PLOS ONE: MicroRNA-137 Contribui para antivibratório Tumorigênese no câncer gástrico humano por Segmentação AKT2

Abstract

MiRNAs desempenham um papel importante na tumorigênese. Este estudo incidiu sobre a explorar o mecanismo de efeitos e regulação do miRNA-137 sobre os comportamentos biológicos do câncer gástrico. O ARN total foi extraído a partir de tecidos de 100 doentes com cancro gástrico e a partir de quatro linhas celulares de cancro gástrico. Expressão de miR-137 foi detectado por PCR em tempo real a partir de 100 pacientes. Os efeitos da sobre-expressão de miR-137 na capacidade de proliferação, apoptose, migração e invasão de células gástricas cancerosas 'foram investigados in vitro e in vivo. O gene alvo de miR-137 foi prevista por TargetScan em software linha, rastreados pelo ensaio de gene repórter de luciferase dupla e demonstrado por western blot. Como um resultado, a expressão do miR-137 foi significativa redução na linha celular de cancro gástrico HGC-27, HGC-803, a SGC-7901 e MKN-45, bem como em tecidos de cancro gástrico em comparação com a célula de GES-1 ou combinados adjacente não tecidos -neoplastic ( p Art < 0,001). A re-introdução de miR-137 em células de cancro gástrico foi capaz de inibir a proliferação celular, migração e invasão. As experiências in vivo demonstraram que a sobre-expressão de miR-137 pode reduzir a proliferação de células de cancro gástrico e metástase. Bioinformática e análise de western blot indicaram que o miR-137 agiu como papéis supressores de tumor em células cancerosas gástricas orientando AKT2 e afetando ainda mais a GSK-3β Bad e. Em conclusão, o miR-137, que é frequentemente regulada no cancro gástrico é potencialmente envolvidos na tumorigênese câncer gástrico e metástase, regulando vias de sinalização relacionadas AKT2

Citation:. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Y, W Yang, et ai. (2015) MicroRNA-137 Contribui para antivibratório Tumorigênese no câncer gástrico humano por Segmentação AKT2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10.1371 /journal.pone.0130124

Editor do Academic: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos

Recebido: 15 Agosto, 2014; Aceito: 18 de maio de 2015; Publicação: 23 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte Informações

financiamento:.. Este trabalho foi apoiado pela ciência e tecnologia médica projectos da província de Henan investigação, China (2011030004)

Conflito de interesses: os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer gástrico (GC) é a segunda causa frequente de morte por câncer no mundo [1]. Até agora, o mecanismo da carcinogénese gástrica é em grande parte desconhecida. Os investigadores têm tentado estudar CG a partir da vista de bioquímica e biologia molecular, que alguns genes supressores de tumores e genes relacionados com o tumor foram relatados em GC. MicroRNAs (miRNAs) são endogenamente pequenos RNAs não-codificantes de 18 ~ 22 nucleótidos que foram identificados como reguladores pós-transcricional da expressão do gene [2, 3]. MiRNAs desempenham papéis críticos em muitos processos biológicos, tais como a proliferação, desenvolvimento, diferenciação e apoptose. Enquanto isso, miARNs ter sido validada para funcionar como oncogenes ou genes supressores de tumor durante a tumorigénese. Por exemplo, o miR-31 foi identificado como um oncogene em carcinoma de células escamosas do esôfago [4] e miR-451 funciona como um supressor tumoral no cancro humano não-pequenas do pulmão de células [5]. Há também muitos microRNAs foram identificadas relacionadas com câncer gástrico acontecendo e desenvolvimento [6-13]. Também tem sido relatado que a sobre-expressão de miR-1, miR-20a, miR-27a, 34a-miR e miR-423-5p podem ser usados ​​como critérios de diagnóstico de cancro gástrico [14] .Portanto, miARNs são potencial candidatos de novos biomarcadores de diagnóstico ou alvos terapêuticos do câncer gástrico.

MicroRNA-137 (miR-137) tem sido relatada a ser regulada para baixo e desempenham papéis como um supressor de tumor no cancro colo-rectal e cancro oral [15, 16]. No entanto, a função de miR-137 e sua carcinogênese gástrica subjacente mecanismo ainda não são muito claras. Chen et ai revelaram que o miR-137 pode execuções como um supressor de tumor por segmentação CDC42 para regular o ciclo celular no cancro gástrico [17]. Mesmo assim, é claramente para nós que o microRNA regula comportamentos biológicos por meio caminho múltiplo que poderia haver mais mecanismo de regulação de miR-137 em direção a tumorigênese GC. Neste estudo, foi medida a expressão de miR-137 em 100 doentes com cancro gástrico e investigados os papéis de miR-137 em células de cancro gástrico. Encontramos algumas outras funções de miR-137 em GC, bem como uma outra maneira caminho pelo qual miR-137 teve um papel de supressor de tumor na tumorigênese GC.

declaração de Ética Materiais e Métodos

Todos os estudos em humanos foram aprovados pelo comitê de ética apropriados e, portanto, ter sido executado em conformidade com os padrões éticos. Todas as pessoas que deram o seu consentimento informado antes de sua inclusão no estudo.

Pacientes e espécimes

amostras de cancro gástrico humano foram coletados a partir de espécimes cirúrgicos de 100 pacientes (sexo masculino 56, sexo feminino 44) com GC no Instituto e Hospital do Câncer, primeiro Hospital afiliado da Universidade de Henan; Segunda Hospital do Exército de Libertação Popular da China; Hospital de Câncer de Hebei. Amostras não-tumorais a partir da margem do tumor macroscópico foram isolados, ao mesmo tempo e utilizados como os tecidos não neoplásicos adjacentes emparelhados. Todas as amostras foram divididas em duas partes. As amostras de tecido foram colhidas imediatamente congelados em azoto líquido, e armazenado a -80 ° C até à extracção do ARN. O uso de amostras de tecido para todos os experimentos foi aprovado pelo conselho de ética do Instituto de Ciências Médicas Básicas, da Academia Chinesa de Ciências Médicas. Todos os participantes desde que o seu consentimento informado verbal para participar neste estudo, e os seus consentimentos informados verbal foram escritos para baixo. Este processo seuconsentimento também foi aprovado pelo conselho de ética. Quatro linhas celulares de cancro gástrico (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 e MKN-45) foram todos conservados no nosso laboratório e mantidas em DMEM ou 1640 com 10% de FBS.

extracção de ARN, síntese de cDNA e os ensaios de PCR em tempo real

o ARN total a partir de tecidos e células foi extraído pelo método de Trizol (Ambion, EUA) seguindo as instruções completamente. ADNc de cadeia simples foi sintetizado por M-MLV (Ambion, EUA), utilizando 2 ug de ARN total como molde. Oligo (dT) 18 foi utilizado para a transcrição reversa do mRNA, enquanto stem loop utilizado para miARN. PCR em tempo real (RT-PCR) foi realizada pela Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, EUA) utilizando mistura de SYBR (Tiangen, China). A condição de PCR foi: 95 ° C x 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C x 5 segundos, 60 ° C x 34s. Para os mRNAs, GAPDH foi usada como controlo normalizado. Para miRNAs, U6 snRNA foi usado para controle de miRNA. A expressão relativa de miR-137 foi calculada pelo método 2-ΔΔCT. As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela 1.

O plasmídeo construção

A sequência precursora de miR-137 gerado por recozimento e miR-137-F-precursor e extensão de miR-137-R-precursora foi entretanto digerido por BamHI e BglII, os produtos das quais foi inserções no fragmento BamHI-BglII do vector pcDNA-GW /EmGFP miR-(GenePharma, China). No ínterim, controle negativo também foi construído.

cultura de células e miRNA transfecção

As linhas celulares HGC-27, SGC-7901 MKN-45 e GES-1 foi adquirido a partir do Resource celular centro de Instituto de Ciências Médicas básicas, da Academia chinesa de Ciências Médicas e Peking Union Medical College (Pequim, China). As linhas de células gástricas humanas HGC-27, SGC-7901 e MKN-45 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) meio suplementado com 10% de soro fetal de bovino e a linha celular do epitélio gástrico humano GES-1 foi mantida em DMEM ( Gibco, BRL, UK) meios de comunicação. O miR-137 mímico e o mímico precipitação que não é homóloga ao genoma humano foram sintetizados por GenePharma (Xangai, China) e transfectado para as células a uma concentração final de oligonucleótido de 10nmol /L. Todas as transfecções de células foram introduzidas por DharmaFECT1 Reagente (Dharmacon, TX, EUA) de acordo com as instruções usadas do fabricante. Para cada transfecção de células foram realizadas duas ou três experiências de replicação. Ensaio

proliferação celular e ensaio de apoptose

A proliferação celular foi realizada por método CCK8 (DOJINDO, Japão). Resumidamente, os cerca de 5000 miR-137 células transfectadas e células imitam embaralhamentos foram respectivamente semeadas em placas de 96 poços e cultivadas. as taxas de proliferação foram determinados às 0, 12, 24, 48, 72, 96 horas após a transfecção por adição de 10 ul CCK8 regente e testado de acordo com os manuscritos. Os ensaios de apoptose foram testados em HGC-27 e SGC-7901 linhas celulares com ou sem sobre-expressão de miR-137 por kit de detecção da apoptose I (BD Biosciences, EUA) e C6 Citómetro de Fluxo (EUA).

A migração celular e ensaios de invasão

Eu executei o ensaio de cicatrização para testar a capacidade de migração celular, com ou sem miR-137 transfecção. As feridas artificiais foram produzidas sobre a monocamada de células confluentes com FBS livre, utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL a 24 horas após a transfecção o miR-137. As imagens foram, respectivamente, tomadas em 0, 12, 24 e 36 horas após a criação ferida.

Nós, então, realizada transpo� ensaios para avaliar a capacidade de invasão das células. 5 × 10 ^{4 células em suspensão em 200 ul de meio sem FBS foram colocadas na câmara superior de cada inserção com 430μl de 1 mg /ml de Matrigel (Millipore, EUA). médio 600μl com 10% de FBS, como o atraente nutricional foi colocado na câmara baixa. Após 24 horas, as células ligadas à superfície inferior da câmara era fixada a 20 minutos de 20% de metanol e coradas durante 10 min com 10% maygruwald-Giemsa (MGG). As membranas de invasão foram então cortada e incorporada sob lamelas. Contamos as células em 3 diferentes campos de visão fi no estado com 20 × Magni fi cação que foram então usados ​​como o número médio de células. Todos os ensaios foram realizados em três experimentos independentes.}

experimento animal

Os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e as diretrizes éticas institucionais para experiências com animais. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da CAMS (Academia Chinesa de Ciências Médicas) (número de autorização: C72-14-0664). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Scramble-transfectadas e miR-137 superexpressão células HGC-27 (5 × 10 ^{6 células) foram inoculados s.c. nos flancos dorsais de camundongos BALB /c nu (feminino, Nu /Nu, 6 semanas de idade), todos os quais foram adquiridos a partir do Centro de Animais da Universidade de Henan e criado em condições livres de patógenos. O volume de tumor foi medido durante 5 semanas. Todos os ratinhos foram mortos e s.c. Os tumores foram ressecados e o peso dos tumores foi testado. Para in vivo experiências metástase, HGC-27 células foram recolhidas 24 horas após a transfecção. O ensaio de viabilidade celular foi realizada utilizando um ensaio de XTT kit24 horas pós transfecção de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Tóquio, Japão). Em seguida, os ratinhos (fêmea, nu /nu, 6 semanas de idade) foram injectados com células HGC-27 com ou sem o miR-137 sobre-expressão por meio da veia da cauda com 2 × 10 5 células em PBS. As células HGC-27 foram modificados que pode expressar estavelmente luciferase (construído por GENECHEM, Xangai, China). As células foram verificados por microscópio para se certificar de que as células estavam em boas condições. Depois de seis semanas, Bioluminescência imagiologia foi realizada utilizando um valores IVIS Spectrum e radiância imagem foram normalizados utilizando Imagem habitável (Caliper Life Science, EUA).}

Imunohistoquímica

Os tecidos foram embebidos em parafina e tratada 2 horas a 65 ° C e, em seguida, deparaffinised. Antes de aplicar os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite, foi realizado o passo de recuperação de antigénio. Depois disso, as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário de cerca de 2 horas a 25 ° C conjugado a HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, China). O líquido DAB + substrato (zsgb-bio, China) foi utilizado para a detecção da actividade HRP.

luciferase miRNA repórter alvo ensaio

O comprimento total das 3'UTRs de mRNAs Akt2 humanos foram cada amplificado por PCR e clonado no PMIR REPORTTM-luciferase Reporter Vector (Ambion, EUA), para gerar os repórteres. As mutações de regiões de semente previstos nas sequências de mRNA foram criados utilizando os iniciadores, incluindo os sítios mutantes. células HEK-293T foram semeadas em placas de 24 poços (1 × 10 ^{5 células por poço) no dia anterior transfeces foram realizadas. As células (~ 70% confluentes) foram transfectadas com os repórteres de luciferase de pRL-TK (50 ng /poço), a luciferase PGL-3firefly (10 ng /poço), e mímico-137 (50 nmol /L, GenePharma, Xangai, China) ou precipitação (50 nmol /L), utilizando Lipofectamine 2000 actividades (Invitrogen) .Luciferase foram medidos utilizando o duplo de luciferase Reporter Assay (Promega, EUA).}

Western blotting

as proteínas foram separadas em 10% SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de PVDF de 0,45 pM (Amersham, UK). As membranas foram incubadas com 5% de leite seco sem gordura durante a noite a 4 ° C e com o anticorpo monoclonal anti-AKT2 (Proteintech, EUA) na diluição de 1: 1000; anticorpo anti-Bad monoclonal (Bioworld, EUA) a 1: 500 de diluição; anti-GSK-3B anticorpo policlonal (Bioworld, EUA) na diluição de 1: 1000; anti-anticorpo GAPDH (Proteintech, Chicago, EUA) a 1: 30000 de diluição. Depois de lavar duas vezes com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpo de cabra anti-coelho (zsgb-bio, China) em 1: 5000 e 1:. 50000 diluições durante 2 h

Estatísticas

Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. teste t de Student (de duas caudas) eo x ^{2 de teste foram realizados, e nível de significância estatística foi estabelecido em α = 0,05 two-lado). A média ± SD é exibido nas figuras.}

Resultados

miR-137 é regulada em células cancerosas gástricas e amostras clínicas

Em primeiro lugar, examinaram a expressão de miR madura -137 em 4 linhas humanas gástricas celulares de cancro (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 e MKN-45) e de células epiteliais gástricas (GES-1). Estas linhas celulares exibiram GC extraordinariamente baixa expressão de miR-137 em comparação com a linha de células GES-1 (Figura 1A). Para estudar ainda mais a relação de miR-137 com a ocorrência GC, foi detectada a expressão de miR-137 em 100 pacientes clínicos (sexo masculino 56, sexo feminino 44, com idade média de 53 anos) por Taqman em tempo real drived-sonda PCR como descrito acima. De 100 amostras de GC, a expressão de miR-137 foi regulada em 77 casos (77%) em comparação com os tecidos adjacentes quando o off corte foi configurado como 1.5. Enquanto isso, o miR-137 foi regulado para cima em 23 casos (23%) (Figura 1B e 1C). Em geral, a expressão de miR-137 em tecidos GC foi menor do que nos tecidos adjacentes em diferenças estatisticamente significativas (P = 0,00079, teste-t emparelhado, bicaudal, Figura 1C). Além disso, temos encontrado uma associação estatisticamente significativa entre a expressão de miR-137 e câncer gástrico estágio clínico. Os pacientes que têm níveis mais baixos de expressão de miR-137 foram associados com tumores de alto grau e em estágio final (Fig 1D). Estes resultados indicaram que as alterações de miR-137 pode ser envolvida na progressão do cancro gástrico.

miR-137 inibe a proliferação de células in vitro e in vivo

transfectadas miR-137 em linhas celulares imitar GC HGC-27 e SGC-7901, ambos os quais mostraram grande eficácia de transfecção (Figura 2A). Os resultados dos ensaios de crescimento CCK8 a 0, 1, 2, 3 e 4 d após o miR-137 e transfecção precipitação são apresentados na Fig 2B. Em comparação com a transfecção precipitação, o miR-137 transfecção reduziu significativamente a proliferação de ambas as linhas celulares (Fig 2B). Em seguida, investigou o efeito de miR-137 na apoptose celular. As células apoptóticas precoces no grupo de corrida foi de cerca de 10% em HGC-27 e 2,9% em SGC-7901, ao passo que após o miR-137 a transfecção, a percentagem de células apoptóticas precoces foi aumentada para 17,5% em HGC-27 e 8,3% em SGC-7901, que mostrou diferença significativa (Fig 2C). A partir destes resultados, pode-se concluir que o miR-137 poderia suprimir a sobrevivência das células do cancro do pulmão através da indução de apoptose precoce.

Para verificar ainda as conclusões acima, foi construído um modelo in vivo. Descobrimos que o crescimento do tumor foi significativamente mais lento nos ratos superexpressão de miR-137 do que nos controles (Fig 2D, 2E e 2G). De acordo com a curva de crescimento do tumor, os pesos de tumores induzidos por células de encriptação foram significativamente mais elevada do que a sobre-expressão de miR-137 (Figura 2F). Estes resultados confirmam ainda que a sobre-expressão de miR-137 poderia limitar a proliferação de células de cancro gástrico in vivo.

miR-137 inibe a migração celular e invasão in vitro e in vivo

ainda avaliado os efeitos de miR-137 sobre a migração e invasão celular, que foram os principais determinantes da progressão maligna e metástase. Os efeitos de miR-137 na migração celular foram demonstrados por um ensaio de cicatrização de feridas /zero em HGC-27 e células SGC-7901. Ambos duas linhas de células tratadas com o miR-137 mímico foram distintamente menos migratório de controlo precipitação ou células não tratadas em 12, 24, e 36 horas após arranhão (Fig 3A). Além disso, foi realizado ensaio de invasão celular para medir a capacidade de invasão direcionais das células após o miR-137 superexpressão. Como resultado, a capacidade de invasão de células transfectadas com o miR-137 mímico foi drasticamente diminuída em comparação com as células da precipitação no HGC-27 e SGC-7901 (Fig 3B). Então, experiências in vivo foram utilizados para comprovar este resultado. Nós, em primeiro lugar demonstrado que as células transfectadas com o miR-137 controlo mímica ou imitador não apresentaram uma diminuição significativa da viabilidade celular em comparação com células não tratadas. Além disso, não há diferença na viabilidade celular entre as células transfectadas com o miR-137 mímico comparação com o controlo negativo (Fig S2). Como mostrado na Fig 3C, a imagiologia bioluminescente de ratinhos do grupo de sobre-expressão de miR-137 mostrou uma imagem muito menor. Além disso, o número de metástases do pulmão em ratinhos por grupo de miR-137 mostrou um nível significativamente inferior em comparação com grupo de precipitação, o que indicou que o miR-137 poderia suprimir a metástase in vivo. Estes resultados demonstraram que o miR-137 desempenhado papéis importantes na regulação da migração celular e invasão de cancro gástrico e sugeriu que a sub-regulação de miR-137 pode contribuir para a metástase de tumores na carcinogénese gástrica.

miR-137 tem como alvo AKT2 no GC

miRNAs realizada funções biológicas através da regulação negativa seus genes-alvo. Como previsto, não foi complementaridade entre tem-miR-137 e AKT2 3'-UTR (Fig 4A).

Para testar a hipótese de que AKT2 pode ser um alvo de miR-137, um plasmídeo repórter que alberga o selvagem -type região 3'-UTR de AKT2 a jusante da região de codificação da luciferase (Fig 4A, AKT2_WT) foi construído. As células HEK-293T foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter (AKT2_WT) e precipitação. Como resultado, o miR-137 células transfectadas mostrou uma redução acentuada (≈58%) da actividade da luciferase (Fig 4B). Em seguida, o mesmo ensaio foi realizado por um outro plasmídeo repórter contendo AKT2 mutado 3'-UTR em sítios de ligação de miR-137. Como esperado, a inibição da actividade da luciferase por miR-137 foi parcialmente removido com local de ligação 1 ou ligação citar dois mutante e quase aboliu no duplo mutante AKT2_MUT, sugerindo que a região conservada foi totalmente responsável pela miR-137 função (Fig 4B) .

Para investigar mais a interação entre miR-137 e AKT2, HGC-27 e células SGC-7901 foram transfectadas com miR-137. a expressão de ARNm AKT2 foi determinada por PCR em tempo real. Não foi observada diferença significativa entre o miR-137-tratadas e células não tratadas HGC-27 e SGC-7901 (Fig 4C) tratados com corrida ou. Então, a análise de transferência de Western foi realizada para medir o nível de proteína AKT2. Descobrimos que a expressão da proteína AKT2 foi regulada negativamente no miR-137 células HGC-27 e SGC-7901 tratados, mas não em corrida ou células não tratadas (Fig 4D). Estes dados sugerem que o miR-137 reconhece directamente o 3'-UTR do mRNA AKT2 e inibe a tradução AKT2. Assim, para baixo regulada miR-137 em câncer gástrico inibe a supressão de AKT2, que por sua vez desacelerar tumorigênese.

AKT2 é um membro da família AKT. Nós ainda detectado seus efectores a jusante Bad e GSK-B. Como resultado, o p-Bad e p-GSK-B foi regulada para baixo, obviamente, em miR-137 tratadas HGC-27 e células SGC-7901 em comparação com as células tratadas com codificar ou não tratados. Nenhuma mudança significativa foi encontrada em não-fosforilada Bad ou GSK (Fig 4E). Estes achados sugerem que o crescimento de células de câncer gástrico acelerado foi parcialmente devido às vias Akt over-activas do. Além de promover a proliferação celular, actived Akt também pode fosforilar Bad em Ser112 e Ser136, bloqueando a morte induzida Bad-célula. Na ausência de fosforilação nestes locais, Bad é pensado para interagir com Bcl-XL para induzir a morte celular. Em contraste, a hiperfosforilação de Akt mediada de Bad podem promover a sobrevivência celular em células cancerosas. Os resultados de transferência de Western confirmou a especulação acima que a alteração das actividades celulares de cancro gástrico em condição de células de miR-137 transfectadas pode ser um resultado da diminuição da fosforilação de Bad. Além disso, foram analisados ​​os níveis de proteína de AKT2 em 12 GC patientsin quem miR-137 foi regulada para baixo. Entre estas amostras, AKT2 foi regulada in9patientsin seus tecidos GC (Fig 4F).

A restauração do AKT2 liderado a uma ativação de invasão e uma supressão de apoptose

Para demonstrar ainda mais os papéis de miR-137 e AKT2 tocada durante a tumorigénese, nós investigamos o efeito do restabelecimento de AKT2 em miR-137 células transfectadas. O Western blot demonstrou que o nível de proteína na amostra AKT2 superexpressão AKT2 foi aparentemente mais elevada do que a do controlo negativo, mesmo sob a supressão de miR-137. A restauração da AKT2 liderado a uma ativação de invasão e uma supressão de apoptose (Fig 5).

Discussão

miRNAs têm sido frequentemente indicada para ser frequentemente desregulado em diversos cancros humanos e alguns miRNAs tem mesmo sido utilizado empregado como alvos terapêuticos de câncer. As pesquisas referentes à relação entre miRNAs e cânceres poderiam nos ajudar com a compreensão do câncer.

Existem apenas algumas pesquisas referentes ao papel miR-137 jogou no câncer gástrico. Tem sido relatado que o miR-137 é um regulador negativo de Cdc42 e por direccionamento que induzir a apoptose e ciclo celular a paragem em G1 em células de cancro gástrico [17]. No entanto, o efeito de regulação de microARN no cancro é bastante complicado. Parece impossível que o miR-137 regula o câncer gástrico pela via única. Nesta pesquisa, a função eo mecanismo que miR-137 regulado câncer gástrico foi investigado.

Em primeiro lugar, nós detectamos a expressão de miR-137 em 100 pacientes e descobriram que a expressão de miR-137 significativamente é baixo -regulated na amostra de câncer. Além disso, temos encontrado uma associação estatisticamente significativa entre a expressão de miR-137 e câncer gástrico estágio clínico. Estes resultados indicaram que as alterações de miR-137 pode ser envolvida na progressão do cancro gástrico. Temos tentado encontrar a relação entre o miR-137 e os doentes "idade e sexo, mas nenhum resultado estatístico foi encontrado. Dado que o presente estudo revelou que a expressão de miR-137 foi regulada para baixo, na maioria dos tecidos de GC em comparação com os tecidos adjacentes (77%), que se poderia considerar sobre o uso diagnóstico e prognóstico de miR-137. Uma validação adicional em estudos prospectivos se justifica e fontes de amostras mais acessíveis, como exossomos derivados do tumor miR-137-enriquecidas do sangue, deve ser investigada. Além disso, deve ser notado que, em certa medida, o valor de corte (cut off = 1,5) que escolhemos poderia ser ainda arbitrária. Quando foi definido maior, poderia haver menos pacientes com miR-137 para baixo regulamentada em tecidos de câncer. No entanto, mesmo nestas condições, houve cerca de 23% dos cancros têm alta expressão de miR-137. Isto pode ser devido a diferenças individuais entre os pacientes que alguns indivíduos podem ter padrão de expressão de genes diferentes durante a tumorigénese ou a progressão do cancro.

Como a expressão de miR-137 em tecidos GC foi menor do que nos tecidos adjacentes em diferenças estatisticamente significativas (p = 0,00079), pode-se especular que essa característica expressão foi associada ao desenvolvimento de câncer. Esta foi confirmada por especulação in vitro e estudos in vivo que o miR-137 pode regular negativamente a proliferação celular, migração e invasão. O nível de expressão de miR-137 pode manter a um nível elevado durante um longo período após a transfecção tanto em linhas celulares de cancro gástrico, tumores de xenoenxerto em fase terminal e localização inmetastatic nos pulmões (Fig S1A-S1C figura). No entanto, o método de sobre-expressão conduz a níveis de expressão muito elevados de miR-137 (Fig 2A). Este elevado nível de miR-137 pode causar efeitos adicionais. Por exemplo, o miR-137 é um regulador negativo de Cdc42 e por segmentação que induzir a apoptose e ciclo celular a paragem em G1 em células de cancro gástrico [17]. À medida que o miR-137 no nosso estudo foi regulada positivamente milhares de vezes, pode conduzir à inibição de outros alvos, tais como Cdc42. Obviamente, neste estudo, não podemos excluir a possibilidade de que os efeitos supressores de tumor de miR-137 foi mediada pela supressão outros genes alvo.

Então, descobrimos que miR-137 funciona como um gene supressor de tumor por meio de segmentação AKT2 , que é um membro da família de AKT. A restauração de AKT2 faz com que a regulação para cima de AKT2 em miR-137 células transf ectadas, o que é muito maior do que em precipitação. Isto pode ser devido a que a sobre-expressão AKT2 inverteu o nível de proteína de miR-137 suprimida. Mais importante ainda, o restabelecimento de AKT2 regula a apoptose e a invasão de células de cancro gástrico, conduzindo a uma activação de invasão e uma supressão de apoptose (Fig 5). Esta experiência de resgate fornece uma evidência adicional de que a apoptose de células ativa miR-137 e negativamente regular invasão celular, visando AKT2. Em experiências in vivo também mostrou que a expressão de miR-137 é negativo em relação à expressão AKT2 (Fig S1D e Fig S1E). AKT é um factor crucial de passagem caminho PI3K /AKT. A regulação para baixo dos AKT2 afeta ainda mais a sua proteína a jusante Bad e GSK-3B, que o p-Bad e p-GSK-B foi obviamente para baixo regulado. Bad pode jogar seus "papéis por fosforilação e mais regulamentada do destino celular [18]. A GSK-3B, que também é conhecida como GSK-3β geralmente, controla a imigração e invasão celular. Em conclusão, nós identificamos uma ligação entre o miR-137 e AKT2 que é um novo componente de tumorigénese cancro gástrico. O miR-137 foi demonstrada ser relacionada à regulação AKT2 [19]. No carcinoma hepatocelular, o miR-137 inibe o crescimento de células de cancro e metástases através de direccionamento directamente AKT2 [20]. Na verdade, nós, e temos uma tela de 8 genes como potenciais alvos de miR-137 (S1 Tabela). No entanto, o AKT2 é o único alvo directo de miR-137 após ensaio de gene repórter de luciferase dupla e investigação de western blot. Da Fig 4D podemos encontrar thatmiR-137 pode afetar a AKT2 e p-AKT2in ambas as células HGC-27 e SGC-7901. Mas, curiosamente, no SGC-7901 o estado de fosforilação foi aparentemente mais afetadas. Este fenômeno pode ser observado de forma consistente nos três borrões repetidas nós realizadas. Deduz-se que poderia ser devido a uma propriedade especial de células cancerígenas diferentes. Pode haver maneira específica caminho regulação do miR-137 em SGC-7901, que reprimiu o estado de fosforilação de AKT2.However, a partir da presente pesquisa, não podemos explicar plenamente esse mecanismo. Quando nós escolhemos os pacientes que têm baixa expressão de miR-137 em seu tecido GC para detectar a expressão da proteína AKT2, encontramos a maioria desses pacientes (9/12) têm alto nível AKT2 no tecido GC. Este resultado sugere que o miR-137 poderia alvo AKT2 em pacientes. Existem também três pacientes que têm baixa expressão de AKT2 no tecido GC embora a expressão de miR-137 é baixo. Esse resultado pode ser devido à diferença individual entre os pacientes.

Em conclusão, a nossa expressão e estudos funcionais sugerem que o miR-137 é frequentemente regulada no cancro gástrico pode agir como um supressor de tumor em células GC, reintroduzindo expressão do que em células GC suprimiu a proliferação de células de câncer gástrico, migração e invasão diretamente pela segmentação AKT2. Assim, o nosso trabalho é um bom complemento para o trabalho anterior e é útil para nós compreender o mecanismo de regulação miR-137 em câncer.

Informações de Apoio
S1 Fig. miR-137 e expressão AKT2 após a transfecção.
A. expressão de miR-137 em HGC-27 e células SGC-7901 72 h após a transfecção. B. expressão de miR-137 em tumores de xenoenxerto em fase terminal. C. expressão de miR-137 na localização metastático de ratos pulmões. expressão D. AKT2 na localização metastático de ratos pulmões. Misturamos as cinco pulmões em conjunto no mesmo grupo. expressão E. AKT2 na localização metastático de ratos pulmões. Detectamos a expressão da proteína Akt2 em cada ratinho, respectivamente. 30 ug de proteína total foi utilizado para cada amostra
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s001
(TIF)
S2 Fig. ensaio de viabilidade celular antes experimento metástase ensaio de viabilidade celular
foi realizada 24 horas após a transfecção
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0130124.s002
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S3 Fig. análise Adensitometric da figura 4E
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s003
(TIF)
S1 Table. . genes alvos potenciais de miR-137 Tours A potenciais genes alvo de miR-137 foram previstos pelo no software linha e detectados por ensaio de gene repórter duplo de luciferase e bloting ocidental
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124. S004
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obrigado Agradecimentos

Os autores Dr. Chengyuan Feng do Hospital do Câncer, da Academia chinesa de Ciências médicas de assistência técnica e artigo de revisão.

• PLOS ONE: Identificação e Caracterização de CXCR4-positiva Câncer Gástrico Stem Cells
• PLOS ONE: Os microRNA-217 Funciona como um supressor de tumor potencial em Câncer Gástrico por Segmentação GPC5