Финансирование:.. Эта работа была поддержана медицинской науки и техники исследовательских проектов провинции Хэнань, Китай (2011030004)
Конкурирующие интересы: авторы заявил, что не существует никаких конкурирующих интересов.
Введение
<р> рак желудка (GC) является второй частой причиной смерти от рака в мире [1]. До сих пор механизм канцерогенеза желудка в значительной степени неизвестно. Исследователи попытались изучить GC с точки зрения биохимии и молекулярной биологии, что некоторые гены-супрессоры и гены, связанные с опухолью, были зарегистрированы в GC. MicroRNAs (микроРНК) являются эндогенно малые некодирующие РНК из 18 ~ 22 нуклеотидов, которые были идентифицированы как посттранскрипционных регуляторов экспрессии генов [2, 3]. МикроРНК играют важную роль во многих биологических процессах, таких как пролиферация, развитие, дифференцировку и апоптоз. В то же время, микроРНК были проверены, чтобы выступать в качестве онкогенов или генов-супрессоров опухолей во время онкогенеза. Например, микроРНК-31 был идентифицирован как онкоген в пищеводе плоскоклеточного рака [4] и микроРНК-451 функционирует как подавитель опухоли у человека немелкоклеточного рака [5] легкого. Есть также много микроРНК были идентифицированы, связанные с раком желудка происходит и развития [6-13]. Он также сообщил, что избыточная экспрессия MIR-1, микроРНК-20а, микроРНК-27а, микроРНК-34а и микроРНК-423-5p могут быть использованы в качестве диагностических критериев рака желудка [14] .Therefore, микроРНК являются потенциальными кандидаты новых диагностических биомаркеров или терапевтических мишеней рака желудка.
<р> микроРНК-137 (MIR-137) было сообщено, что вниз регулируется и играть роль как подавитель опухоли в колоректального рака и рака полости рта [15, 16]. Тем не менее, функция микроРНК-137 и его механизм, лежащий канцерогенеза желудка до сих пор не очень понятно. Чен и др показали, что микроРНК-137 может играет в качестве супрессора опухоли путем ориентации CDC42 регулировать клеточный цикл при раке желудка [17]. Тем не менее, это ясно нам, что микроРНК регулирует биологические модели поведения многократным образом пути, что может быть более механизм регулирования MIR-137 к ГХ онкогенеза. В данном исследовании мы измеряли экспрессию микроРНК-137 в 100 больных раком желудка и исследовали роль микроРНК-137 в клетках рака желудка. Мы нашли некоторые другие функции микроРНК-137 в GC, а также другой путь путь, по которому микроРНК-137, которую играет роль супрессоров опухоли в GC онкогенеза.
Заявление по этике
Все человеческие исследования были одобрены комитетом по этике и соответствующие поэтому были выполнены в соответствии с этическими нормами. Все лица дали свое осознанное согласие до их включения в исследование.
Общая РНК из тканей и клеток экстрагируют методом Trizol (Ambion, США) полностью следуя инструкциям. Одно цепь кДНК синтезировали с помощью M-MLV (Ambion, США) с использованием 2 мкг общей РНК в качестве матрицы. Олиго (дТ) 18 использовали для обратной транскрипции мРНК в то время как стволовые петли используются для микроРНК. В режиме реального времени ОТ-ПЦР (ОТ-ПЦР) проводили с помощью Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США) с использованием SYBR смеси (Tiangen, Китай). Условием ПЦР: 95 ° С × 30 лет, затем 40 циклов при 95 ° С × 5 сек, 60 ° C × 34S. Для получения мРНК, GAPDH, был использован в качестве нормализованного контроля. Для микроРНК, U6 мяРНК был использован для управления микроРНК. Относительное выражение микроРНК-137 была вычислена методом 2-ΔΔCT. Последовательности праймеров приведены в таблице 1.
Плазмида строительство
<р> Последовательность предшественника микроРНК-137 генерируется путем отжига и MIR-137-предшественника-F и расширение микроРНК-137-предшественник-R был тем временем переварены BamHI и BglII, продукция которого была вставляет фрагмент BamHI-BglII вектора pcDNA-GW /EmGFP-Mir (GenePharma, Китай). В то же время, отрицательный контроль также был построен.
вестерн-блоттинга
<р> Белки были разделены на 10% SDS-PAGE и затем переносили в 0,45 мкм PVDF мембран (Amersham, UK). Мембраны инкубировали с 5% обезжиренным сухим молоком в течение ночи при 4 ° С и с анти-AKT2 моноклональных антител (Proteintech, США) в разведении 1: 1000; анти-Bad моноклональное антитело (BioWorld, США) в разведении 1: 500; анти-ГСК-3B поликлональные антитела (BioWorld, США) в разведении 1: 1000; анти-GAPDH антитела (Proteintech, Чикаго, США) в масштабе 1: 30000 разбавления. После двукратной промывки TBST, мембраны инкубировали с козьим анти-кроличьим антителом (zsgb-био, Китай) в соотношении 1: 5000 и 1:. 50000 разведений в течение 2 ч
Статистика MIR-137 понижающей регуляции в клетках рака желудка и клинические образцы Кроме того, мы оценивали эффекты СИК-137 о миграции клеток и вторжения, которые были ключевыми факторами, определяющими злокачественной прогрессии и метастазирования. Эффекты MIR-137 по миграции клеток были продемонстрированы с помощью заживления ран /царапин анализа в ТЖК-27 и ЮГК-7901 клеток. Оба из двух клеточных линий, обработанных MIR-137 мимической были отчетливо меньше, чем миграционный скремблирования контроля или необработанных клеток в 12, 24 и 36 часов после расчесывания (рис 3А). Кроме того, мы провели анализ вторжения клеток для измерения направленного вторжения способности клеток после микроРНК-137 избыточная экспрессия. В результате, инвазивность клеток, трансфицированных микроРНК-137 имитатор резко уменьшилось по сравнению с скремблирования клетками в ТЖК-27 и СГК-7901 (фиг.3В). Затем эксперименты in vivo на использовались для дальнейшего проверки этого результата. Мы во-первых, показано, что клетки, трансфицированные микроРНК-137 имитируют или мимической контроля не показали значительное снижение жизнеспособности клеток по сравнению с необработанными клетками. Кроме того, нет никакой разницы в жизнеспособности клеток между клетками, трансфицированных MIR-137 мимической по сравнению с отрицательным контролем (S2 рис). Как показано на фиг.3С, биолюминесцентный томография мышей в группе сверхэкспрессии микроРНК-137 показали гораздо меньшее изображение. Кроме того, количество метастазов в легких на мышей в группе микроРНК-137 показали значительно более низкий уровень по сравнению с группой скремблирования, который показал, что микроРНК-137 может подавлять метастазирование в естественных условиях. Эти результаты показали, что микроРНК-137 сыграли важную роль в регуляции клеточной миграции и инвазивности при раке желудка и предположил, что понижающая регуляция СИК-137 может способствовать метастазирования опухоли в желудочном канцерогенезе. Для дальнейшей демонстрации роли микроРНК-137 и AKT2 играл во время онкогенеза, мы исследовали эффект восстановления AKT2 в микроРНК-137 трансфецированных клеток. Вестерн-блот показал, что уровень содержания белка AKT2 в AKT2 сверхэкспрессии образце было очевидно выше, чем у отрицательного контроля даже при подавлении микроРНК-137. Восстановление AKT2 привела к активации инвазии и подавления апоптоза (рис 5). Выражение признательности авторы благодарят доктора Чэньюань Фэн из больницы рака, китайской академии медицинских наук в области оказания технической помощи и пересмотра статьи.
<р> Каждый эксперимент повторяли по меньшей мере три раза. критерий Стьюдента (двусторонний) и х 2 тест были выполнены, и статистически значимый уровень был установлен при а = 0,05 двухсторонним). Среднее ± SD отображается в цифрах.
Результаты
<р> Сначала мы исследовали экспрессию зрелого MIR -137 в 4-желудочных человеческих клеточных линий рака (ТЖК-27, SGC-7901, СГК-7901 и MKN-45) и желудочных эпителиальных клеток (GES-1). Эти ГХ клеточные линии выставлены чрезвычайно низкой экспрессии микроРНК-137 по сравнению с клеточной линией ГЭС-1 (Фиг.1а). Для дальнейшего изучения взаимосвязи MIR-137 с возникновением GC, мы обнаружили экспрессию микроРНК-137 в 100 клинических пациентов (мужчин 56, женщина 44; средний возраст 53 года) с помощью Taqman зонд-рольганг ПЦР в реальном времени, как описано выше. Из 100 образцов GC, экспрессия микроРНК-137 был вниз регулируется в 77 случаях (77%) по сравнению с окружающими тканями, когда отсечной был создан как 1,5. В то же время, микроРНК-137 был до регулируемых в 23 случаях (23%) (рис 1В и 1С). В общем, экспрессия микроРНК-137 в тканях GC была ниже, чем в соседних тканях статистически значимых различий (р = 0,00079, парные Т-тест, с двумя хвостами, рис 1C). Кроме того, мы обнаружили статистически значимую связь между экспрессией микроРНК-137 и рака желудка клинической стадии. Пациенты, которые имеют более низкие уровни экспрессии микроРНК-137 были связаны с высокосортных и поздней стадии опухоли (рис 1D). Эти результаты показывают, что изменения СИК-137 могут быть вовлечены в прогрессии рака желудка.
MIR-137 ингибирует пролиферацию клеток в пробирке и в естественных условиях
<р> Мы трансфицировали микроРНК-137 имитировать в линии GC клеток ТЖК-27 и SGC-7901, оба из которых показали большую эффективность трансфекции (фиг 2А). Результаты анализов роста CCK8 на 0, 1, 2, 3 и 4 сут после микроРНК-137 и скремблирования трансфекцией показаны на рис 2В. По сравнению с скремблирования трансфекцией, микроРНК-137 трансфекция значительно уменьшил пролиферацию обеих клеточных линий (фиг.2В). Затем мы исследовали влияние микроРНК-137 на апоптоза клеток. Ранние апоптотических клеток в группе скремблирования составляла около 10% в HGC-27 и 2,9% в СГК-7901, в то время как после того, как микроРНК-137 трансфекцией, процент ранних апоптотических клеток в ТЖК-27 была увеличена до 17,5% и 8,3% в SGC-7901, что значительно показали разницу (рис 2С). Исходя из этих результатов, можно сделать вывод о том, что микроРНК-137 может подавлять выживаемость клеток рака легких путем индукции на ранней стадии апоптоза.
<Р> Для дополнительной проверки результатов выше, модель в естественных условиях была построена. Мы обнаружили, что рост опухоли была значительно медленнее у мышей избыточной экспрессии микроРНК-137, чем в контрольной группе (рис 2D, 2E и 2G). В соответствии с кривой роста опухоли, массы опухолей, индуцированных скремблирования клеток были значительно выше, чем у по микроРНК-137 сверхэкспрессии (рис 2F). Эти результаты также подтвердили, что избыточная экспрессия микроРНК-137 может ограничивать пролиферацию раковых клеток желудка в естественных условиях.
MIR-137 ингибирует клеточную миграцию и инвазию в пробирке и в естественных условиях
микроРНК-137 цели AKT2 в GC
<р> МикроРНК проводили биологические функции посредством негативной регуляции их генов-мишеней. Как и предполагалось, был взаимодополняемость HAS-MIR-137 и AKT2 3'-UTR (рис 4A).
<Р> Чтобы проверить гипотезу о том, что AKT2 может быть объектом MIR-137, репортер Плазмиду дикий была построена -типа 3'-UTR область AKT2 ниже по потоку от кодирующей области люциферазы (фиг.4А, AKT2_WT). НЕК-293T клетки трансфицировали с репортерной плазмидой (AKT2_WT) и карабкаются. В результате, микроРНК-137, трансфицированные клетки, показали значительное снижение (≈58%) от активности люциферазы (фиг.4В). Затем тот же анализ проводили для другой репортерной плазмидой, содержащей мутировавший AKT2 3'-UTR в сайтах связывания микроРНК-137. Как и ожидалось, ингибирование активности люциферазы на MIR-137 была частично удалена с сайтом связывания 1 или связывания цитируют 2 мутант и почти упразднены в AKT2_MUT двойного мутанта, предполагая, что консервативная область была полностью отвечает за микроРНК-137 функции (рис 4В) .
<р> Для дальнейшего изучения взаимодействия между микроРНК-137 и AKT2, ГГК-27 и ЮГК-7901 клетки трансфицировали микроРНК-137. экспрессия мРНК AKT2 определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Никаких существенных различий не наблюдалось между микроРНК-137-обработанных и карабкаются обработанных или необработанных ТЖК-27 и ЮГК-7901 клеток (рис 4в). Затем Вестерн-блоттинг анализ был проведен для измерения уровня белка AKT2. Мы обнаружили, что экспрессия белка AKT2 был подавлен в микроРНК-137, обработанных ТЖК-27 и ЮГК-7901 клеток, но не в схватку или необработанных клеток (рис 4D). Эти данные свидетельствуют о том, что микроРНК-137 непосредственно признает 3'-UTR мРНК AKT2 и ингибирует AKT2 перевод. Таким образом, вниз регулируется микроРНК-137 при раке желудка ингибирует подавление AKT2, что в свою очередь замедляться туморогенез.
<Р> AKT2 является членом семьи АКТ. Кроме того, мы обнаружены его вниз по течению эффекторов Bad и GSK-B. В результате р-плохой, р-ГСК-В, очевидно, вниз регулируется в MIR-137 обработанных ТЖК-27 и СГК-7901 клетки по сравнению с скремблирования обработанных или необработанных клеток. Никаких существенных изменений не было обнаружено в нефосфорилированном Bad или GSK (рис 4д). Эти данные позволяют предположить, что ускоренный рост клеток желудка рак был частично из-за чрезмерной Actived пути Akt. Помимо содействия пролиферации клеток, Активизированный Akt также может фосфорилировать плохо Ser112 и Ser136, блокирование Bad-индуцированной гибели клеток. При отсутствии фосфорилирования на этих участках, Плохой, как полагают, взаимодействуют с Bcl-XL, чтобы вызвать гибель клеток. В противоположность этому, Akt-опосредованного гиперфосфорилирование Bad может способствовать выживанию клеток в раковых клетках. Наши западные блоттинга результаты подтвердили выше предположение, что изменение желудочной деятельности раковых клеток в состоянии микроРНК-137-трансфецированных клеток может быть вызвано уменьшением фосфорилирование Bad. Кроме того, мы проанализировали уровни протеина AKT2 в 12 GC patientsin которого микроРНК-137 подавлялась. Среди этих образцов, AKT2 был повышающей регуляции in9patientsin их тканей GC (рис 4F).
Восстановление AKT2 привела к активации инвазии и подавление апоптоза
Обсуждение
<р> микроРНК были часто указываемый быть часто дизрегуляции в различных человеческих раковых клеток и некоторых микроРНК имеет даже использовали использовать в качестве терапевтических мишеней рака. Исследования, относящиеся к взаимосвязи между микроРНК и рака могли бы помочь нам с пониманием рака
. <Р> Есть только несколько исследований со ссылкой на роль микроРНК-137 играл в рак желудка. Сообщалось, что микроРНК-137 является отрицательным регулятором Cdc42 и ориентации, которые индукции апоптоза и клеточного цикла G1 арест в клеток рака желудка [17]. Однако регулирование эффект микроРНК при раке является довольно сложным. Это кажется невозможным, что микроРНК-137 регулирует рак желудка путем одиночного пути. В этом исследовании, функции и механизм, микроРНК-137 регулируется рак желудка был исследован.
<Р> Во-первых, мы обнаружили экспрессию микроРНК-137 в 100 пациентов и обнаружили, что экспрессия микроРНК-137 значительно вниз -regulated в образце рака. Кроме того, мы обнаружили статистически значимую связь между экспрессией микроРНК-137 и рака желудка клинической стадии. Эти результаты показывают, что изменения СИК-137 могут быть вовлечены в прогрессии рака желудка. Мы попытались найти связь между микроРНК-137 и пациентов по возрасту и полу, но нет статистики результат не был найден. Поскольку настоящее исследование показало, что экспрессия микроРНК-137 был вниз регулируется в большинстве GC тканей по сравнению с окружающими тканями (77%), мы могли бы рассмотреть вопрос о диагностике и прогностической использования микроРНК-137. Дальнейшее подтверждение в перспективных исследованиях является оправданным и источники более доступные образцы, такие как микроРНК-137-обогащенные опухолевые происхождения экзосомы из крови, должны быть исследованы. Кроме того, следует отметить, что в некоторой степени отрезана значение (отрезана = 1.5) мы выбрали по-прежнему может быть произвольным. Когда это было установлено выше, не может быть меньше пациентов с микроРНК-137 вниз регулируется в раковых тканях. Тем не менее, даже в этом состоянии, там было около 23% раковых заболеваний, имеют высокий уровень экспрессии микроРНК-137. Это может быть связано с индивидуальной разницей среди пациентов, что некоторые лица могут иметь различный характер экспрессии генов во время прогрессии онкогенеза или рака.
<Р> в GC тканях Поскольку экспрессия микроРНК-137 был ниже, чем в соседних тканях статистически значимых различий (р = 0,00079), мы могли бы предположить, что это выражение характеристика была связана с развитием рака. Это предположение было подтверждено в пробирке и в естественных условиях исследования, что микроРНК-137 может негативно регулируют клеточную пролиферацию, миграцию и инвазию. Уровень экспрессии микроРНК-137 может поддерживать на высоком уровне в течение длительного периода после трансфекции как в желудочном линиях раковых клеток, опухолей ксенотрансплантатов терминальной стадии и inmetastatic место в легких (S1A рис-S1C рис). Тем не менее, метод сверхэкспрессия приводит к очень высокому уровню экспрессии микроРНК-137 (рис 2А). Такой высокий уровень микроРНК-137 может вызвать дополнительные эффекты. Например, микроРНК-137 является отрицательным регулятором Cdc42 и Нацеливаясь, которые индуцирования апоптоза и клеточного цикла G1 арест в клеток рака желудка [17]. По мере того как микроРНК-137 в нашем исследовании было повышающей регуляции тысячи раз, это может привести к торможению других целей, таких как Cdc42. Очевидно, что в данном исследовании мы не можем исключить возможность того, что супрессоры опухолей эффекты микроРНК-137 был опосредованное за счет подавления других генов-мишеней.
<Р> Затем мы обнаружили, что микроРНК-137 действует как ген-супрессор опухоли путем таргетирования AKT2 , который является членом семьи АКТ. Восстановление AKT2 вызывает до регулирования AKT2 в микроРНК-137 трансфецированных клеток, что значительно выше, чем в схватку. Это может быть вызвано, что избыточная экспрессия AKT2 вспять уровень микроРНК-137 белка подавлено. Что еще более важно, восстановление AKT2 регулирует апоптоз и инвазии клеток рака желудка, что приводит к активации инвазии и подавления апоптоза (рис 5). Этот эксперимент спасательное является еще одним доказательством, что активный апоптоз клеток микроРНК-137 и отрицательно регулировать вторжение клеток путем ориентации AKT2. В естественных условиях эксперименты также показали, что экспрессия микроРНК-137 является отрицательно по отношению к выражению AKT2 (S1D рис и S1E рис). AKT является решающим фактором PI3K /AKT пути путь. Вниз регулирование AKT2 дополнительно влияет на его вниз поток белка Bad и GSK-3B, что р-Bad и п-GSK-B был явно подавлен. Bad может играть свою роль "фосфорилированием и далее регулировать судьбу клеток [18]. ГСК-3B, который также известен как GSK-3 &beta обычно, контролирует иммиграцию клеток и инвазии. В заключение, мы выявили связь между микроРНК-137 и AKT2, что является новым компонентом желудочного онкогенеза рака. МикроРНК-137 было показано, связано с регулированием AKT2 [19]. В гепатоцеллюлярной карциномой, микроРНК-137 ингибирует рост и метастазирование раковых клеток с помощью таргетинга непосредственно AKT2 [20]. На самом деле мы е были проведены исследования 8 генов в качестве потенциальных мишеней микроРНК-137 (S1 таблица). Тем не менее, AKT2 является единственной прямой мишенью MIR-137 после анализа гена-репортера двойного люциферазы и Вестерн-блот исследования. Из рис 4D мы можем найти thatmiR-137 может повлиять на AKT2 и п-AKT2in оба ТЖК-27 и ЮГК-7901 клеток. Но интересно, что в SGC-7901 статус фосфорилирования по-видимому, повлияло больше. Это явление можно последовательно наблюдать в трех повторных клякс, проведенных нами. Мы вычитаются, что может произойти из-за особого свойства различных раковых клеток. Там может быть конкретный путь регулирования путь микроРНК-137 в SGC-7901, который подавлял статус фосфорилирования AKT2.However, из настоящего исследования, мы не можем полностью объяснить этот механизм. Когда мы выбирали пациентов, которые имеют низкую экспрессию микроРНК-137 в их GC ткани, чтобы обнаружить экспрессию белка AKT2, мы обнаружили, большинство из этих пациентов (9/12) имеют высокий уровень AKT2 в их GC ткани. Этот результат позволяет предположить, что микроРНК-137 могут быть ориентированы на AKT2 у пациентов. Были также трое пациентов, которые имеют низкую экспрессию AKT2 в GC ткани, хотя экспрессия микроРНК-137 является низким. Этот результат может из-за индивидуальных различий среди пациентов.
<Р> В заключение, наше выражение и функциональные исследования позволяют предположить, что микроРНК-137 часто понижающей регуляции при раке желудка может выступать в качестве супрессора опухоли в GC клетки, реинтродукции экспрессия которых на GC клеток подавляется пролиферацию клеток желудка, миграцию и инвазию непосредственно нацеливание AKT2. Таким образом, наши работы является хорошим дополнением к предыдущей работе и полезно для нас, чтобы понять механизм регулирования микроРНК-137 в раке.
Поддержка Информация
S1 Рис. микроРНК-137 и экспрессия AKT2 после трансфекции.
А. выражение микроРНК-137 в ТЖК-27 клеток и SGC-7901 клеток 72 ч после трансфекции. Выражение B. микроРНК-137 в опухолях ксенотрансплантатных терминальной стадии. Выражение C. микроРНК-137 в метастатической локализации мышей легких. Выражение D. AKT2 в метастатической локализации мышей легких. Мы смешали пять легких вместе в той же самой группе. выражение Е. AKT2 в метастатической локализации мышей легких. Мы обнаружили экспрессию белка Akt2 в каждой мыши соответственно. 30 мкг общего белка использовали для каждого образца
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s001
(TIF)
S2 Рис. Анализ жизнеспособности клеток до метастаза эксперимента
анализа жизнеспособности клеток проводили через 24 ч после трансфекции
DOI:.. 10,1371 /journal.pone.0130124.s002
(TIF)
S3 Рис. Adensitometric анализ рис 4E
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s003
(TIF)
S1 Таблица. . Потенциальные целевые гены микроРНК-137
Потенциальные целевые гены микроРНК-137 были предсказаны на программном обеспечении линии и обнаруживаться двойного люциферазы гена-репортера и западного bloting
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0130124. S004
(DOCX)