementario S5), estadísticamente el aumento de los CRI se obtuvieron también para los portadores de CC en el análisis multivariante (CC vs AA: P = 0,004
, HR [IC del 95%] = 4,48 [1,60 a 12,60]; CC vs AA + AC: P = 0,001
, HR [IC del 95%] = 4,69 [1,84 a 11,95], Tabla 3).

Correlación entre rs629367 y madurar let-7a expresión en suero y tejido gástrico

con el fin de estudiar el posible mecanismo de polimorfismo rs629367 relacionada con el cáncer gástrico, que investigarse más a la expresión let-7a maduros in vivo e in vitro. características de los pacientes seleccionados para el estudio de la expresión en el suero y el tejido se muestran en el cuadro complementario S6. En el nivel sérico, estratificado por diferentes enfermedades, se encontró que en el grupo de gastritis atrófica, la expresión let-7a madura de rs629367 AA, CA, el genotipo CC mostró una tendencia de aumento gradual, y esta diferencia tuvo una significación estadística (3,30 ± 0,56 frente . 3,52 ± 0,55 vs. 3,76 ± 0,34, P = 0,043
, Tabla 4, Figura 2-A). En nivel de los tejidos, se analizó el efecto de los genotipos SNP let-7a en su madura expresión let-7a en el tejido de cáncer gástrico, y encontramos rs629367 AA, CA, CC genotipo también mostró una tendencia de aumento gradual, aunque esta diferencia no alcanzó estadística significación (Tabla 4).

La expresión let-7a madura de pCMV-MIR-pri-let-7a-2 -C

En primer lugar, se secuenciaron las líneas celulares candidatas rs629367-A y al genotipo del sitio rs629367-let-7a-2 PRI y encontró que estas líneas celulares candidato eran todos rs629367 de tipo salvaje (véase la Figura complementario S3). En el nivel vitro, líneas de células AGS SGC-7901 y se transinfected en dos plásmidos, pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-A y pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-C. Después de 72 horas, madurar expresión-7a dejar que tuvo significación estadística en la línea celular SGC-7901 ( P Hotel < 0,001, Figura 2-B). El alelo variante C expresó un mayor let-7a en comparación con el antiguo Un alelo. La línea de células AGS tiene ninguna significación estadística y sólo mostró la tendencia de conformidad con SGC-7901 (ver Figura suplementaria S4).

Discusión

Sobre la base de varios estudios relativos a las funciones de miRNAs maduros [30], que ha sido bien aceptado que miRNA jugar un papel importante en el desarrollo del cáncer como un "oncogén" o "gen supresor de tumor" [31]. Sin embargo, la relación entre las variantes de los genes miARN y el riesgo de cáncer, así como el pronóstico todavía necesita ser aclarado [32]. En el presente estudio, se informó, por primera vez, las frecuencias de distribución de cuatro miARN tagSNPs (pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7a-2 rs629367 y rs1143770, pri-let-7F-2 rs17276588) en el norte de china. Hemos validado aún más los sitios de polimorfismo prometedores en independiente y muestras ampliado y encontramos el genotipo variante CC de la pri-let-7a-2 rs629367 aumentaron los riesgos de cáncer gástrico y gastritis atrófica a 1,83 y 1,86 veces, así como la asociada con una pobre supervivencia de los pacientes con cáncer gástrico. Además, exploramos el efecto de la pri-let-7a-2 rs629367, en sus manifestaciones y los posibles mecanismos, e indicó que el mecanismo podría debido a la sucesión de la expresión let-7a madura, que puede llegar a alterar la susceptibilidad y pronóstico de los gástrica cáncer. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe sobre la relación entre rs629367 SNP con la susceptibilidad y pronóstico del cáncer gástrico.

Como sabemos, las variaciones genéticas, que surgen en los genes miARN incluyendo sus regiones primaria y pre-miARN , tendría oportunidad de afectar a varias vías biológicas y la incidencia de enfermedades influencia [33]. Por lo tanto, los polimorfismos-miARN pre prioridades y se pueden usar como marcadores genéticos para predecir el riesgo de cáncer [32], [34], que tiene más ventajas y fortalezas que la codificación de polimorfismos de genes en el potencial predecir porque miRNAs con frecuencia situados en genómica asociada a cáncer regiones [35] y podrían regular casi todos los genes de codificación [36]. Recientemente, varios estudios se centraron en los polimorfismos pre-miARN situados en el tallo-bucle, como pre-MIR-196a2 rs11614913 [37], rs2910164 pre-MIR-146a [38], pre-mir-499 rs3746444 [39], [40], pre-mir-149 rs2292832 [41], rs895819 pre-miR-27a [42]. Debido a la complejidad de la estructura del espacio de ARN, se ha prestado cada vez más atención a los SNP en pri-miARN. El representante pri-miARN SNPs fueron pri-miR-185 rs2008591 asociado con el cáncer de mama [11], pri-miR-34b /rs4938723 c asociada con el cáncer hepatocelular [12], rs928508 pri-miR-30c [22] y pri-mir -938 rs2505901 [43] asociados con el cáncer gástrico. let-7 familias eran más miRNAs identificados anteriores [4] y desempeñar un papel crucial en el mantenimiento de la función fisiológica normal del ser humano. Mediante el uso de las bases de datos de bioinformática NCBI, encontramos 4 SNPs en el área principal precursor de let-7 de la familia (pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7a-2 rs629367 y rs1143770, pri-let-7F-2 rs17276588) tuvieron menor frecuencia de alelos (MAF) > 5% de la población china, que eran todos tagSNPs pero sus funciones potenciales predictores no estaban claros. En el presente estudio, mediante el cribado y validación de dos etapas de estudio en primer lugar descubierto que, entre 4 tagSNPs, pri-let-7a-2 rs629367 polimorfismo se asocia con la susceptibilidad de cáncer gástrico (el genotipo variante CC de la pri-let-7a-2 rs629367 aumenta el riesgo de cáncer gástrico y gastritis atrófica a 1,83 y 1,86 veces). Esta pri-let-7a-2 rs629367 SNP se encuentra en aguas abajo 3'-UTR, que era el SNP más cercana con los genes miARN maduros entre los cuatro SNPs de detección, y sería un nuevo biomarcador para predecir el riesgo de cáncer gástrico.

además, realizó un análisis univariante y multivariante de regresión de Cox de riesgos proporcionales de los datos de seguimiento para explorar las asociaciones de pri-let-7a-2 rs629367 SNP con la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico. Constantemente se observaron resultados significativos a partir de modelos de Cox univariante y multivariante (tabla 3). El rs629367 portadores del genotipo variante CC 2 pri-let-7a-mostró un incremento de recursos humanos con un P
-valor de 0,011 (HR = 3,39) y 0,005 (HR = 3,51) en comparación con AA de tipo salvaje y AA genotipo + AC, respectivamente, en el análisis univariado. Debido a que varios parámetros clínico contribuyeron significativamente a la supervivencia global del cáncer gástrico ( P
≤0.0001 para el tamaño del tumor, el tipo Borrmann, estadio TNM, la profundidad de la invasión y la metástasis linfática), se realizó un análisis con ajuste para los posibles factores de confusión en el análisis multivariante. Con el tiempo, encontramos el P-valor
de este SNP rs629367 fue más significativa y también se incrementaron los CRI estadísticos (CC vs AA: P = 0,004
, HR = 4,48; CC vs. AA + AC: P = 0,001
, HR = 4,69, respectivamente), lo que sugiere que pri-let-7a-2 rs628367 pueden ser un factor de riesgo independiente para el pronóstico del cáncer gástrico

Varios estudios. revelaron que los polimorfismos de genes miARN deterioran procesamiento miARN y la expresión de los genes miARN maduro y juegan un papel en la carcinogénesis [12], [33]. Con el fin de estudiar el posible mecanismo de polimorfismo rs629367 relacionada con el cáncer gástrico, en este estudio, se investigó el efecto del SNP pri-let-7a en la expresión let-7a madura tanto in vivo como in vitro. Al controlar por el factor de la enfermedad, se encontró en el grupo de gastritis atrófica en suero, la expresión madura let-7a de rs629367 AA, CA, genotipo CC mostró un aumento significativo gradualmente ( P = 0,043
, Tabla 3). Esto podría explicar en parte el fenómeno de que el genotipo variante CC de rs629367 tenía una frecuencia de distribución mayor en el grupo gastritis atrófica que en el grupo control (6,2% vs. 3,9%, Tabla 1). La relación de rs629367 genotipo CC con un mayor riesgo gastritis atrófica indicó que este SNP se asoció con gastritis atrófica y cáncer gástrico incluso posiblemente por la alternancia de la expresión de los genes miARN maduro, que por lo tanto influye en la susceptibilidad al cáncer gástrico. Sobre la base del nivel de expresión in vivo, se construyó aún más las plásmido expresadas contiene pri-let-7a-2 rs629367 de tipo salvaje alelo A y la variante de alelo C con el fin de observar la expresión let-7a maduro de los dos alelos diferentes. Se encontró que después de transinfection, células SGC-7901 contienen pCMV-MIR-pri-let-7a-2-rs629367 alelo C mostró una mayor madura expresión let-7a que la del alelo A ( P Hotel < 0,001, Figura 1). El resultado obtenido en el experimento in vitro se Accordant con la de la vivo, que también revelan que pri-let-7a-2 rs629367 polimorfismo podría afectar a la expresión let-7a maduro y alterar la susceptibilidad al cáncer gástrico. Varios estudios informaron que let-7a era supresor tumoral [44], [45]. Especulamos que la variación de la A a C podría pérdida de su función original de supresores de tumores, lo que podría alterar la susceptibilidad al cáncer gástrico y conduce a una escasa supervivencia para el pronóstico.

El cáncer gástrico es una enfermedad multifactorial causada por predisposición genética así como los factores ambientales [46]. Para investigar la posible influencia de la edad, sexo y factores ambientales como el estado de
infección por H. pylori, fumar y beber alcohol en efecto genético, que además analiza los efectos de posibles factores de influencia en este pri-let-7a -2 rs629367 SNP, y se encontró pri-let-7a-2 rs629367 solamente se asoció con el riesgo de enfermedades en H. pylori
serología negativa pacientes del grupo y en el grupo de no beber alcohol. En H. pylori
pacientes serología negativa, las RUP para la asociación de SNP rs629367 y la gastritis atrófica y los riesgos de cáncer gástrico elevado para ser 2,12 y 1,97 veces, lo que era más alto que las RUP en el conjunto de casos (1,83 y 1,86 veces, respectivamente) . Sin embargo, no hubo significación estadística en H. pylori
pacientes serología positiva. Del mismo modo, este fenómeno también se observó en el análisis estratificado por la bebida: en el grupo de no beber alcohol, el OR para la asociación de SNP rs629367 y el riesgo de gastritis atrófica elevado a ser 2,39 veces, mientras que no hubo significación estadística en el grupo de la bebida. Esto puede ser debido a que el H. pylori
y beber se asociaron con la incidencia de cáncer gástrico. Brenner et al. había planteado la hipótesis de que H. pylori
era una causa necesaria para el cáncer gástrico [47], y Tramacere et al. encontró que había una fuerte asociación entre el consumo y la incidencia de cáncer gástrico [48], [49]. Por lo tanto, la eliminación de estos dos factores ambientales hizo las RUP más alto que el análisis conjunto de las muestras.

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