PLOS ONE: microARN-137 Contribuye a antivibratorias Tumorigénesis en el cáncer gástrico humano por la orientación AKT2

Extracto

MiRNAs juegan un papel importante en la tumorigénesis. Este estudio se centró en explorar el mecanismo de los efectos y la regulación de los genes miARN-137 en los comportamientos biológicos de cáncer gástrico. ARN total fue extraído a partir de tejidos de 100 pacientes con cáncer gástrico y de cuatro líneas celulares de cáncer gástrico. La expresión de miR-137 fue detectado por PCR en tiempo real a partir de 100 pacientes. Los efectos de miR-137 sobreexpresión en la capacidad de proliferación, apoptosis, migración y la invasión de células de cáncer gástrico 'se investigaron in vitro e in vivo. El gen diana de miR-137 fue predicho por TargetScan en el software de la línea, proyectada por el ensayo de gen indicador de luciferasa dual y demostrado por Western blot. Como resultado, la expresión de miR-137 fue significativa reduce en línea celular de cáncer gástrico HGC-27, HGC-803, SGC-7901 y MKN-45, así como en tejidos de cáncer gástrico en comparación con células GES-1 o emparejado no adyacentes tejidos -neoplastic ( p Hotel < 0,001). La re-introducción de miR-137 en células de cáncer gástrico fue capaz de inhibir la proliferación celular, la migración y la invasión. Los experimentos in vivo demostraron que la sobreexpresión de miR-137 puede reducir la proliferación de células de cáncer gástrico y metástasis. Bioinformáticas y análisis de transferencia Western indicó que el miR-137 actuó como papeles supresores de tumores en células de cáncer gástrico a través de la orientación y AKT2 afectando aún más el malo y GSK-3β. En conclusión, el miR-137, que es con frecuencia las reguladas en el cáncer gástrico es potencialmente implicadas en la tumorigénesis y metástasis del cáncer gástrico mediante la regulación de vías de señalización relacionadas AKT2

Visto:. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Y, Yang W, et al. (2015) microARN-137 Contribuye a antivibratorias Tumorigénesis en el cáncer gástrico humano por la orientación AKT2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10.1371 /journal.pone.0130124

Editor Académico: Irina Lebedeva V., Universidad de Columbia, Estados Unidos |

Recibido: 15 de agosto de 2014; Aceptado: 18-may de 2015; Publicado: 23 Junio ​​2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

financiación:.. Este trabajo fue apoyado por proyectos de investigación en ciencias médica y tecnología de la provincia de Henan, china (2011030004): perfil

Conflicto de intereses: los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es la segunda causa frecuente de muerte por cáncer en el mundo [1]. Hasta ahora, el mecanismo de la carcinogénesis gástrica es en gran parte desconocida. Los investigadores han intentado estudiar GC de la vista de la bioquímica y la biología molecular que algunos genes supresores de tumores y genes relacionados con el tumor han sido reportados en GC. Los microARN (miRNA) son endógenamente pequeños ARN no codificantes de 18 ~ 22 nucleótidos que han sido identificados como reguladores de la expresión génica posttranscriptional [2, 3]. MiRNAs juegan un papel crítico en muchos procesos biológicos como la proliferación, el desarrollo, la diferenciación y la apoptosis. Mientras tanto, miRNAs han sido validados para actuar como oncogenes o genes supresores de tumor durante la tumorigénesis. Por ejemplo, miR-31 se identificó como un oncogén en el carcinoma de células escamosas de esófago [4] y miR-451 funciona como un supresor de tumores en el cáncer no microcítico de pulmón de células humana [5]. También hay muchos microRNAs se identificaron relacionada con el cáncer gástrico sucediendo y el desarrollo [6-13]. También se ha informado de que la sobre-expresión de miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34a y miR-423-5p se puede utilizar como criterios de diagnóstico de cáncer gástrico [14] .Por lo tanto, los miRNAs son posibles candidatos de biomarcadores de diagnóstico o dianas terapéuticas novedosas de cáncer gástrico.

microARN-137 (miR-137) ha sido informado de que el regulado y desempeñar funciones como supresor tumoral en el cáncer colorrectal y el cáncer oral [15, dieciséis]. Sin embargo, la función de miR-137 y su mecanismo de carcinogénesis gástrica subyacente todavía no son muy claras. Chen et al reveló que el miR-137 puede juega como un supresor de tumores por la orientación CDC42 para regular el ciclo celular en el cáncer gástrico [17]. Aun así, es evidente para nosotros que el microARN regula comportamientos biológicos de manera múltiple camino que podría haber más mecanismo de regulación de miR-137 hacia la tumorigénesis GC. En este estudio, que mide la expresión de miR-137 en 100 pacientes con cáncer gástrico y se investigaron los papeles de miR-137 en células de cáncer gástrico. Hemos encontrado algunas otras funciones de miR-137 en GC, así como otra manera de camino por el que el miR-137 jugó un papel de supresor de tumores en la tumorigénesis GC.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

Todos los estudios en humanos han sido aprobados por el comité de ética correspondiente, por lo que se han realizado de acuerdo con las normas éticas. Todas las personas que dieron su consentimiento informado antes de su inclusión en el estudio.

Pacientes y muestras

muestras de cáncer gástrico humano se obtuvieron de muestras quirúrgicas a partir de 100 pacientes (56 hombres, mujeres 44) con GC en el Instituto del cáncer y el hospital, primer afiliado del hospital de la Universidad de Henan; el segundo hospital del Ejército de Liberación Popular de China; Cancer Hospital de Hebei. Las muestras no tumorales de la margen del tumor macroscópico se aislaron al mismo tiempo y se utilizan como los tejidos no neoplásicas adyacentes emparejados. Todas las muestras se dividieron en dos partes. Las muestras de tejido se recogieron inmediatamente se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de ARN. El uso de las muestras de tejido para todos los experimentos fue aprobado por el comité de ética del Instituto de Ciencias Médicas Básicas de la Academia China de Ciencias Médicas. Todos los participantes dieron su consentimiento informado verbal para participar en este estudio, y sus consentimientos informados verbal fueron escritas. Este proceso onsent también fue aprobado por el comité de ética. Cuatro líneas celulares de cáncer gástrico (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 y MKN-45) fueron preservados en nuestro laboratorio y se mantuvieron en DMEM o 1640 con 10% de FBS.

extracción de ARN, síntesis de ADNc y los ensayos de PCR en tiempo real

el ARN total de los tejidos y las células se extrajo mediante el método de Trizol (Ambion, EE.UU.) siguiendo las instrucciones completamente. cDNA de cadena sencilla se sintetizó mediante M-MLV (Ambion, EE.UU.), utilizando 2 g de RNA total como molde. Oligo (dT) 18 se utilizó para la transcripción inversa de ARNm mientras tallo bucle utilizado para miRNA. PCR a tiempo real (RT-PCR) se llevó a cabo por Bio-rad CFX96 (Bio-Rad, EE.UU.), utilizando la mezcla de SYBR (Tiangen, China). La condición de la PCR fue: 95 ° C × 30, seguido por 40 ciclos de 95 ° C × 5 s, 60 ° C x 34s. Para mRNAs, GAPDH se utilizó como control normalizado. Para miRNAs, U6 snRNA se utiliza para el control de los genes miARN. La expresión relativa de miR-137 se calcula por el método de 2-ΔΔCT. Primer secuencias se muestran en la Tabla 1.

Construcción de plásmidos

La secuencia precursora de miR-137 generado por el recocido y miR-137-F-precursora y la extensión de miR-137-R-precursora fue por su parte digerido por BamHI y BglII, los productos de los cuales era inserciones en el fragmento BamHI-BglII del vector pcDNA-GW /EmGFP-MIR (GenePharma, china). En el ínterin, se construyó también el control negativo.

Cultivo de células y transfección miARN

Las líneas celulares HGC-27, SGC-7901 MKN-45 y GES-1 fue adquirido de los recursos de la célula centro del Instituto de Ciencias médicas básicas de la Academia china de Ciencias médicas y Union Medical College de Pekín (Beijing, china). Las líneas de células gástricas humanas HGC-27, SGC-7901 y MKN-45 se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medio suplementado con 10% de suero bovino fetal y la línea gástrico de células del epitelio humano GES-1 se mantuvieron en DMEM ( Gibco, BRL, UK) los medios de comunicación. El miR-137 imitador y el sinóptico scramble que es no homóloga con el genoma humano se sintetizaron por GenePharma (Shanghai, China) y se transfectó en las células a una concentración de oligonucleótido final del 10 nmoles /L. Todas las transfecciones celulares fueron introducidos por DharmaFECT1 Reactivo (Dharmacon, TX, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante utilizados. Para cada transfección de células se realizaron dos o tres experimentos de replicación. Ensayo

La proliferación celular y la proliferación celular ensayo de apoptosis

se realizó por CCK8 método (DOJINDO, Japón). Brevemente, los aproximadamente 5.000 miR-137 células transfectadas imitan y las células se sembraron scramble respectivamente en placas de 96 pocillos y se cultivan. las tasas de proliferación se determinaron a 0, 12, 24, 48, 72, 96 horas después de la transfección mediante la adición de 10μl Regent CCK8 y probado de acuerdo con los manuscritos. Los ensayos de apoptosis fueron probados en HGC-27 y SGC-7901 líneas de células con o sin sobreexpresión de miR-137 con el kit de detección de apoptosis I (BD Biosciences, EE.UU.) y C6 citómetro de flujo (EE.UU.).

La migración celular y ensayos de invasión

Se realizó el ensayo de cicatrización de heridas para probar la capacidad de migración de células con o sin el miR-137 transfección. Las heridas artificiales se produjeron en la monocapa de células confluentes con FBS libertad, usando una punta de pipeta de 200 l en 24 horas después de la transfección de miR-137. Las imágenes fueron tomadas respectivamente a los 0, 12, 24 y 36 horas después de la creación de la herida.

A continuación, realizaron transwell ensayos para evaluar la capacidad de invasión de las células. 5 × 10 ^{4 células en suspensión en 200 l de medio sin FBS se colocaron en la cámara superior de cada inserto con 430μl de 1 mg /ml de Matrigel (Millipore, EE.UU.). 600μl medio con FBS al 10% como el atrayente alimenticio se puso en la cámara inferior. Después de 24 horas, las células unidas a la superficie inferior de la cámara eran fi ja 20 min por 20% de metanol y se tiñeron durante 10 minutos con 10% maygruwald-Giemsa (MGG). Las membranas de invasión fueron luego cortados y enterradas en el cubreobjetos. Nos contaron las células en 3 diferentes campos de visión fi en condiciones, con 20 × Magni fi cación que se utiliza entonces como el número medio de células. Todos los ensayos se realizaron en tres experimentos independientes.}

Experimento con animales

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las normas éticas institucionales para los experimentos con animales. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentos con Animales de las levas (Academia China de Ciencias Médicas) (Número de Permiso: C72-14-0664). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Scramble transfectadas y miR-137 sobreexpresión HGC-27 células (5 × 10 ^{6 células) se inocularon por vía subcutánea en los flancos dorsales de ratones BALB /c ratones desnudos (mujer, Nu /Nu, 6 semanas de edad), todos los cuales fueron adquiridos desde el Centro Animal de la Universidad de Henan y se crió en condiciones libres de patógenos. El volumen de tumor se midió durante 5 semanas. Todos los ratones fueron sacrificados y s.c. tumores se resecaron y el peso de los tumores se puso a prueba. Para los experimentos de metástasis in vivo, se recogieron HGC-27 células 24 horas después de la transfección. El ensayo de viabilidad celular se realizó utilizando un poste horas kit24 ensayo de transfección XTT de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche, Tokio, Japón). A continuación, los ratones (hembra, Nu /Nu, 6 semanas de edad) fueron inyectados con HGC-27 células con o sin miR-137 sobreexpresión través de la vena de la cola con 2 x 10 5 células en PBS. Las células HGC-27 fueron modificados que pueden expresar de forma estable la luciferasa (construido por GENECHEM, Shanghai, China). Las células fueron verificados por microscopio para asegurarse de que las células estaban en buenas condiciones. Después de seis semanas, Imágenes de bioluminiscencia se realizó utilizando un espectro IVIS valores de radiancia y la imagen se normalizaron usando imagen viva (Caliper Life Science, EE.UU.).}

La inmunohistoquímica

Los tejidos fueron embebidos en parafina secciones y tratada 2 horas a 65 ° C y luego deparaffinised. Antes de aplicar los anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche, se llevó a cabo la etapa de recuperación de antígeno. Después de eso, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo secundario aproximadamente 2 horas a 25 ° C conjugado con HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, China). El Liquid DAB + Sustrato (zsgb-bio, China) se utilizó para la detección de la actividad de HRP.

luciferasa reportero miARN objetivo del ensayo

La longitud total de la 3'UTRs de los ARNm humanos eran AKT2 cada uno amplificado por PCR y clonado en el PMIR-ReportTM informador de luciferasa vectorial (Ambion, EE.UU.) para generar los reporteros. Las mutaciones de las regiones de semillas previstos en las secuencias de ARNm se crearon usando los cebadores incluidos los sitios mutados. de células HEK-293T se sembraron en placas de 24 pocillos (1 x 10 ^{5 células por pocillo) el día antes de las transfecciones se llevaron a cabo. Las células (~ 70% confluentes) fueron transfectadas con los reporteros de luciferasa PRL-TK (50 ng /pocillo), luciferasa PGL-3firefly (10 ng /pocillo), e imitar-137 (50 nmol /L, GenePharma, Shanghai, China) o scramble (50 nmol /L) usando Lipofectamine 2000 actividades (Invitrogen) .Luciferase se midieron usando el Dual Luciferase reportero de ensayo (Promega, EE.UU.).}

Western blotting

las proteínas fueron separadas en 10% SDS-PAGE y luego se transfiere a 0.45 micras membranas de PVDF (Amersham, Reino Unido). Las membranas se incubaron con 5% de leche seca no grasa durante la noche a 4 ° C y con anticuerpo monoclonal anti-AKT2 (Proteintech, EE.UU.) a una dilución 1: 1000; anticuerpo anti-Bad monoclonal (Bioworld, EE.UU.) a la dilución 1: 500; anti-GSK-3B anticuerpo policlonal (Bioworld, EE.UU.) a una dilución 1: 1000; anti-GAPDH anticuerpos (Proteintech, Chicago, EE.UU.) a 1: 30.000 dilución. Después de lavar dos veces con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpo de cabra anti-conejo (zsgb-bio, China) a 1: 5.000 y 1:. 50000 diluciones de 2 h

Estadísticas

Cada experimento se repitió al menos tres veces. Se llevaron a cabo la prueba t de Student (dos colas) y la x ^{2 test, y el nivel de significación estadística se fijó en α = 0,05 en dos lados). Media ± SD se muestra en las figuras.}

Resultados

miR-137 es el regulado en células de cáncer gástrico y muestras clínicas

Primero examinamos la expresión de madurez de miR -137 en 4 líneas celulares de cáncer gástrico humano (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 y MKN-45) y de células epiteliales gástricas (GES-1). Estas líneas celulares GC mostraron extraordinariamente baja expresión de miR-137 en comparación con la línea celular de GES-1 (Figura 1A). Para estudiar más a fondo la relación de miR-137 con la ocurrencia de GC, se detectó la expresión de miR-137 en 100 pacientes clínicos (macho 56, hembra 44; edad media de 53 años) por TaqMan sonda drived-PCR en tiempo real como se ha descrito anteriormente. De las 100 muestras de GC, la expresión de miR-137 se había reducido regulado en 77 casos (77%) en comparación con los tejidos adyacentes cuando la línea de corte se estableció como 1.5. Mientras tanto, el miR-137 fue hasta reguladas en 23 casos (23%) (Figura 1B y 1C). En general, la expresión de miR-137 en los tejidos GC fue menor que en los tejidos adyacentes en diferencias estadísticamente significativas (p = 0,00079, emparejado t-test, de dos colas, la figura 1C). Además, hemos encontrado una asociación estadísticamente significativa entre la expresión de miR-137 y el estadio clínico del cáncer gástrico. Los pacientes que tienen los niveles más bajos de expresión de miR-137 se asociaron con tumores de alto grado y la fase tardía (Figura 1D). Estos resultados indican que las alteraciones de miR-137 podrían estar implicados en la progresión del cáncer gástrico.

miR-137 inhibe la proliferación celular in vitro e in vivo

Estamos transfectadas miR-137 imitan en líneas celulares de GC HGC-27 y SGC-7901, ambos de los cuales mostró un gran eficiencia de la transfección (Fig 2A). Los resultados de los ensayos de crecimiento CCK8 en 0, 1, 2, 3 y 4 días después de miR-137 y transfección scramble se muestran en la Figura 2B. En comparación con la transfección scramble, miR-137 transfección redujo significativamente la proliferación de ambas líneas celulares (Figura 2B). A continuación, se investigó el efecto de miR-137 en la apoptosis de las células. Los primeros células apoptóticas en el grupo scramble fue de aproximadamente 10% en HGC-27 y 2,9% en SGC-7901, mientras que después de miR-137 de la transfección, el porcentaje de células apoptóticas tempranas se incrementó a 17,5% en HGC-27 y 8,3% en SGC-7901, que mostró de manera significativa diferencia (figura 2C). A partir de estos resultados, se puede concluir que el miR-137 podría suprimir la supervivencia de las células del cáncer de pulmón mediante la inducción de apoptosis temprana.

A fin de verificar los hallazgos anteriormente, un modelo in vivo se construyó. Se encontró que el crecimiento del tumor fue significativamente más lenta en los ratones de sobreexpresión de miR-137 que en los controles (Fig 2D, 2E y 2G). De acuerdo con la curva de crecimiento del tumor, los pesos de los tumores inducidos por las células revueltos fueron significativamente más alta que por la sobreexpresión de miR-137 (Fig 2F). Estos resultados confirmaron además que la sobreexpresión de miR-137 podría limitar la proliferación de células de cáncer gástrico en vivo.

miR-137 inhibe la migración celular y la invasión in vitro e in vivo

Se evaluaron también los efectos de miR-137 en la migración celular y la invasión, que eran los principales determinantes de la progresión maligna y metástasis. Los efectos de miR-137 en la migración celular se demostraron mediante un ensayo de cicatrización de la herida /cero en células SGC-7901-HGC 27 y. Ambas de las dos líneas de células tratadas con el miR-137 imitan eran distintivamente menos migratoria de control de mezcla aleatoria o las células no tratadas a los 12, 24, y 36 horas después del rascado (figura 3A). Además, se realizó ensayo de invasión de células para medir la capacidad de invasión direccional de las células después de miR-137 sobreexpresión. Como resultado, la invasividad de las células transfectadas con miR-137 imitan dramáticamente se disminuyó en comparación con las células scramble en HGC-27 y SGC-7901 (Fig 3B). A continuación, se emplearon en experimentos in vivo para comprobar la veracidad de este resultado. Hemos demostrado que en primer lugar las células transfectadas con miR-137 de control de imitar o mímico no mostraron una disminución significativa de la viabilidad celular en comparación con células no tratadas. Además, no hay diferencia en la viabilidad celular entre las células transfectadas con miR-137 imitan comparación con el control negativo (S2 Fig). Como se muestra en la figura 3C, la bioluminiscente de imágenes de los ratones en el grupo de la sobreexpresión de miR-137 mostró una imagen mucho más pequeño. Además, el número de metástasis de pulmón por los ratones en el grupo de miR-137 mostró un nivel significativamente más bajo en comparación con el grupo scramble, lo que indica que el miR-137 podría suprimir la metástasis in vivo. Estos resultados demostraron que el miR-137 juega un papel importante en la regulación de la migración celular y la invasión en el cáncer gástrico y sugirió que la baja regulación de miR-137 podría contribuir a la metástasis del tumor en la carcinogénesis gástrica.

miR-137 se dirige a AKT2 en GC

MiRNAs realizan funciones biológicas a través de la regulación negativa de sus genes diana. Como se predijo, hubo complementariedad entre tener-miR-137 y AKT2 3'-UTR (Figura 4A).

Para probar la hipótesis de que AKT2 podría ser una diana de miR-137, un plásmido reportero albergando la naturaleza de tipo región 3'-UTR de AKT2 aguas abajo de la región codificante de la luciferasa (Fig 4A, AKT2_WT) fue construido. Las células HEK-293T se cotransfectaron con el plásmido reportero (AKT2_WT) y scramble. Como resultado, miR-137 células transfectadas mostraron una marcada reducción (≈58%) de la actividad de luciferasa (Fig 4B). Luego, el mismo ensayo se realizó para otro plásmido indicador que contiene AKT2 mutado 3'-UTR en sitios de unión de miR-137. Como era de esperar, la inhibición de la actividad de la luciferasa por el miR-137 se eliminó parcialmente con el sitio de unión 1 o vinculante citar 2 mutante y casi abolida en el AKT2_MUT doble mutante, lo que sugiere que la región conservada era totalmente responsable de la función de miR-137 (figura 4B) .

Para investigar más a fondo la interacción entre el miR-137 y AKT2, HGC-27 y células SGC-7901 fueron transfectadas con el miR-137. expresión AKT2 ARNm se determinó por PCR en tiempo real. No se observó ninguna diferencia significativa entre el miR-137-tratadas y células no tratadas HGC-27 y SGC-7901 (figura 4C) scramble-tratada o. A continuación, se llevó a cabo análisis de transferencia de Western para medir el nivel de proteína AKT2. Se encontró que la expresión de la proteína AKT2 estaba regulado en el miR-137 células HGC-27 y SGC-7901 tratados, pero no en lucha o las células no tratadas (Figura 4D). Estos datos sugieren que miR-137 reconoce directamente la 3'-UTR de AKT2 ARNm e inhibe la traducción AKT2. Por lo tanto, las reguladas de miR-137 en el cáncer gástrico inhibe la supresión de AKT2, que a su vez desacelerar la tumorigénesis.

AKT2 es un miembro de la familia AKT. Detectamos aún más sus efectores malo y GSK-B. Como resultado, el p-Bad y p-GSK-B fue obviamente reducido regulado en el miR-137 células tratadas SGC-7901-HGC 27 y en comparación con las células tratadas con revueltos o no tratados. Ningún cambio significativo se observó en Bad no fosforilada o GSK (Figura 4E). Estos hallazgos sugieren que el crecimiento de células de cáncer gástrico acelerado se debe parcialmente a las vías Akt sobre-Actived. Además de promover la proliferación celular, actived Akt también podría fosforilar malo en Ser112 y Ser136, el bloqueo de la muerte celular inducida-Bad. En la ausencia de fosforilación en estos sitios, se cree inadecuado para interactuar con Bcl-xl para inducir la muerte celular. Por el contrario, la hiperfosforilación mediada por Akt de Bad puede promover la supervivencia celular en las células cancerosas. Nuestros resultados de transferencia Western confirmó la especulación anterior que el cambio de las actividades celulares de cáncer gástrico en la condición de las células transfectadas con miR-137 podría ser un resultado de la disminución de la fosforilación de Bad. Además, se analizaron los niveles de proteína de AKT2 en 12 GC pacientesPara quien se había reducido regulado miR-137. Entre estas muestras, AKT2 fue hasta reguladas in9patientsin sus tejidos GC (figura 4F).

La restauración de AKT2 con plomo a una activación de la invasión y la supresión de la apoptosis

Con el fin de demostrar adicionalmente los papeles de miR-137 y AKT2 jugaron durante la tumorigénesis, se investigó el efecto de la restauración de AKT2 en el miR-137 células transfectadas. La transferencia de Western demostró que el nivel de proteína en AKT2 AKT2 muestra sobreexpresión fue aparentemente más alto que el del control negativo, incluso en la supresión de miR-137. La restauración de AKT2 con plomo a una activación de la invasión y una supresión de la apoptosis (Fig 5).

Discusión

miRNAs se han indicado con frecuencia para ser a menudo mal regulada en diversos cánceres humanos y algunos miRNAs tiene incluso ha utilizado empleado como dianas terapéuticas de cáncer. Las investigaciones referentes a la relación entre miRNAs y cánceres nos podrían ayudar en la comprensión del cáncer.

Hay sólo unas pocas investigaciones que se refieren al papel de miR-137 desempeñado en el cáncer gástrico. Se ha informado de que el miR-137 es un regulador negativo de Cdc42 y por la orientación que la inducción de apoptosis y detención del ciclo celular G1 en células de cáncer gástrico [17]. Sin embargo, el efecto de regulación de microRNA en el cáncer es bastante complicado. Parece imposible que el miR-137 regula el cáncer gástrico por la vía única. En esta investigación, la función y el mecanismo que el miR-137 regula el cáncer gástrico fue investigado más a fondo.

En primer lugar, se detectó la expresión de miR-137 en 100 pacientes y se encontró que la expresión de miR-137 se ha reducido significativamente -regulated en muestra de cáncer. Además, hemos encontrado una asociación estadísticamente significativa entre la expresión de miR-137 y el estadio clínico del cáncer gástrico. Estos resultados indican que las alteraciones de miR-137 podrían estar involucrados en la progresión del cáncer gástrico. Hemos tratado de encontrar la relación entre la edad de miR-137 y los pacientes 'y el sexo, pero se ha encontrado ningún resultado de la estadística. Como el presente estudio reveló que la expresión de miR-137 se había reducido regulado en la mayoría de los tejidos de GC en comparación con los tejidos adyacentes (77%), podríamos considerar sobre el diagnóstico y pronóstico de la utilización de miR-137. Una validación adicional en estudios prospectivos está justificada, y las fuentes de muestras más accesibles, como los exosomas derivados del tumor enriquecidos-miR-137 a partir de sangre, debe ser investigada. Además, hay que hacer notar que en cierta medida el valor de corte (cortar = 1,5) elegimos podría ser todavía arbitraria. Cuando se fija más alto, podría haber un menor número de pacientes con miR-137 hacia abajo reguladas en tejidos de cáncer. Sin embargo, incluso en esta condición, no era alrededor del 23% de los cánceres tienen una alta expresión de miR-137. Esto puede ser debido a la diferencia individual entre los pacientes que algunos de los individuos pueden tener diferentes patrones de expresión génica durante la tumorigénesis o la progresión del cáncer.

A medida que la expresión de miR-137 en los tejidos GC fue menor que en los tejidos adyacentes en diferencias estadísticamente significativas (p = 0,00079), podríamos especular que esta característica de expresión se asocia con el desarrollo del cáncer. Esta especulación fue confirmada por in vitro e in vivo que el miR-137 se puede regular negativamente la proliferación celular, la migración y la invasión. El nivel de expresión de miR-137 se puede mantener en un nivel alto durante un largo período después de la transfección, tanto en líneas celulares de cáncer gástrico, xenoinjertos de tumores en etapa terminal y ubicación inmetastatic en los pulmones (Fig S1 A-S1C figura). Sin embargo, el método de la sobreexpresión conduce a niveles muy altos de expresión de miR-137 (Fig 2A). Este alto nivel de miR-137 puede causar efectos adicionales. Por ejemplo, miR-137 es un regulador negativo de Cdc42 y por la orientación que la inducción de apoptosis y detención del ciclo celular G1 en células de cáncer gástrico [17]. A medida que el miR-137 en nuestro estudio se reguló miles de veces, puede dar lugar a la inhibición de otros objetivos tales como Cdc42. Obviamente, en este estudio no podemos excluir la posibilidad de que los efectos supresores de tumores de miR-137 fue mediada por la supresión de otros genes diana

A continuación,., Encontramos que el miR-137 actúa como un gen supresor de tumores a través de la orientación AKT2 , que es un miembro de la familia AKT. La restauración de AKT2 hace que la regulación de AKT2 en miR-137 células transfectadas, que es mucho más alta que en scramble. Esto puede ser debido a que la sobreexpresión AKT2 invierte el nivel de proteínas de miR-137 suprimida. Más importante aún, la restauración de AKT2 regula la apoptosis y la invasión de células de cáncer gástrico, lo que lleva a una activación de la invasión y una supresión de la apoptosis (Fig 5). Este experimento de rescate proporciona una prueba más de que la apoptosis de las células activas de miR-137 y negativamente regulan la invasión celular por la orientación AKT2. En experimentos in vivo también demostraron que la expresión de miR-137 es negativa con respecto a la expresión AKT2 (Fig S1D y S1E figura). AKT es un factor crucial de la vía PI3K /AKT forma camino. La regulación a la baja de AKT2 afecta aún más su proteína de aguas abajo malo y GSK-3B, que el p-Bad y p-GSK-B fue obviamente el regulado. Mal puede desempeñar sus funciones 'por la fosforilación y regulado aún más el destino de las células [18]. GSK-3B, que también se conoce como GSK-3β lo general, controla la inmigración celular y la invasión. En conclusión, se ha identificado una relación entre miR-137 y AKT2 que es una novela constituyente de la tumorigénesis del cáncer gástrico. El miR-137 se ha demostrado estar relacionada con la regulación AKT2 [19]. En el carcinoma hepatocelular, miR-137 inhibe el crecimiento de células de cáncer y la metástasis a través de la orientación directamente AKT2 [20]. De hecho, nosotros, e se han proyectado 8 genes como posibles objetivos de miR-137 (Tabla S1). Sin embargo, el AKT2 es el único objetivo directo de miR-137 después del ensayo de gen reportero de luciferasa dual e investigación western blot. A partir de la figura 4D podemos encontrar thatmiR-137 puede afectar a la AKT2 y p-AKT2in ambas células HGC-27 y SGC-7901. Pero, curiosamente, en el SGC-7901 del estado de fosforilación fue aparentemente más afectada. Este fenómeno se puede observar constantemente repetidas en los tres manchas que llevamos a cabo. Hemos deducido que podría ser debido a la característica especial de las diferentes células cancerosas. Puede haber específica forma camino regulación de miR-137 en SGC-7901 que reprimía el estado de fosforilación de AKT2.However, a partir de la presente investigación, no podemos explicar plenamente este mecanismo. Cuando elegimos los pacientes que tienen una baja expresión de miR-137 en su tejido GC para detectar la expresión de la proteína AKT2, hemos encontrado la mayoría de estos pacientes (9/12) tienen alto nivel de AKT2 en su tejido GC. Este resultado sugiere que el miR-137 podría objetivo AKT2 en los pacientes. También había tres pacientes con baja expresión de AKT2 en el tejido GC, aunque la expresión de miR-137 es baja. Este resultado puede deberse a la diferencia individual entre los pacientes.

En conclusión, nuestra expresión y estudios funcionales sugieren que el miR-137 es con frecuencia las reguladas en el cáncer gástrico puede actuar como un supresor de tumores en las células de GC, reintroduciendo la expresión de los cuales en las células GC suprime la proliferación de células de cáncer gástrico, la migración y la invasión atacando directamente a AKT2. Por lo tanto, nuestro trabajo es un buen complemento para el trabajo anterior y es muy útil para nosotros entender el mecanismo de regulación de miR-137 en el cáncer.

Apoyo a la Información
S1 Fig. miR-137 y expresión AKT2 después de la transfección.
A. la expresión de miR-137 en HGC-27 y células SGC-7901 72 h después de la transfección. B. expresión de miR-137 en los xenoinjertos de tumores en etapa terminal. C. expresión de miR-137 en la localización metastásica de los pulmones de ratones. D. expresión AKT2 en la localización metastásica de los pulmones de ratones. Mezclamos los pulmones cinco juntos en el mismo grupo. expresión E. AKT2 en la localización metastásica de ratones pulmones. Se detectó la expresión de la proteína Akt2 en cada ratón, respectivamente. 30 g de proteína total se utilizó para cada muestra
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. ensayo de viabilidad celular antes de la metástasis experimento se llevó a cabo el ensayo de viabilidad celular
24 horas después de la transfección
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0130124.s002 gratis (TIF)
S3 Fig. Adensitometric análisis de la figura 4E
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s003 gratis (TIF)
Tabla S1. . genes diana potenciales de miR-137
Los posibles genes diana de miR-137 se predijo por el software de la línea y se detectó mediante un ensayo de gen indicador de luciferasa dual y bloting WESTERN Hotel doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124. S004 gratis (DOCX)

Reconocimientos

Los autores agradecen al Dr. Feng Chengyuan del Hospital del cáncer, Academia china de ciencias médicas de la asistencia técnica y el artículo de revisión.

• PLOS ONE: Identificación y Caracterización de CXCR4 positivos de cáncer gástrico Stem Cells
• PLOS ONE: Los microARN-217 Funciona como un supresor tumoral en el cáncer gástrico Potencial de focalización GPC5