PLoS ONE: MicroRNA-137 Draagt ​​bij aan Gedempte tumorvorming bij Human MaagKanker door zich te richten AKT2

Abstract

MiRNAs spelen een belangrijke rol in het ontstaan ​​van tumoren. Dit onderzoek richtte zich op het verkennen van de effecten en regulering mechanisme van miRNA-137 op de biologische gedrag van maagkanker. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit weefsels van 100 patiënten met maagkanker en vier maagkanker cellijnen. Expressie van miR-137 werd gedetecteerd door real-time PCR van 100 patiënten. De effecten van miR-137 overexpressie maagkanker cellen proliferatie, apoptose, migratie en invasie vermogen onderzocht in vitro en in vivo. Het doelwit-gen van miR-137 werd voorspeld door Targetscan on line software, gescreend door dual luciferasereportergen test en gedemonstreerd door western blot. Dientengevolge, werd de expressie van miR-137 significant verlaagd maagkanker cellijn HGC-27, HGC-803, SGC-7901 en MKN-45 en bij maagkanker weefsels tegen GES-1 cel of aangepast naastgelegen niet -neoplastic weefsels ( p Restaurant < 0,001). De herinvoering van miR-137 in de maag kankercellen in staat was om celproliferatie, migratie en invasie te remmen. De in vivo experimenten toonden dat de miR-137 overexpressie de maag proliferatie en metastase van kankercellen kunnen verlagen. Bioinformatica en western blot analyse gaf aan dat de miR-137 fungeerde als tumor suppressor rollen op maagkanker cellen door targeting AKT2 en verder invloed zijn op de Slechte en GSK-3β. Kortom, de miR-137, die vaak down-gereguleerd bij maagkanker is mogelijk betrokken bij maagkanker tumorvorming en metastase door het reguleren van AKT2 gerelateerd signaal paden

Visum:. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu J, Yang w, et al. (2015) MicroRNA-137 Draagt ​​bij aan Gedempte tumorvorming bij Human MaagKanker door zich te richten AKT2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10.1371 /journal.pone.0130124

Academic Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 15 augustus 2014; Geaccepteerd: 18 mei 2015; Gepubliceerd: 23 juni 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:.. Dit werk werd ondersteund door de medische wetenschap en technologie onderzoeksprojecten van de provincie Henan, China (2011030004)

Concurrerende belangen: de auteurs hebben verklaarde dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Introductie

Maagkanker (GC) is de tweede doodsoorzaak door kanker in de wereld [1]. Tot nu toe, het mechanisme van de maag carcinogenese is grotendeels onbekend. De onderzoekers hebben geprobeerd GC bestuderen vanuit het standpunt van de biochemie en moleculaire biologie sommige tumorsuppressorgenen en tumor-gerelateerde genen zijn gemeld bij GC. MicroRNAs (miRNAs) zijn endogeen kleine niet-coderende RNA's van 18 ~ 22 nucleotiden die zijn geïdentificeerd als posttranscriptionele regulatoren van genexpressie [2, 3]. MiRNAs spelen cruciale rol in veel biologische processen zoals proliferatie, ontwikkeling, differentiatie en apoptose. Inmiddels zijn miRNAs gevalideerd om als oncogenen en tumorsuppressorgenen tijdens tumorigenese. Zo werd miR-31 geïdentificeerd als een oncogen in esophageal plaveiselcelcarcinoom [4] en miR-451 functioneert als een tumor suppressor in humane niet-kleincellige longkanker [5]. Er zijn ook veel microRNAs werden geïdentificeerd in verband met maagkanker gebeurt en ontwikkeling [6-13]. Ook is gemeld dat overexpressie van miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34a en miR-423-5p kan worden gebruikt als diagnostische criteria van maagkanker [14] .Daarom miRNAs zijn potentiële kandidaten van nieuwe biomerkers diagnostische of therapeutische doelwitten van maagkanker.

MicroRNA-137 (miR-137) werd gerapporteerd dat neerwaarts gereguleerd en rollen als tumor suppressor in colorectale kanker en mondkanker [15, 16]. Echter, de functie van miR-137 en het mechanisme onderliggende maag carcinogenese zijn nog steeds niet erg duidelijk. Chen et al gebleken dat miR-137 kan spelen als een tumorsuppressor doelwit CDC42 celcyclus reguleren maagkanker [17]. Zelfs zo, het is duidelijk voor ons dat de microRNA regelt biologische gedrag door meerdere manier pad dat er meer regulering mechanisme van miR-137 in de richting van GC het ontstaan ​​van tumoren zou kunnen zijn. In deze studie, maten we de expressie van miR-137 in 100 patiënten met maagkanker en onderzochten de rol van miR-137 in maagkanker cellen. We vonden een aantal andere functies van miR-137 in GC evenals een ander pad manier waarop miR-137 een rol van de tumor suppressor gespeeld in GC het ontstaan ​​van tumoren.

Materialen en methoden

Ethics statement

Alle menselijke studies zijn goedgekeurd door de bevoegde ethische commissie en zijn daarom uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen. Alle personen die gaven hun geïnformeerde toestemming voorafgaand aan hun opname in de studie.

Patiënten en monsters

Human maagkanker monsters werden verzameld van chirurgische monsters van 100 patiënten (56 mannen, vrouwen 44) met GC bij het Cancer Institute en ziekenhuis, First Affiliated Hospital van de Universiteit Henan; de Tweede Ziekenhuis van de People's Liberation Army of China; Hebei Hospital Cancer. Niet-tumormonsters van de macroscopische tumor marge werden geïsoleerd tegelijk en als de afgedekte naburige niet-neoplastische weefsels. Alle monsters werden verdeeld in twee delen. Weefselmonsters werden verzameld onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot RNA-extractie. Het gebruik van het weefsel monsters voor alle experimenten werd goedgekeurd door de ethische raad van bestuur van het Instituut voor Basic Medische Wetenschappen, de Chinese Academie van Medische Wetenschappen. Alle deelnemers ontvangen hun verbale geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan deze studie, en hun verbale geïnformeerde toestemming werden opgeschreven. Dit onsent proces werd ook goedgekeurd door de ethische raad van bestuur. Vier maagkanker cellijnen (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 en MKN-45) werden allemaal bewaard laboratoriumwaarden gehandhaafd in DMEM of 1640 met 10% FBS.

RNA-extractie, cDNA-synthese en real-time PCR assays

Totaal RNA uit weefsels en cellen werd geëxtraheerd met Trizol methode (Ambion, USA) volgens de instructies volledig. Enkele cDNA streng werd gesynthetiseerd door M-MLV (Ambion, USA) onder toepassing van 2 pg totaal RNA als matrijs. Oligo (dT) 18 werd gebruikt voor reverse transcriptie van mRNA terwijl stamlus voor miRNA. Realtime-PCR (RT-PCR) werd uitgevoerd door Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) met behulp SYBR mix (Tiangen, China). De PCR voorwaarde was: 95 ° C × 30s, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C x 5 seconden, 60 ° C × 34s. Voor mRNA werd GAPDH als controle genormaliseerd. Voor miRNAs, werd U6 snRNA gebruikt voor miRNA controle. De relatieve expressie van miR-137 werd berekend door 2-ΔΔCT methode. Primersequenties worden getoond in Tabel 1.

Plasmideconstructie

De miR-137 precursor sequentie gegenereerd door gloeien en miR-137-precursor-F en miR-137-precursor-R verlenging daarnaast is verteerd door BamHI en BglII, de producten die inserts in de BamHI-BglII fragment van pcDNA-GW /EmGFP miR-vector (GenePharma, China). Bij de tussentijd werd negatieve controle ook gebouwd.

Cel cultuur en transfectie miRNA

De cellijnen HGC-27, SGC-7901 MKN-45 en GES-1 werd gekocht van de Cell Resource centrum van Institute of Basic Medische Wetenschappen, de Chinese Academie van Medische Wetenschappen en Peking Union Medical College (Beijing, China). De menselijke maag cellijnen HGC-27, SGC-7901 en MKN-45 werden gekweekt in RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en menselijke maag epitheel cellijn GES-1 werd in DMEM ( Gibco, BRL, UK) media. De miR-137 na te bootsen en de scramble na te bootsen die niet-homoloog aan het menselijk genoom werden gesynthetiseerd door GenePharma (Shanghai, China) en getransfecteerd in de cellen tot een uiteindelijke oligonucleotide concentratie van 10nmol /l. Alle transfecties werden cellen geïntroduceerd door DharmaFECT1 Reagent (Dharmacon, TX, USA) volgens de gebruikte instructies van de fabrikant. Voor elke cel transfectie werden twee of drie replicatie experimenten uitgevoerd.

celproliferatie en apoptose-assay

celproliferatie assay werd uitgevoerd door CCK8 methode (DOJINDO, Japan). Kort samengevat, werden de ongeveer 5000 miR-137 mimic getransfecteerde cellen en cellen scramble respectievelijk geënt in 96 putjes en gekweekt. Proliferatiesnelheden werden bij 0, 12, 24, 48, 72, 96 uur na transfectie door toevoeging van 10 ui CCK8 regent en getest volgens de handschriften. De apoptose-assays werden getest in HGC-27 en SGC-7901 cellijnen met of zonder miR-137 overexpressie door Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, USA) en C6 stromingscytometer (USA).

celmigratie invasie assays

We voerden de wondgenezing assay voor celmigratie vermogen met of zonder miR-137 transfectie te testen. De kunstmatige wonden werden geproduceerd op de confluente monolaag met FBS vrij, met een 200 pi pipettip op 24 uur na transfectie miR-137. De beelden werden genomen op respectievelijk 0, 12, 24 en 36 uur na wond creëren.

Vervolgens uitgevoerd transwell assays cellen invasie vermogen evalueren. 5 x 10 ^{4 cellen gesuspendeerd in 200 pl medium zonder FBS werden op de bovenste kamer van elk insert met 430μl van 1 mg /ml Matrigel (Millipore, USA). 600μl medium met 10% FBS als de voedingswaarde lokstof werd in de Tweede Kamer. Na 24 uur worden de cellen bevestigd aan het onderoppervlak van de kamer waren fi XED 20 min met 20% methanol en gekleurd gedurende 10 minuten met 10% maygruwald-Giemsa (MGG). De invasie membranen werden vervolgens gekapt en embedded onder dekking slips. We telden de cellen in 3 verschillende visie-velden in staat met 20 × magni fi catie die vervolgens werden gebruikt als het gemiddelde aantal cellen. Alle testen werden uitgevoerd in drie onafhankelijke experimenten.}

Animal experiment

De experimenten met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en de institutionele ethische richtlijnen voor dierproeven. Het protocol werd goedgekeurd door het Comité voor de ethiek van dierproeven van de CAMS (Chinese Academie van Medische Wetenschappen) (Permit Number: C72-14-0664). Alle operatie werd uitgevoerd onder natriumpentobarbital verdoving, en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. Scramble-getransfecteerde en miR-137 overexpressie HGC-27-cellen (5 x 10 ^{6 cellen) werden s.c. in het dorsale flanken van BALB /c naakt muizen (vrouwelijke, nu /nu, 6 weken oud), die allemaal werden uit de Animal Centre van de Universiteit Henan gekocht en getogen in pathogeen-vrije omstandigheden. Het volume van de tumor werd gemeten gedurende 5 weken. Alle muizen werden gedood en s.c. tumoren werden uitgesneden en het gewicht van tumoren getest. Voor metastase in vivo experimenten werden HGC-27 cellen verzameld 24 uur na transfectie. De levensvatbaarheid van de cellen werd uitgevoerd met gebruikmaking van een XTT assay Kit24 uur na transfectie volgens de instructies van de fabrikant (Roche, Tokyo, Japan). Dan de muizen (vrouwelijke, Nu /Nu, 6 weken oud) werden geïnjecteerd met HGC-27 cellen met of zonder miR-137 overexpressie door de staartader met 2 x 10 5 cellen in PBS. De HGC-27 cellen werden gemodificeerd die stabiel kunnen uitdrukken luciferase (gebouwd door GENECHEM, Shanghai, China). De cellen werden gecontroleerd door de microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen waren in goede staat. Na zes weken werd bioluminescentie beeldvorming uitgevoerd met behulp van een IVIS Spectrum en imago uitstraling waarden werden genormaliseerd met behulp van Living Image (Remklauw Life Science, USA).}

Immunohistochemie

Weefsels werden ingebed in paraffine secties en behandeld 2 uur bij 65 ° C en vervolgens deparaffinised. Voordat de primaire antilichamen bij 4 ° C overnacht, voerden we het antigen herstel stap. Daarna werden objectglaasjes geïncubeerd met secundair antilichaam ongeveer 2 uur bij 25 ° C geconjugeerd aan HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, China). Liquid DAB + Substraat (zsgb-bio, China) werd gebruikt voor detectie van het HRP-activiteit.

Luciferase miRNA doelwit reporter assay

De volledige lengte van de 3'UTRs van menselijke AKT2 mRNAs waren elke PCR geamplificeerd en gekloneerd in de PMIR-REPORTTM luciferase vector (Ambion, USA) aan de reporters genereren. Mutaties van de voorspelde zaad gebieden in het mRNA sequenties werden gemaakt met primers waaronder de gemuteerde plaatsen. HEK-293T-cellen werden gezaaid in 24-putjes platen (1 x 10 ^{5 cellen per putje) de dag voor transfecties werden uitgevoerd. Cellen (-70% confluent) werden met pRL-TK luciferase reporters (50 ng /putje), pGL-3firefly luciferase (10 ng /putje), en mimic-137 (50 nmol /L, GenePharma, Shanghai, China) of scramble (50 nmol /L) met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Luciferase activiteiten werden gemeten met de Dual Luciferase Reporter Assay (Promega, USA).}

Western blotting

de eiwitten werden gescheiden op 10% SDS-PAGE en vervolgens overgebracht naar 0,45 urn PVDF-membranen (Amersham, UK). De membranen werden geïncubeerd met 5% magere melkpoeder nacht bij 4 ° C met anti-AKT2 monoklonaal antilichaam (Proteintech, VS) bij 1: 1000 verdunning; anti-Bad monoklonaal antilichaam (Bioworld, VS) bij 1: 500 verdunning; anti-GSK-3B polyklonaal antilichaam (Bioworld, VS) bij 1: 1000 verdunning; anti-GAPDH antilichaam (Proteintech, Chicago, USA) en 1: 30.000 verdunning. Na tweemaal wassen met TBST werden de membranen geïncubeerd met geit anti-konijn antilichaam (zsgb-bio, China) en 1: 5000 en 1:. 50.000 verdunningen gedurende 2 uur

Statistieken

Elk experiment werd ten minste driemaal herhaald. Student's t-test (tweezijdig) en de x ^{2-test werden uitgevoerd, en statistisch significant niveau werd vastgesteld op α = 0.05 twee-side). De gemiddelde ± SD wordt weergegeven in de cijfers.}

Resultaten

MiR-137 is down-gereguleerd bij maagkanker cellen en klinische monsters

We hebben eerst gekeken naar de expressie van volwassen miR -137 4 in menselijke maagkanker cellijnen (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 en MKN-45) en de maag epitheelcel (GES-1). Deze GC cellijnen vertoonden buitengewoon lage expressie van miR-137 in vergelijking met de GES-1 cellijn (Figuur 1A). Om de relatie van miR-137 met GC optreden nader te onderzoeken, ontdekt we de expressie van miR-137 bij 100 klinische patiënten (mannen 56, vrouwen 44, gemiddelde leeftijd 53 jaar) door Taqman-probe drived real-time PCR zoals hierboven beschreven. Van de 100 GC monsters, de expressie van miR-137 werd down-gereguleerd in 77 gevallen (77%) in vergelijking met aangrenzende weefsels als de cut off werd opgezet als 1.5. Ondertussen, miR-137 werd up-gereguleerd in 23 gevallen (23%) (figuur 1B en 1C). In het algemeen is de expressie van miR-137 in GC weefsels was lager dan in aangrenzende weefsels in statistisch significante verschillen (p = 0.00079, gepaarde t-test, tweezijdig, figuur 1C). Ook hebben we een statistisch significante associatie tussen de expressie van miR-137 en maagkanker klinische fase gevonden. De patiënten die de lagere niveaus van miR-137 expressie waren geassocieerd met hoogwaardige en late stadium tumoren (figuur 1D). Deze resultaten geven aan dat veranderingen van miR-137 kon worden betrokken bij maagkanker progressie.

MiR-137 remt celproliferatie in vitro en in vivo

We getransfecteerde miR-137 nabootsen in GC cellijnen HGC-27 en SGC-7901, die beide bleef uitstekend transfectie efficiency (figuur 2A). De resultaten van CCK8 groei assays op 0, 1, 2, 3 en 4 d na miR-137 en scramble transfectie wordt in Fig 2B. Vergeleken met scramble transfectie, miR-137 transfectie significante daling van de proliferatie van beide cellijnen (Fig 2B). Vervolgens onderzochten we het effect van miR-137 op apoptose. De vroege apoptotische cellen in de scramble groep ongeveer 10% in HGC-27 en 2,9% in SGC-7901, terwijl na miR-137 transfectie was het percentage vroege apoptotische cellen in HGC-27 verhoogd tot 17,5% en 8,3% in SGC-7901, die aanzienlijk verschil vertoonden (figuur 2C). Uit deze resultaten kan worden geconcludeerd dat miR-137 longkanker celoverleving kunnen onderdrukken door het induceren vroege apoptose.

De resultaten verder te verifiëren hierboven, een in vivo model werd geconstrueerd. We vonden dat de groei van tumoren was significant lager in de miR-137 overexpressie muizen dan in de controlegroep (figuur 2D, 2E en 2G). In overeenstemming met de groei van de tumor curve, het gewicht van tumoren geïnduceerd door scramble cellen waren aanzienlijk hoger dan die van de miR-137-overexpressie (figuur 2F). Deze resultaten bevestigden dat miR-137 overexpressie de maag kankercelproliferatie in vivo kunnen beperken.

MiR-137 remt celmigratie en invasie in vitro en in vivo

We verder onderzocht de effecten van miR-137 op mobiele migratie en invasie, die de belangrijkste determinanten van kwaadaardige progressie en metastase waren. De effecten van miR-137 op celmigratie werden aangetoond door een wondgenezing /scratch test bij HGC-27 en SGC-7901-cellen. Beide twee cellijnen behandeld met miR-137 mimic waren opvallend minder dan trekkende scramble control of onbehandelde cellen bij 12, 24 en 36 uur na krabben (figuur 3A). Verder voerden we cel invasie test om de directionele invasie mogelijkheden van de cellen na miR-137 overexpressie te meten. Dientengevolge werd de invasiviteit van cellen getransfecteerd met miR-137 mimic drastisch gedaald in vergelijking met de scramble cellen in HGC-27 en SGC-7901 (Figuur 3B). Vervolgens werden in vivo experimenten toegepast om dit resultaat verder te verifiëren. We eerst aangetoond dat cellen die met miR-137 nabootsen of nabootser bedieningsorgaan een significante afname in cellevensvatbaarheid in vergelijking met onbehandelde cellen waren weggelaten. Er is geen verschil in de levensvatbaarheid van cellen tussen de cellen die met miR-137 mimic vergelijking met de negatieve controle (Fig S2). Zoals getoond in figuur 3C, de bioluminescent beeldvorming van muizen in de miR-137 overexpressie groep een veel kleinere afbeelding. Ook het aantal longmetastasen per muizen in miR-137 groep vertoonde een significant lager in vergelijking met scramble groep, waaruit bleek dat miR-137 kon onderdrukken metastase in vivo. Deze resultaten toonden aan dat miR-137 een belangrijke rol gespeeld bij het reguleren van de cel migratie en invasiviteit bij maagkanker en suggereerde dat de down-regulatie van miR-137 zou kunnen bijdragen aan tumor uitzaaiingen in de maag carcinogenese.

miR-137 richt AKT2 in GC

MiRNAs uitgevoerd biologische functies door middel van een negatief reguleren van hun target genen. Zoals voorspeld, was er complementariteit tussen has-miR-137 en AKT2 3'-UTR (figuur 4A).

Om de hypothese dat AKT2 een doelwit van miR-137 zou kunnen testen, een reporter plasmide het wild -type 3'-UTR regio AKT2 stroomafwaarts van de luciferase coderende gebied (figuur 4A, AKT2_WT) geconstrueerd. HEK-293T-cellen werden gecotransfecteerd met reporterplasmide (AKT2_WT) en scramble. Hierdoor miR-137 getransfecteerde cellen vertoonden een duidelijke afname (≈58%) luciferaseactiviteit (Figuur 4B). Vervolgens werd dezelfde test uitgevoerd voor een reporter plasmide dat gemuteerd AKT2 3'-UTR van miR-137-bindingsplaatsen. Zoals verwacht werd de remming van luciferaseactiviteit door miR-137 gedeeltelijk verwijderd met bindingsplaats 1 of bindende citeren 2 mutant en bijna afgeschaft in de AKT2_MUT dubbele mutant, wat suggereert dat de geconserveerde gebied was volledig verantwoordelijk voor miR-137-functie (Fig 4B) .

Om verder te onderzoeken van de interactie tussen miR-137 en AKT2, HGC-27 en SGC-7901-cellen werden met miR-137. AKT2 mRNA expressie werd bepaald door real-time PCR. Geen significant verschil waargenomen tussen miR-137-behandelde en-scramble behandeld of onbehandeld HGC-27 en SGC-7901-cellen (figuur 4C). Vervolgens werd western blot analyse uitgevoerd om het niveau van AKT2 eiwit te meten. We vonden dat de expressie van AKT2 eiwit beneden werd geregeld in miR-137 behandelde HGC-27 en SGC-7901-cellen, maar niet in scramble of onbehandelde cellen (Fig 4D). Deze gegevens suggereren dat miR-137 herkent direct de 3'-UTR van AKT2 mRNA en remt AKT2 vertaling. Aldus downgereguleerde miR-137 in maagkanker remt de onderdrukking van AKT2, waardoor vertragen tumorigenese.

AKT2 is lid van AKT familie. We verder gedetecteerd haar downstream effectoren Bad en GSK-B. Dientengevolge, de p-Bad en p-GSK-B was duidelijk downgereguleerde in miR-137 behandelde HGC-27 en SGC-7901-cellen vergeleken met scramble behandelde of onbehandelde cellen. Geen significante verandering werd gevonden in niet-gefosforyleerd Bad of GSK (figuur 4E). Deze bevindingen suggereren dat de versnelde maag groei van kankercellen was deels te wijten aan de over-actived Akt trajecten. Naast het bevorderen van celproliferatie, kan actived Akt ook fosforyleren slecht Ser112 en Ser136, het blokkeren van Bad-geïnduceerde celdood. Bij gebrek aan fosforylatie op deze plaatsen wordt gedacht Bad interactie met Bcl-xl tot celdood. Daarentegen kan Akt-gemedieerde hyperfosforylering Bad celoverleving in kankercellen bevorderen. Onze Western blotting resultaten bevestigden het bovenstaande speculatie dat de verandering van maagkanker cel activiteiten in de toestand van miR-137-getransfecteerde cellen een gevolg zou kunnen zijn van verminderde fosforylering van Bad. Verder analyseerden we het eiwit niveaus van AKT2 in 12 GC patientsin wie miR-137 werd down-gereguleerd. Onder deze monsters AKT2 werd opwaarts gereguleerd in9patientsin hun GC weefsels (figuur 4F).

Het herstel van AKT2 geleid tot een activering van invasie en onderdrukking van apoptose

Om verder aan te tonen de rol van miR-137 en AKT2 gespeeld tijdens het ontstaan ​​van tumoren, onderzochten we het effect van de restauratie van AKT2 in miR-137 getransfecteerde cellen. De western blot toonde dat het AKT2 eiwitgehalte in AKT2 overexpressie monster blijkbaar hoger dan die van de negatieve controle zelfs onder de onderdrukking van miR-137. De restauratie van AKT2 geleid tot een activering van invasie en een onderdrukking van apoptose (figuur 5).

Discussie

miRNAs zijn vaak aangegeven vaak ontregeld in verschillende menselijke kankers en een aantal miRNAs heeft zelfs gebruikt als therapeutica doelwit van kanker. Het onderzoek met betrekking tot de relatie tussen miRNAs en kanker zou kunnen ons te helpen met het begrijpen van kanker.

Er zijn slechts een paar onderzoeken verwijst de rol miR-137 gespeeld bij maagkanker. Vermeld is dat miR-137 is een negatieve regulator van Cdc42 en doelwit die induceren van apoptose en celcyclus G1 arrest bij maagkanker cellen [17]. Echter, de regulering effect van microRNA bij kanker is vrij ingewikkeld. Het lijkt onmogelijk dat de miR-137 regelt de maagkanker door de enige route. In dit onderzoek, de functie en het mechanisme dat miR-137 gereguleerd maagkanker werd verder onderzocht.

In de eerste plaats, ontdekt we de expressie van miR-137 op de 100 patiënten en vond dat de expressie van miR-137 is aanzienlijk omlaag gereguleerde bij kanker monster. Ook hebben we een statistisch significante associatie tussen de expressie van miR-137 en maagkanker klinische fase gevonden. Deze resultaten geven aan dat veranderingen van miR-137 kon worden betrokken bij maagkanker progressie. We hebben geprobeerd om de relatie tussen miR-137 en de patiënt leeftijd en geslacht, maar geen statistische resultaat werd gevonden. Aangezien de huidige studie toonde aan dat de expressie van miR-137 werd down-gereguleerd in het grootste deel van de GC weefsels in vergelijking met aangrenzende weefsels (77%), kunnen we overwegen over de diagnose en prognose gebruik van miR-137. Verdere validatie in prospectieve studies is gerechtvaardigd en toegankelijker monsters bronnen, zoals miR-137-verrijkt tumor afgeleide exosomes uit het bloed, moeten worden onderzocht. Ook moet worden opgemerkt dat in zekere mate de afkapwaarde (onderbroken = 1,5) kozen we nog willekeurig kan zijn. Toen het hoger werd ingesteld, zou er minder patiënten met miR-137 naar beneden gereguleerd bij kanker weefsels. Zelfs in deze toestand, was ongeveer 23% van de kankers hoge miR-137 expressie. Dit kan te wijten zijn aan de individuele verschillen tussen de patiënten dat sommige individuen verschillende genexpressie patroon tijdens tumorigenese of progressie van kanker kunnen hebben.

Aangezien de expressie van miR-137 in GC weefsels was lager dan in aangrenzende weefsels statistisch significante verschillen (p = 0.00079), kunnen we speculeren dat deze uitdrukking eigenschap geassocieerd met de ontwikkeling van kanker. Deze speculatie werd bevestigd door in vitro en in vivo studies die de miR-137 negatief kan reguleren celproliferatie, migratie en invasie. De miR-137 expressie niveau kan blijven op een hoog niveau gedurende een lange periode na transfectie zowel bij maagkanker cellijnen, eindstadium xenograft tumoren en inmetastatic locatie in de longen (S1A Fig-S1C figuur). De overexpressie werkwijze leidt tot zeer hoge expressieniveaus van miR-137 (Figuur 2A). Dit hoge niveau van miR-137 kunnen extra effecten veroorzaken. Bijvoorbeeld, miR-137 is een negatieve regulator van Cdc42 en door zich te richten die apoptose en celcyclus G1 arrestatie in maagkanker cellen [17] induceren. Aangezien de miR-137 in onze studie werd opgereguleerd duizenden keren, kan leiden tot de remming van andere doelwitten zoals Cdc42. Uiteraard, in deze studie kunnen niet uit dat de tumor suppressor effecten van miR-137 werd gemedieerd door het onderdrukken van andere doelgenen te sluiten.

Vervolgens vonden we dat miR-137 werkt als een tumorsuppressorgen door targeting AKT2 , een lid van AKT familie. Het herstel van AKT2 veroorzaakt het omhoog regulatie van AKT2 in miR-137 getransfecteerde cellen, die veel hoger is dan in scramble. Dit kan te wijten aan dat de AKT2 overexpressie omgekeerd het eiwitgehalte miR-137 onderdrukt. Belangrijker is dat de restauratie van AKT2 regelt de apoptose en invasie van maagkanker cellen, wat leidt tot een activering van invasie en onderdrukking van apoptose (figuur 5). Deze redding experiment levert verder bewijs dat de miR-137 actieve cel apoptose en negatief te reguleren cel invasie door zich te richten AKT2. In vivo-experimenten ook aangetoond dat de miR-137 expressie is negatief ten opzichte van de AKT2 expressie (Fig S1D en S1E figuur). AKT is een cruciale factor van PI3K /AKT pad manier. De regulering van AKT2 verdere invloed is op haar downstream eiwitten Bad en GSK-3B, dat de p-Bad en p-GSK-B uiteraard naar beneden was geregeld. Bad kan zijn 'rol spelen door fosforylering en nader geregeld het lot van de cel [18]. GSK-3B, die meestal ook bekend als GSK-3β bestuurt de cel migratie en invasie. Concluderend hebben we een verband tussen miR-137 en AKT2 dat een nieuw bestanddeel van maagkanker tumorigenese geïdentificeerd. Het miR-137 is aangetoond als zijnde gerelateerd aan AKT2 regelgeving [19]. In leverkanker, miR-137 remt de groei van kankercellen en metastase via direct gericht AKT2 [20]. In feite hebben we e 8 genen als potentiële doelwitten van miR-137 (S1 Table) gescreend. Echter, de AKT2 is de enige directe doelwit van miR-137 na dual luciferasereportergen test en western blot onderzoek. Uit figuur 4D kunnen we thatmiR-137 kan invloed hebben op de AKT2 en p-AKT2in zowel HGC-27 en SGC-7901-cellen. Maar interessant, in SGC-7901 de fosforylering status werd blijkbaar beïnvloed. Dit verschijnsel kan consistent waargenomen in de drie herhaalde blots we uitgevoerd. We afgeleid dat er kan worden veroorzaakt door de bijzondere eigenschap van verschillende kankercellen. Er zou specifieke regelgeving pad weg van miR-137 in SGC-7901 die de fosforylering status van AKT2.However verdrongen, uit het huidige onderzoek, we kunnen niet volledig dit mechanisme uit te leggen. Toen we patiënten met lage expressie van miR-137 in hun GC weefsel om de AKT2 eiwitexpressie te detecteren kozen, vonden we de meeste van deze patiënten (9/12) een hoge AKT2 niveau in hun GC weefsel. Dit resultaat suggereerde dat de miR-137 kon richten AKT2 bij patiënten. Er waren ook drie patiënten met lage expressie van AKT2 in GC weefsel hoewel de expressie van miR-137 is laag. Dit resultaat kan als gevolg van de individuele verschillen tussen patiënten.

Tot slot, onze expressie en functionele studies suggereerden dat de miR-137 is vaak-down gereguleerd bij maagkanker kan fungeren als een tumor suppressor in GC cellen, de herinvoering waarvan de expressie van GC-cellen onderdrukte maagkanker celproliferatie, migratie en invasie door direct targeting AKT2. Dus onze werken is een goede aanvulling op het eerdere werk en is nuttig voor ons om de miR-137 reguleringsmechanisme bij kanker te begrijpen.

Ondersteunende informatie
S1 Fig. miR-137 en AKT2 expressie na transfectie.
A. miR-137 expressie in HGC-27 cellen en SGC-7901 cellen 72 uur na transfectie. B. miR-137 uitdrukking in het eindstadium xenograft tumoren. C. miR-137 expressie in metastatische lokalisatie van muizen longen. D. AKT2 expressie in metastatische lokalisatie van muizen longen. We gemengd de vijf longen samen in dezelfde groep. E. AKT2 expressie in metastatische lokalisatie van muizen longen. We merken op dat de Akt2 eiwitexpressie in elke muis respectievelijk. 30 ug totaal eiwit werd gebruikt voor elk monster
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s001
(TIF)
S2 Afb. Cel levensvatbaarheid assay voordat metastase experiment
levensvatbaarheid van de cellen werd uitgevoerd 24 uur na de transfectie
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0130124.s002
(TIF)
S3 Fig. Adensitometric analyse van figuur 4E
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s003
(TIF)
S1 Table. . Potentieel doelwit genen van miR-137 Ondernemingen De potentieel doelwit genen van miR-137 werden voorspeld door on-line software en gedetecteerd door dual luciferasereportergen test en westerse bloting
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124. S004
(docx)

Dankwoord

De auteurs danken dr Chengyuan Feng aan kanker ziekenhuis, de Chinese academie van medische Wetenschappen voor technische bijstand en artikel revisie.

• PLoS ONE: Identificatie en karakterisering van CXCR4-positieve maagkanker Stem Cells
• PLoS ONE: De MicroRNA-217 Functies als een potentiële tumor suppressor bij maagkanker door zich te richten GPC5