PLOS ONE: A New polymorphisme rs629367 Biomarker associés à un risque accru et une faible survie du cancer gastrique en chinois par Up-Regulated miARN let-7a Expression

Résumé

Variante de fond en pri-miARN pourraient influer sur l'expression des miARN et un processus mature ou l'efficacité de l'épissage, modifiant ainsi la susceptibilité héréditaire et le pronostic du cancer. Nous avons cherché à évaluer miARN let-7 polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) associés au risque et le pronostic du cancer gastrique (GC) de prédire les biomarqueurs, et de plus, ses mécanismes possibles.

Méthodes

Une étude cas-témoins en deux étapes a été conçu pour dépister quatre miRNA SNPs (pri-let-7a-2 rs629367 et rs1143770, pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7f-2 rs17276588) dans 107 patients du GC , 107 gastrite atrophique (AG), et appariés 124 contrôles par PCR-RFLP. Deux SNP prometteurs ont été validés dans un autre indépendants de 1949 échantillons (y compris 579 patients gastriques de cancer, 649 gastrite atrophique et 721 contrôles) en utilisant la plate-forme Sequenom MassARRAY et le séquençage.

Résultats

Nous avons trouvé que pri-let -7bis-2 rs629367 CC variante génotype a été associée à un risque accru de cancer gastrique et gastrite atrophique par 1,83 fois et 1,86 fois, respectivement. Pour le pronostic du cancer gastrique, les patients atteints de rs629367 génotype CC avaient survie significativement plus faible que les patients avec le génotype AA (log-rank P
= 0,004). Nous avons également étudié les niveaux d'expression let-7a dans le sérum et a constaté que l'expression let-7a élevé progressivement pour rs629367 AA, CA, génotype CC dans le groupe de la gastrite atrophique ( P
= 0,043). En outre, nous avons confirmé ces résultats dans l'étude in vitro en surexprimant let-7a portant pri-7a-2 let-type sauvage A ou de type polymorphes allèle C ( P
< 0,001).

Conclusions

pri-let-7a-2 rs629367 génotype CC pourrait augmenter les risques de cancer de l'estomac ainsi que la gastrite atrophique et a également été associée à une mauvaise survie du cancer de l'estomac, ce qui peut-être en affectant le let-7a matures expression, et pourrait servir de biomarqueur de prédiction pour risque élevé et un mauvais pronostic du cancer gastrique

Citation:. Xu Q, Dong Q, Il C, Liu W, Sun L, Liu J, et al. (2014) A New polymorphisme rs629367 Biomarker associés à un risque accru et une faible survie du cancer gastrique en chinois par Up-Regulated Expression miARN let-7a. PLoS ONE 9 (4): e95249. doi: 10.1371 /journal.pone.0095249

Editeur: Qing Yi-Wei, Institut Duke Cancer, États-Unis d'Amérique

Reçu le 26 Janvier 2014; Accepté le 24 Mars 2014; Publié le 23 Avril, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Xu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail est soutenu par des subventions du Programme de recherche de base clé nationale de Chine (973 Programme ref no. 2010CB529304), la national Natural science Foundation de Chine (Ref n ° 31200968), et le projet science Technology dans la province du Liaoning (Ref n ° 2011225002) . Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

microARN (miARN) sont de 18-25 nucléotides (nt) -long, ARN non codantes simple brin [1]. Toute variation de pri-miRNA, pré-miARN ou miARN mature peut affecter le processus mature et fonction de miARN, ce qui pourrait affecter davantage l'expression de centaines de protéines dans la voie d'interaction [2]. Dans une certaine mesure, la variante de miARN a joué un rôle comme un "oncogène" ou "gène suppresseur de tumeur" indirectement [3].

let-7 est le deuxième miRNA identifié après la découverte de la première miRNA, lin -4 [4] - [6]. La famille let-7 a 10 membres, y compris laissez-7a de laisser-7g, laissez-7i, miR-98 et miR-202. La famille let-7 joue un rôle crucial dans le maintien de la fonction physiologique normale de l'homme. Par exemple, le pri-miARN de let-7 famille pourrait se combiner avec LIN28 et supprimer la procédure d'épissage de Drosha et Dicer, deux enzymes de restriction importants impliquant dans le processus mature pour tous les miARN [7]. En outre, en abattant l'enzyme Drosha pour supprimer tout le processus d'âge mûr miRNA globalement, Kumar et al ont trouvé que la principale raison de l'activation et la promotion de la transformation maligne des cellules était la régulation négative de l'expression let-7 famille [8]. Bien que de nombreuses études antérieures ont contribué largement à illustrer les fonctions biologiques de let-7 famille, peu se sont concentrées sur l'étude des variations génétiques des membres de la famille. En fait, si deux personnes ont été sélectionnées au hasard, leurs génomes peuvent démontrer environ 0,1% de la diversité, dont la diversité la plus courante était SNP [9]. En raison de l'existence de ces diversités, le même gène peut conduire à différents produits d'expression génique qui pourrait entraîner la sensibilité aux maladies différentes, phénotype héréditaire et le pronostic de la maladie [10].

Des études antérieures ont démontré que la pri-miRNA Les SNP peuvent être utilisés comme marqueurs génétiques pour prédire le risque de cancer. Par exemple, pri-miR-185 rs2008591 était associée à un risque de cancer du sein [11]; pri-miR-34b /c rs4938723 a été associée à un risque de cancer hépatocellulaire [12]. Dans la présente étude, en utilisant des données de bases de données bioinformatiques NCBI, nous avons projeté tous les SNP dans la région de précurseur primaire de let-7 famille (± 600 pb), et a constaté que seulement 4 SNP (pri-let-7a-1 rs10739971, pri rs629367 -LET-7a-2 et rs1143770, pri-let-7f-2 rs17276588) avaient Minor allèle Fréquence (MAF) > 5% de la population chinoise, et ils étaient tous tagSNPs dans la base de données HapMap. Jusqu'à présent, peu d'études ont mentionné la relation entre les quatre tagSNPs et la prévision des maladies à risque, sauf en cas de maladie schizophrénique [13], cancer non à petites cellules du poumon [14] et la néphropathie diabétique [15]. Leur rôle potentiel dans la prédiction du risque de cancer reste largement inconnu

Le cancer gastrique est la deuxième cause de décès par cancer dans le monde et l'un des cancers les plus fréquents en Asie de l'Est et les populations chinoises [16] - [18].. Des études ont montré que plusieurs miARN SNP ont été associés à un risque de cancer gastrique [19] - [22]. Cependant, si les quatre tagSNPs mentionnés ci-dessus dans pri-miRNA gènes de let-7 ont été associés à un risque de cancer gastrique et de gastrite atrophique chez la population chinoise, si elle peut être utilisée comme marqueur biologique génétique prédictif du cancer gastrique et spécifique mécanisme de la façon dont ils régulent le risque de la maladie doivent encore être clarifiées.

dans cette étude, nous avons d'abord évalué l'association entre ces quatre tagSNPs candidats en pri-let-7a et la susceptibilité du cancer gastrique et son précurseur en conduisant une étude cas-témoins en deux étapes en chinois. Pendant ce temps, nous avons examiné si le polymorphisme du risque associé contribue à la survie des patients atteints de cancer gastrique de. En outre, nous avons examiné l'effet du polymorphisme des risques associés à la régulation de l'expression de miARN matures dans les tissus de sérum et de l'estomac, ainsi que exploré son éventuel mécanisme de régulation dans la modulation de risque et la survie maladie. En effectuant la présente étude, nous espérons proposer l'application prospect potentiel du SNP étudié comme un biomarqueur de préalerte pour les personnes ayant un risque élevé de cancer de l'estomac et de sa maladie précancéreuse (gastrite atrophique).

Méthodes

patients et conception de l'étude

Ce projet de recherche a été approuvé par le comité d'éthique de la First Affiliated Hospital de l'Université médicale de la Chine et l'étude a été divisée en trois parties indépendantes mais connexes, y compris la recherche risque, le pronostic et les mécanismes . La partie du risque était deux étapes conçues, on passe au crible la scène et l'autre est validé scène. Pour élucider l'association des SNP candidats atteints d'un cancer gastrique et des risques de gastrite atrophique, la phase de sélection a posteriori recruté des échantillons, y compris 338 cas, constitué de 107 patients atteints de cancer gastrique, 107 cas de gastrite atrophique et 124 témoins appariés du premier hôpital affilié de l'Université médicale de Chine entre 2005 et 2010. dans l'étape validée, nous avons étudié un total de 1949 cas dont 579 cancers gastriques, 649 gastrite atrophique et 721 témoins sains à partir d'un programme de contrôle de santé pour le dépistage du cancer de l'estomac dans Zhuanghe de la province du Liaoning, en Chine ou des patients dans le Premier hôpital affilié de l'Université médicale de Chine, entre 2002 et 2013. Tous les sujets de cette étude ont été endoscopically et histologiquement confirmé. La classification du cancer gastrique a été divisé en intestinal de type et de type diffus pour l'analyse de sous-groupe qui était basée sur la classification de Lauren [23], [24]. La classification et le classement de la gastrite a été basée sur le système de Sydney Mise à jour [25], [26]. Les sujets qui ont été endoscopically et histologiquement confirmés avec la muqueuse normale ou gastrite minime, sans autre maladie systémique ou d'autres maladies de l'estomac ont servi de témoins. Écrit consentement éclairé ont été recueillies auprès des patients, et les antécédents médicaux (y compris l'âge, le sexe, le tabagisme et la consommation d'alcool) obtenues par questionnaire et les documents ont été informatisés que précédemment décrit [24].

Pour approfondir l'association du polymorphisme de risque associé à des paramètres clinicopathologiques et la survie chez les patients atteints de cancer gastrique, nous avons utilisé les données de 150 cas de cancer de l'estomac, dont les informations de la mort ou la survie était disponible. La tumeur de grade histologique a été évaluée par World critères de l'Organisation de la santé et les tumeurs ont été organisées à l'aide de la 7e édition du système de classification TNM de l'Union Internationale Contre le Cancer (UICC) /American Joint Committee on Cancer (AJCC) (2010) basée sur l'examen anatomopathologique post-opératoire . Les patients (i) avec métastases à distance trouvé préopératoire, (ii) qui ont subi une radiothérapie préopératoire ou la chimiothérapie, ou (iii) avec des entrées de données pathologiques incomplets ont été exclus de l'analyse de survie. Suivi a été achevée en Août 2013. Enfin, 150 patients ont été inclus dans l'analyse de survie.

Pour l'évaluation de la corrélation entre le polymorphisme du risque associé et son expression de miARN dans le sérum, 364 cas dont 164 cancers gastriques, 100 gastrite atrophique et 100 témoins sains ont été examinés. Les caractéristiques des sujets inclus ont été présentés dans le Tableau complémentaire S1. En outre, pour l'évaluation de la corrélation entre le polymorphisme du risque associé et son expression de miARN dans le tissu gastrique, 97 échantillons non-canceous et 94 spécimens cancéreuses gastriques ont été obtenus à partir de 97 patients ayant subi une gastrectomie au premier hôpital Affilicated de l'Université médicale de Chine entre 2009 et 2013.
génotypage de

Objet

l'ADN génomique a été extrait comme décrit précédemment, avec quelques modifications [27]. Le test de génotypage a été réalisée par CapitalBio (Beijing, Chine) en utilisant la plate-forme Sequenom MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, USA) comme décrit précédemment [24]. 5% des échantillons entiers ont été à plusieurs reprises génotypés, et le taux de concordance était de 100%, ce qui démontre que le génotypage était correct. Les matériaux détaillés sont montrés dans les Méthodes supplémentaires.

La détection de sérum IgG H.pylori titre

Selon le procédé décrit dans la littérature [28], le sérum H. -IgG titre de pylori a été détectée par immuno-enzymatique (ELISA, kit Helicobacter pylori IgG; Biohit, Helsinki, Finlande). Les matériaux détaillés ont été présentés dans les méthodes complémentaires.

extraction de l'ARN et la réaction PCR en temps réel pour l'expression miRNA in vivo

La méthode extrait miRNA du sérum et le tissu a été utilisé comme décrit par le littérature [29] avec quelques modifications. La réaction de transcription inverse a été utilisé One Step Premier Script miRNA ADNc (Perfect Real Time) Kit (TAKARA Biotechnology Co., Ltd, Dalian, Chine) et la réaction de PCR en temps réel a été utilisé kit de détection miRcute miRNA qPCR (SYBR) (TIANGEN Biotech Co ., Ltd, Beijing, Chine). Les matériaux détaillés ont été présentés dans les méthodes complémentaires.

transfection transitoire et de réaction PCR en temps réel pour l'expression miRNA in vitro

Le plasmide d'expression commerciale pCMV-MIR-let-7a-2 rs629367- C a été acheté chez Origène Company (Origène Biotech Co., Ltd, Shanghai, Chine). Ce plasmide a été procédé à une mutagenèse dirigée à -216 de C à A (pCMV-let-7a-2 rs629367-A) par Sainuo Company (Sainuo Biotech Co., Ltd, Beijing, Chine) et confirmé par séquençage. Et les lignées cellulaires candidates ont été séquences pour le génotype du-let-7a-2 pri site rs629367 d'examiner s'il y avait une variante de ce site de polymorphisme rs629367. Ensuite, les lignées de cellules de type sauvage et aussi les deux plus bas expression let-7a, SGC-7901 et AGS, ont été sélectionnés pour la transfection (Plus de détails, voir Méthodes supplémentaires et complémentaires Figure S2). La lignée cellulaire de cancer de l'estomac humain, AGS a été acheté auprès de l'ATCC, American Type Culture Collection, Etats-Unis et SGC-7901 a été acheté à partir de la banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences, Shanghai, Chine. Après 72 heures, l'ARN total de cellules a été extrait et la PCR en temps réel a été utilisé pour détecter l'expression let-7a après transcription inverse afin de comparer le let-7a matures produit par pCMV-let-7a-2 rs629367-A vs. pCMV-let-7a-2 rs629367-C.

Statistiques

les quatre polymorphismes miRNA étudiés ont été testés pour Hardy-Weinberg (HWE) chez les témoins. Les variables continues ont été montrées sous forme de moyenne ± écart-type (SD) et comparées par analyse de variance, tandis que les variables discrètes sont représentées sous forme de fréquences et tous les pourcentages et comparées par test de χ2 [24]. La régression logistique multivariée avec ajustement pour l'âge, le sexe et H. pylori de l'infection a été utilisé pour évaluer l'association entre les polymorphismes miARN et les risques de maladies. Parce que le tabagisme et la consommation d'alcool avait près d'un tiers des données manquantes ne convenaient pas comme des facteurs d'ajustement, seuls facteurs comme stratifiés pour l'analyse de l'association entre les polymorphismes miARN et les risques de maladies. la survie univariée et multivariée analyses ont été effectuées par le test du log-rank et le modèle de Cox des risques proportionnels. Les courbes de survie ont été mises en correspondance en utilisant la méthode de Kaplan-Meier. analyse de survie multivariée a été réalisée en ajoutant SNP à tous les paramètres clinicopathologiques avec P
< 0,05. De plus, les copies de miARN ont été utilisés valeur lg pour une distribution normale, et l'effet des polymorphismes miARN sur ses niveaux d'expression ont été testés par l'analyse de la variance (ANOVA) à tester. La corrélation de l'expression let-7a dans le sérum et le tissu a été montré que le coefficient de corrélation par l'analyse de corrélation. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant la version logiciel SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) et dans l'étape de la présélection, les valeurs de p < 0,10 était considérée comme significative tandis que toutes les autres analyses ont été considérés comme des valeurs <p;. 0,05 comme significative

Résultats

effet principal de polymorphismes miRNA sur le cancer gastrique et gastrite atrophique risque

les fréquences génotypiques du SNP étudié à l'étape de criblage ont été présentés dans le tableau 1 et le électrophorégramme et le séquençage figure de ces quatre miRNA polymorphismes génotypes ont été présentés dans la figure complémentaire S1. pri-let-7f-2 rs17276588 a été exclue de l'analyse parce qu'il a dévié de HWE. Deux SNP ont été considérés comme promisingly être associés à des risques de maladies: les fréquences variant de génotype de pri-let-7a-1 rs10739971 entre gastrite atrophique et le groupe de contrôle ont montré de différence statistique (27,1% contre 13,7%, P
= 0.018, tableau 1), et la variante fréquences génotypiques de pri-let-7a-2 rs629367 entre le cancer gastrique et le groupe témoin a également montré la différence (1,9% vs.6.5 de%, P
= 0,094, tableau 1) . Nous avons considéré la valeur de p < 0,10 comme significatif et sélectionné ces deux prometteurs des sites SNP dans le stade validé

Pour confirmer l'association de pri-let-7a-1 rs10739971 et pri-let-7a-2 rs629367 polymorphismes. avec cancer de l'estomac et /ou des risques de gastrite atrophique, nous avons réévalué ces deux SNP dans un autre cas de 1949 dans la phase validée élargie. Les fréquences des polymorphismes dans tous les échantillons sont montrés dans le tableau supplémentaire S2. Les témoins sains étaient la fréquence adaptée au cancer de l'estomac et aux cas de gastrite atrophique par âge (± 5 ans) et le sexe (01h01). Après la fréquence correspondante, seulement 501 cancer de l'estomac et 501 contrôles pour gastrique analyse des risques de cancer et 612 gastrite atrophique et 612 contrôles pour atrophique analyse des risques de gastrite ont finalement été inclus. Dans la phase validée élargie, les fréquences variant de génotype de pri-let-7a-2 rs629367 entre le cancer gastrique et le groupe témoin étaient statistiquement différents (6,4% vs 4,0%, tableau 1). En comparaison avec le génotype AA commun, la variante génotype CC a été associé à un 1,83 fois un risque accru de cancer de l'estomac ( P
= 0,048, IC à 95% = 1,01 à 3,32, tableau 1), et a également été associé à un 1,86 fois un risque accru de gastrite atrophique ( P
= 0,032, IC à 95% = 1,06 à 3,28, tableau 1). En outre, la variante génotype CC a été associé à un 1,93 fois un risque accru de gastrite atrophique par rapport à la génotypes (AC AA +) ( P
= 0,021, IC à 95% = 1,11 à 3,36, tableau 1) , Cependant, nous n'avons pas observé une association statistiquement significative entre-let-7a-1 pri rs10739971 et les risques de maladie au stade validé.

analyse stratifiée et de l'analyse interation

Pour approfondir l'influence potentielle de l'âge, le sexe et les facteurs environnementaux comme le statut de l'infection, le tabagisme et l'alcool la consommation d'alcool de H.pylori sur l'effet génétique, nous avons effectué des analyses stratifiées pour pri-let-7a-1 rs10739971 et pri-let-7a-2 rs629367 polymorphismes en fonction de ces facteurs (voir le tableau 2). Nous avons observé différents effets de pri-let-7a-2 rs629367 sur le risque de maladie dans différents sous-groupes. association statistique entre génotype CC et un risque accru de gastrite atrophique ont été trouvés chez les femelles ( P
= 0,025, OR [IC 95%] = 2,59 [1,13 à 5,92]), H. sérologie négative du sous-groupe de pylori ( P
= 0,036, OR [IC 95%] = 1,97 [1,05 à 3,73]), et du sous-groupe non-potable ( P = 0,023
, OR [IC 95%] = 2,44 [1,13 à 5,26]). En outre, le génotype CC a été trouvé à être associée à un risque accru de cancer de l'estomac chez les patients avec 50 ans de la vieillesse ( P
= 0,026, OR [IC 95%] = 6,02 [1,24 à 29,10]) et H. sérologie négative la sous-population de pylori ( P
= 0,036, OR [IC 95%] = 2,02 [1,05 à 3,90]). Toutefois, lorsque nous avons effectué l'analyse des interactions entre rs629367 SNP et H. l'infection, le tabagisme et l'alcool consommation d'alcool d'pylori, aucun effet d'interaction statistique a été trouvée ( P
_{interaction = respectivement 0,786 et 0,382, voir tableau supplémentaire S3). Aucune association significative n'a été trouvée entre pri-let-7a-1 rs10739971 et cancer de l'estomac ou des risques de gastrite atrophique dans toute analyse stratifiée.}

Corrélation entre pri-let 2-7a-rs629367 polymorphisme et clinicopathologiques paramètres et la durée de survie des patients atteints de cancer gastrique

en raison de l'observation d'association statistiquement significative entre rs629367 et le cancer gastrique et le risque de gastrite atrophique dans le principal effet des analyses et des analyses stratifiées, nous avons étudié en outre si le rs629367 du risque associé est en corrélation avec le phénotype clinicopathologique et la survie pronostique du cancer gastrique. Les résultats ont montré que pas de corrélation significative de ce SNP a été trouvé avec les paramètres clinicopathologiques y compris la taille de la tumeur, la localisation de la tumeur, le type Borrmann, le type histologique, le type Lauren, le stade TNM, modèle de croissance, profondeur de l'invasion, la métastase lymphatique, H.pylori
état de l'infection, le tabagisme, l'alcool, et les antécédents familiaux ( P
> 0,05, voir tableau supplémentaire S4), mais ce SNP a été trouvé associé à la survie du cancer gastrique. Les porteurs du génotype CC ont montré la survie défavorable (CC vs AA: 22,2 mois vs 32,0 mois) et l'augmentation des RR pour les patients atteints de cancer gastrique dans l'analyse univariée (CC vs AA: P
= 0,011, HR [95% CI] = 3,39 [1,33 à 8,65]; CC vs AA + AC: P
= 0,005, HR [IC 95%] = 3,51 [1,45 à 8,49]; tableau 3 et la figure 1-A et - B). En ajustant plusieurs paramètres clinicopathologiques qui étaient des facteurs de confusion potentiels en corrélation avec la survie du cancer gastrique ( P
≤0.0001 pour la taille de la tumeur, le type Borrmann, le stade TNM, profondeur de l'invasion et les métastases lymphatiques, voir supplémentaires Tableau S5), statistiquement augmentation des HRs ont également été obtenus pour les transporteurs de CC dans l'analyse multivariée (CC vs AA: P
= 0,004, HR [IC 95%] = 4,48 [1,60 à 12,60]; CC vs AA + AC: P
= 0,001, HR [IC 95%] = 4,69 [1,84 à 11,95], le tableau 3).

corrélation entre rs629367 et mature let-7a expression dans le sérum et le tissu gastrique

afin d'étudier le mécanisme possible de rs629367 polymorphisme lié au cancer gastrique, nous avons encore étudié l'expression let-7a matures in vivo et in vitro. Les caractéristiques des patients sélectionnés pour l'étude de l'expression dans le sérum et les tissus ont été présentés dans le Tableau complémentaire S6. Dans le niveau de sérum, stratifié par différentes maladies, nous avons constaté que dans le groupe de gastrite atrophique, l'expression let-7a mature de rs629367 AA, CA, génotype CC a montré une tendance de plus en plus progressivement, et cette différence avait une signification statistique (3,30 ± 0,56 Vs . 3,52 ± 0,55 vs 3,76 ± 0,34, P
= 0,043, Tableau 4, Figure 2-A). Dans le niveau des tissus, nous avons analysé l'effet sur let-7a génotypes SNP sur sa maturité expression let-7a dans le tissu de cancer de l'estomac, et trouvé rs629367 AA, CA, génotype CC a également montré une tendance d'augmentation progressive, bien que cette différence n'a pas atteint statistique importance (tableau 4).

L'expression let-7a mature de pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-A et -C

d'abord, les lignées cellulaires candidates ont été séquencées le génotype du-let-7a-2 pri site rs629367 et a constaté que ces lignées cellulaires candidates étaient de type sauvage tout rs629367 (voir Figure complémentaire S3). Dans le niveau vitro, SGC-7901 et des lignées cellulaires AGS ont été transinfected en deux plasmides, pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-A et pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-C. Après 72 heures, mature expression 7a laisser a la signification statistique dans la lignée cellulaire SGC-7901 ( P
< 0,001, Figure 2-B). La variante C allèle exprimé un let-7a plus élevé par rapport à l'ancienne allèle. La lignée cellulaire AGS n'a obtenu aucune signification statistique et ne montrait tendance en conformité avec SGC-7901 (voir la figure supplémentaire S4).

Discussion

Sur la base de diverses études concernant les fonctions de miARN matures [30], il est bien admis que les miARN jouent un rôle important dans le développement du cancer en tant que "oncogène" ou "gène suppresseur de tumeur» [31]. Cependant, la relation entre les variantes miARN et le risque de cancer, ainsi que le pronostic doit encore être clarifiée [32]. Dans la présente étude, nous avons signalé, pour la première fois, les fréquences de distribution de quatre miRNA tagSNPs (pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7a-2 rs629367 et rs1143770, pri-let-7f-2 rs17276588) dans le nord du chinois. Nous avons validé davantage les sites de polymorphisme prometteurs indépendants et des échantillons élargi et trouvé la variante génotype CC de pri-let-7a-2 rs629367 a augmenté les risques de cancer gastrique et gastrite atrophique à 1,83 et 1,86 fois, ainsi que associée à un faible taux de survie des patients atteints d'un cancer gastrique. Nous avons exploré davantage l'effet de pri-let-7a-2 rs629367 sur son expression et les mécanismes possibles, et a indiqué que le mécanisme pourrait en raison de l'alternance de l'expression let-7a mature, qui peut éventuellement modifier la sensibilité et le pronostic de l'estomac cancer. À notre connaissance, ceci est le premier rapport sur la relation entre rs629367 SNP avec la sensibilité et le pronostic du cancer de l'estomac.

Comme nous le savons, les variations génétiques, qui se posent dans les gènes miRNA y compris leurs régions primaire et pré-miARN , aurait la possibilité d'affecter plusieurs voies biologiques et de l'incidence de la maladie influence [33]. Ainsi, les polymorphismes-miARN pré primaire et peuvent être utilisés comme marqueurs génétiques pour prédire le risque de cancer [32], [34], qui ont plus d'avantages et points forts que le codage des polymorphismes du gène au potentiel de prédire parce miARN souvent situés dans des génomique associée au cancer régions [35] et pourrait réglementer presque tous les gènes de codage [36]. Récemment, des études ont porté sur les polymorphismes pré-miARN situés sur la tige-boucle, comme pré-mir-196a2 rs11614913 [37], rs2910164 pré-mir-146a [38],-mir-499 pré rs3746444 [39], [40], rs2292832-mir-149 pré [41], pré-mir-27a rs895819 [42]. En raison de la complexité de la structure de l'espace de l'ARN, une attention croissante a été accordée à SNP sur pri-miARN. Le représentant pri-miARN SNP étaient pri-miR-185 rs2008591 associée au cancer du sein [11], pri-miR-34b /c rs4938723 associée au cancer hépatocellulaire [12], rs928508 pri-miR-30c [22] et pri-miR -938 rs2505901 [43] associés au cancer gastrique. laissez-7 familles étaient miARN identifiés les plus précédents [4] et jouent un rôle crucial dans le maintien de la fonction physiologique normale de l'homme. En utilisant les bases de données bioinformatiques NCBI, nous avons trouvé 4 SNP dans la région de précurseur primaire de let-7 familles (pri-let-7a-1 rs10739971, pri-let-7a-2 rs629367 et rs1143770, pri-let-7f-2 rs17276588) eu allèle mineur Fréquence (MAF) > 5% de la population chinoise, qui étaient tous les tagSNPs mais leurs rôles prédictifs potentiels ne sont pas claires. Dans la présente étude, par le dépistage et la validation de deux étapes étude, nous avons d'abord constaté que, parmi les 4 tagSNPs, pri-let-7a-2 rs629367 polymorphisme a été associé à la susceptibilité du cancer gastrique (la variante CC de génotype de pri-let-7a-2 rs629367 a augmenté les risques de cancer gastrique et gastrite atrophique à 1,83 et 1,86 fois). Cette pri-let-7a-2 rs629367 SNP était situé dans l'aval 3 'UTR, qui était le SNP le plus proche avec les gènes matures miRNA entre les quatre SNPs de dépistage, et ce serait un nouveau biomarqueur pour prédire le risque de cancer de l'estomac.

Nous avons également procédé à Cox analyse des risques proportionnels de régression univariée et multivariée des données de suivi pour explorer les associations de pri-let-7a-2 rs629367 SNP avec la survie globale des patients atteints de cancer gastrique. Toujours des résultats significatifs ont été observés à partir de modèles de Cox univariée et multivariée (tableau 3). Le rs629367 porteurs du génotype CC variante 2 pri-let-7a-HR a montré augmenté avec un P
-value de 0,011 (HR = 3,39) et 0,005 (HR = 3,51) par rapport à AA de type sauvage et AA génotype + AC respectivement en analyse univariée. Étant donné que plusieurs paramètres clinicopathologiques ont contribué de manière significative à la survie globale du cancer gastrique ( P
≤0.0001 pour la taille de la tumeur, le type Borrmann, le stade TNM, profondeur de l'invasion et les métastases lymphatiques), nous avons effectué une analyse avec un ajustement pour les facteurs potentiels de confusion dans l'analyse multivariée. Finalement, nous avons trouvé le P
-value de ce rs629367 SNP était plus important et HRs statistiques ont également augmenté (CC vs AA: P
= 0,004, HR = 4,48; CC vs. AA + AC: P
= 0,001, HR = 4,69, respectivement), ce qui suggère que pri-let-7a-2 rs628367 peut être un facteur de risque indépendant pour le pronostic de cancer gastrique

Plusieurs études. ont révélé que les polymorphismes miRNA altèrent le traitement des miARN et l'expression de miARN mature et jouent un rôle dans la cancérogenèse [12], [33]. Afin d'étudier le mécanisme possible de rs629367 polymorphisme lié au cancer gastrique, dans cette étude, nous avons étudié l'effet de pri-let-7a SNP sur l'expression mûre let-7a in vivo et in vitro. Contrôle du facteur de la maladie, nous avons trouvé dans le groupe de la gastrite atrophique sérique, l'expression let-7a mature de rs629367 AA, CA, génotype CC a montré une augmentation significative progressivement ( P
= 0,043, tableau 3). Cela pourrait expliquer en partie ce phénomène que la variante de génotype CC rs629367 a une fréquence de distribution ultérieure dans le groupe de gastrite atrophique que dans le groupe témoin (6,2% contre 3,9%, tableau 1). La relation entre le génotype CC rs629367 avec un risque accru de gastrite atrophique a indiqué que ce SNP est associé à une gastrite atrophique et le cancer gastrique, éventuellement même par l'alternance de l'expression de miARN matures, ce qui influe sur la sensibilité au cancer gastrique. Sur la base du niveau d'expression in vivo, nous avons construit davantage les plasmide exprimées contenant pri-let-7a-2 rs629367 type sauvage allèle et la variante C allèle afin d'observer l'expression let-7a maturité des deux allèles différents. Nous avons constaté que, après transinfection, les cellules SGC-7901 contenant pCMV-MIR-pri-let-7a-2 rs629367-allèle C a démontré plus matures expression let-7a que celle d'un allèle ( P
< 0,001, Figure 1). Le résultat obtenu à partir de l'expérience in vitro a été concordante avec celle de la vivo, qui révèlent également que pri-let-7a-2 rs629367 polymorphisme pourrait affecter l'expression let-7a mature et modifier la susceptibilité au cancer gastrique. Plusieurs études ont rapporté que let-7a était suppresseur de tumeur [44], [45]. Nous avons spéculé que la variation de A à C pourrait la perte de sa fonction d'origine de suppression de la tumeur, ce qui pourrait modifier la prédisposition au cancer gastrique et conduisant à une mauvaise survie pour le pronostic.

Le cancer gastrique est une maladie multi-factorielle causée par une prédisposition génétique ainsi que les facteurs environnementaux [46]. Pour étudier l'influence potentielle de l'âge, le sexe et les facteurs environnementaux comme le statut de l'infection, le tabagisme et l'alcool de H.pylori potable sur l'effet génétique, nous avons analysé davantage les effets de possibles facteurs d'influence sur cette pri-let-7a -2 rs629367 SNP, et a trouvé pri-let-7a-2 rs629367 a été uniquement associés à des risques de maladies dans H. pylori
sérologie négative patients groupe et dans le groupe non-potable. Dans H. sérologie négative des patients pylori, les RUP pour l'association de rs629367 SNP et la gastrite atrophique et les risques de cancer gastrique élevés pour être 2.12 et 1.97 fois, ce qui était supérieur à celui des RUP dans les cas entiers (1,83 et 1,86 fois, respectivement) . Cependant, il n'y avait pas de signification statistique H. Les patients de sérologie positive de pylori. De même, ce phénomène a également été observé dans l'analyse stratifiée par l'alcool: dans le groupe non-potable, l'OR pour l'association de rs629367 SNP et le risque de gastrite atrophique élevé pour être 2,39 fois, alors qu'il n'y avait pas de signification statistique dans le groupe de l'alcool. Cela peut être parce que le H.pylori
et boire ont été associés à l'incidence du cancer gastrique. Brenner et al. avait émis l'hypothèse que H.pylori
était une cause nécessaire pour le cancer gastrique [47], et Tramacere et al. a constaté qu'il y avait une forte association entre la consommation et l'incidence du cancer gastrique [48], [49]. Par conséquent, la suppression de ces deux facteurs environnementaux fait les RUP plus élevé que l'analyse des échantillons entiers.

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