PLoS ONE: MicroRNA-137 Prisideda prie prislopinti tumorigenezei žmogaus skrandžio vėžio nukreipiant AKT2

Anotacija

miRNAs vaidina svarbų vaidmenį Tumorigenesis. Šis tyrimas sutelktas tyrinėti poveikis ir reguliavimo mechanizmą Mirna-137 nuo biologinių elgesio skrandžio vėžio. Bendras RNR buvo išskirta iš audinių 100 pacientų, sergančių skrandžio vėžio ir iš keturių skrandžio vėžio ląstelių linijų. Išraiška miR-137 buvo aptikta realaus laiko PGR iš 100 pacientų. MiR-137 raiškos skrandžio vėžio ląstelės "proliferacijos, apoptozės, migracijos ir invazijos gebėjimo poveikis buvo tiriamas in vitro ir in vivo. Taikinio genas miR-137 numatė Targetscan on-line įrangą, patikrino dvigubos liuciferazės reporteris genų tyrimo ir parodė Vakarų dėmė. Kaip rezultatas, miR-137 išraiška buvo reikšmingas sumažinti skrandžio vėžio ląstelių linijos HGC-27, HGC-803, SGC-7901 ir MKN-45, taip pat skrandžio vėžio audiniuose palyginti su GES-1 ląstelės arba atitiko greta Non -neoplastic audiniai ( p
< 0,001). Pakartotinį įvedimas miR-137 į skrandžio vėžio ląsteles galėjo slopinti ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazija. In vivo eksperimentai parodė, kad Mir-137 raiška gali sumažinti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir metastazes. Bioinformatikos ir Vakarų dėmė analizė parodė, kad Mir-137 veikė kaip navikas slopintuvas vaidmenis skrandžio vėžio ląsteles per orientacija AKT2 ir toliau įtakos bloga ir GSK-3β. Taigi, Mir-137, kuris yra dažnai žemyn reguliuoja skrandžio vėžio potencialiai dalyvauja skrandžio vėžio Tumorigenesis ir metastazių reguliuojant AKT2 susijusius signalo kelius

nurodomoji dalis:. Vu L Chen J Ding C Wei S, Zhu Y, Yang W, ir kt. (2015) MicroRNA-137 Prisideda prie prislopinti tumorigenezei žmogaus skrandžio vėžio nukreipiant AKT2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. Doi: 10,1371 /journal.pone.0130124

Akademinė redaktorius: Irina V. Lebedeva, Kolumbijos universitetas, JAV

Įstojo: rugpjūčio 15, 2014; Priėmė: Gegužės 18, 2015 m Paskelbta: Birželis 23, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 VU et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

Finansavimo:.. Šis darbas buvo remiamas medicinos mokslo ir technologijų mokslinių tyrimų projektų Henan provincijoje, Kinija (2011030004)

konkuruojančių interesų: autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja.

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra antras dažnai mirties priežastis nuo vėžio pasaulyje [1]. Iki šiol, skrandžio kancerogenezėje mechanizmas yra plačiai žinomas. Mokslininkai bandė studijuoti GC nuo biochemijos ir molekulinės biologijos požiūriu, kad kai navikas slopintuvas genų ir naviko susijusių genų buvo pranešta apie GC. Mikro RNR (miRNAs) yra organizme mažų ne kodavimo RNR iš 18 ~ 22 nukleotidų, kurie buvo identifikuoti kaip posttranscriptional reguliuojančių genų ekspresiją [2, 3]. MiRNAs žaisti kritinių vaidmenis daug biologinių procesų, pavyzdžiui, platinimo, plėtros, diferenciacijos ir apoptozės. Tuo tarpu, miRNAs buvo patvirtintas veikti kaip onkogenų ar navikas slopintuvas genų Tumorigenesis metu. Pavyzdžiui, miR-31 buvo identifikuojamas kaip į stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma [4] ir miR-451 funkcijų onkogeno kaip auglio slopinamojo nustatymui žmogaus nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžio [5]. Taip pat yra daug mikro RNR buvo nustatytos susijęs su skrandžio vėžiu, vyksta ir plėtros [6-13]. Ji taip pat buvo pastebėta, kad per ekspresija miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34a ir miR-423-5p gali būti naudojamas kaip diagnostikos kriterijus skrandžio vėžio [14] .Todėl, miRNAs yra potencialūs kandidatai naujų diagnostikos biologinių žymenų ar terapinių tikslų skrandžio vėžio.

MicroRNA-137 (mIR-137) buvo pranešta, kad žemyn reguliuojama ir žaisti vaidmenis kaip naviko slopintuvas į gaubtinės žarnos vėžio ir burnos vėžio [15, 16]. Tačiau, miR-137 ir jo veikimo mechanizmas pagrindinės skrandžio kancerogenezėje funkcija yra vis dar nėra labai aiški. Chen et al atskleidė, kad Mir-137, gali groja kaip naviko slopintuvas pagal orientacija CDC42 reguliuoti ląstelių ciklą skrandžio vėžio [17]. Net jei taip, tai tikrai mums, kad MicroRNA reguliuoja biologinius elgesio keliems kelio taip, kad ten gali būti daugiau reguliavimas mechanizmas miR-137 į GC Tumorigenesis. Šiame tyrime, mes matuojamas miR-137 išraišką į 100 pacientų, sergančių skrandžio vėžio ir ištirti miR-137 vaidmenį skrandžio vėžio ląsteles. Mes nustatėme, kai kitas funkcijas PPN-137 GC, taip pat kitą kelią kelią, kuriuo Pasaulis-137 grojo naviko slopintuvas vaidmenį GC Tumorigenesis.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimo

Visos žmogaus tyrimai buvo patvirtinta atitinkamos etikos komiteto ir todėl buvo atlikta laikantis etikos standartų. Visi asmenys, davė savo sutikimą iki jų įtraukimo į tyrimą.

Pacientai ir jų pavyzdžiai

Žmogaus skrandžio vėžio mėginiai buvo surinkti iš chirurginio egzempliorių iš 100 pacientų (vyrų 56, Panelių 44) su GC tuo vėžio instituto ir ligoninės pirmasis filialas ligoninė Henan universiteto; Antrojo ligoninė Liaudies išlaisvinimo armija Kinijoje; Hebei Vėžys ligoninė. Ne-navikų mėginiuose iš mikroskopinės naviko skirtumą buvo išskirti tuo pačiu metu ir naudojamas kaip suderintų gretimų ne neoplastinių audiniuose. Visi mėginiai buvo padalintas į dvi dalis. Audinio mėginiai buvo surinkti nedelsiant spragtelėjimu, užšaldomos skystame azoto, ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol RNR ekstrakcijos. Iš audinių mėginių visuose eksperimentuose naudoti buvo patvirtintas etikos tarybos pagrindinio medicininio mokslų instituto kinų medicinos mokslų akademijos. Visi dalyviai, jei jų žodinį informuoto sutikimo dalyvauti šiame tyrime ir jų žodžiu informavo sutikimai užrašyti. Tai onsent procesas taip pat buvo patvirtinta etikos taryba. Keturi skrandžio vėžio ląstelių linijas (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 ir MKN-45) visi buvo išsaugojęs mūsų laboratorijoje ir prižiūrimi DMEM arba 1640 su 10% FBS.

RNR išskyrimas, kDNR sintezės ir realaus laiko PGR

iš viso RNR iš audinių ir ląstelių buvo išgauti Trizol metodą (Ambion, JAV) visiškai vadovaudamiesi instrukcijomis. Vienvietis kryptis kDNR buvo susintetintas M-MLV (Ambion, JAV), naudojant 2 mikrogramų visos RNR kaip šabloną. Oligo (dT) 18 buvo naudojamas iRNR atvirkštinės transkripcijos o kamieninių kilpa naudojama mirna. Realaus laiko PGR (RT-PGR) atliko Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, JAV), naudojant SYBR mišinio (Tiangen, Kinija). PGR sąlyga buvo: 95 ° C × 30s, po 40 ciklų 95 ° C × 5s, 60 ° C × 34s. Už mRNR, GAPDH buvo naudojamas kaip normalaus kontrolės. Dėl miRNAs, U6 snRNA buvo naudojamas Mirna kontrolę. Santykinis išraiška miR-137 buvo apskaičiuotas pagal 2-ΔΔCT metodu. Gruntas sekos yra parodyta 1 lentelėje

plazmidžių statybos

Mir-137 pirmtakas seka generuoja atkaitinimo ir miR-137-pirmtako-F ir Pasaulis-137-pirmtakas-R pratęsimo buvo tuo tarpu suardomas BamHI ir BglII, produktai, kurių buvo įdėklai į BamHI-BglII fragmentu pcDNR-GW /EmGFP-miR vektoriaus (GenePharma, Kinija). Tuo tarpu neigiamas kontrolė taip pat buvo pastatytas.

Mobilusis kultūra ir Mirna transfekcija

Mobilaus ryšio linijos HGC-27, SGC-7901 MKN-45 ir GES-1 buvo įsigytas iš ląstelių išteklius centras instituto pagrindinės medicinos mokslų, kinų medicinos mokslų akademijos ir Pekino Sąjunga medicinos koledžas (Pekinas, Kinija). Žmogaus skrandžio ląstelių linijos HGC-27, SGC-7901 ir MKN-45 buvo auginamos RPMI 1640 (Lanksčiai, BRL, UK) žiniasklaidos papildyti su 10% vaisiaus galvijų serumo ir žmogaus skrandžio epitelio ląstelių linijos GES-1 buvo prižiūrimi DMEM ( Lanksčiai, BRL, Jungtinė Karalystė) žiniasklaida. Mir-137 kartojančius ir užsiropštimas kartojančius kuris yra ne-homologinis žmogaus genomo buvo susintetintas GenePharma (Šanchajus, Kinijos) ir transfekuota į ląsteles, kad galutinė oligonukleotido koncentraciją 10nmol /L. Visi mobilieji transfekcija įvedė DharmaFECT1 reagentas (Dharmacon, TX, USA) pagal gamintojo naudojimo instrukcija. Kiekvienam ląstelių transfekciją buvo atliekami du arba trys replikacijos eksperimentai.

ląstelių proliferacija ir apoptozė tyrimas

ląstelių proliferacija tyrimas buvo atliekamas pagal CCK8 metodu (DOJINDO, Japonija). Trumpai tariant, apie 5000 Pasaulis-137 mimikos Transfekuoti ląstelės ir kepti plaktą ląstelės buvo atitinkamai pasėtos į 96 duobučių plokštelės ir kultūringas. Platinimu normos buvo nustatomos ne 0, 12, 24, 48, 72, 96 valandoms po transfekciją pridedant 10μl CCK8 Regent ir išbandytas pagal rankraščių. Apoptozę tyrimai buvo išbandytas HGC-27 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių linijų su arba be Pasaulis-137 raiškos apoptozę nustatymo rinkinys I (BD Biosciences, JAV) ir C6 tėkmės citometre (JAV).

Mobilusis migracija ir invazija tyrimai

Mes atlikome žaizdos gijimo tyrimą išbandyti ląstelių migracijos galimybę su arba be Pasaulis-137 transfekciją. Dirbtinių žaizdos buvo gaminami ant susiliejantis ląstelių monosluoksnio su FBS nemokamai, naudojant 200 iL pipetės galiuką praėjus 24 valandoms po Pasaulis-137 transfekcijq. Vaizdai buvo atitinkamai atsižvelgta 0, 12, 24 ir 36 valandas po to, kai žaizdos kūrimą.

tada atliekamas transwell tyrimus, atliekamus siekiant įvertinti ląstelėse invazija galimybes. 5 × 10 ^{4 ląstelės suspenduotos 200 iL terpėje be FBS buvo pateikti į aukštutinį kambarį kiekvieno įdėklo su 430μl 1 mg /ml Matrigel (Millipore, JAV). 600μl vidutinio 10% FBS kaip mitybos viliojamąją buvo įdėti į apatinę kamerą. Po 24 valandų, pritvirtintą prie apatinio paviršiaus kameroje ląstelės buvo fiksuotos 20 min iki 20% metanolio ir tamsintas 10 min su 10% maygruwald-Giemsa (MGG). Invazija membranos tada buvo iškirsti ir įterptųjų fiktyviais lapeliai. Mes skaičiuojami iš 3 skirtingų vizija laukų būklė ląsteles su 20 × Magni fi kavimas, kuris tada buvo naudojami kaip vidutinis ląstelių skaičių. Visi tyrimai buvo atlikti trijų nepriklausomų eksperimentų.}

Gyvūnų eksperimentas

eksperimentų su gyvūnų buvo atlikta pagal vadovo priežiūrą ir naudojimo laboratoriniams gyvūnams ir institucinių etikos gairių eksperimentus su gyvūnais. Protokolas buvo patvirtintas dėl pranešimo apie gyvūnų eksperimentai su KAMEROS etikos komiteto (kinų medicinos mokslų akademijos) (leidimo numeris: C72-14-0664). Visi chirurgija buvo atlikta pagal natrio pentobarbitalio anestezijos ir buvo dedamos visos pastangos, kad kuo mažiau kentėtų. Peštynės-perkeltų ir Pasaulis-137 raiškos HGC-27 ląstelių (5 × 10 ^{6 ląstelių) buvo pasėta po oda į nugaros kraštais BALB /c nuogas pelėmis (Mergaitė, "Nu /" Nu, 6 savaičių amžiaus), kurie visi buvo įsigyti iš gyvūnų centro Henan universiteto ir užaugo patogenais neužkrėstų sąlygomis. Auglio tūris buvo matuojamas 5 savaites. Visi pelėms buvo nužudyti, o po oda navikai rezekcijos ir buvo išbandytas navikų svoris. In vivo metastazės eksperimentų, HGC-27 ląstelių buvo surinkti 24 valandas po transfekciją. Ląstelių gyvybingumo tyrimą buvo atlikta naudojant XTT tyrimas kit24 valandą po transfekcijq pagal gamintojo nurodymus (Roche ", Tokijas, Japonija). Tada pelės (Moteris, "Nu /" Nu, 6 savaičių amžiaus) buvo sušvirkšta HGC-27 ląstelių su arba be Pasaulis-137 raiškos per uodegos venos su 2 × 10 5 ląstelių PBS. Į HGC-27 ląstelių buvo keistas, kurie gali stabiliai išreikšti liuciferazės (pastatytas GENECHEM, Šanchajus, Kinija). Ląstelės buvo ištirti mikroskopu įsitikinti, kad ląstelės buvo geros būklės. Po šešių savaičių, Bioluminescence vaizdo buvo atliktas taikant IVIS spektrą ir vaizdo Radiance vertybes buvo normalūs naudojant Gyvenimas Image (Slankmatis Life Science, JAV).}

imunohistocheminis

audiniai buvo integruotas į parafino skyriuose ir apdorojimo 2 valandų esant 65 ° C ir tada deparaffinised. Prieš taikant pirminius antikūnus, esant 4 ° C temperatūroje per naktį, mes atlikti antigeno išgavimo žingsnį. Po to, skaidres buvo inkubuojamos su antriniais antikūnais apie 2 valandas, esant 25 ° C konjuguotas su HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, Kinijos). Liquid TBP + Substratas (zsgb-bio, Kinija) buvo naudojama aptikimo HRP veikla.

liuciferazės Mirna tikslas reporterio testą

pilnas ilgis žmogaus AKT2 mRNR 3'UTRs buvo kiekvienas PGR amplifikacijos ir klonuotas į pMIR-REPORTTM liuciferazės Reporter Vector (Ambion, JAV), kad sukurtų žurnalistams. Mutacijos prognozuojamos sėklų regionų mRNR sekų buvo sukurtas naudojant pradmenis įskaitant mutavusių svetainėse. HEK-293T ląstelių buvo pasėjamos į 24-duobučių lėkštelėse (1 × 10 ^{5 ląstelės per šulinio) dieną prieš buvo atlikta transfekcija. Ląstelės (~70% susiliejantis) buvo pernešta su PRL-TK liuciferazės žurnalistais (50 ng /duobutėje), PGL-3firefly liuciferazė (10 ng /gerai), ir mimikos-137 (50 nmol /l, GenePharma, Šanchajus, Kinija), arba peštynės (50 nmol /L), naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Luciferase veikla buvo matuojamas naudojant Dual liuciferazės reporterio testą (PROMEGA, JAV).}

imunoblotingu

Baltymai buvo atskirtas nuo 10% SDS-PAGE ir tada perkelti į 0,45 mkm PVDF membranos (AMERSHAM, JK). Membranos buvo inkubuojami su 5% ne-riebalų džiovinti pieno per naktį 4 ° C ir su anti-AKT2 monokloninis antikūnas (Proteintech, JAV), esant 1: 1000 tirpalo pavidalu; anti-Bad monokloninis antikūnas (Bioworld, JAV) santykiu 1: 500 atskiedimą; anti-GSK-3B polikloninis antikūnas (Bioworld, JAV) ne 1: 1000 tirpalo pavidalu; prieš GAPDH antikūnas (Proteintech, Čikaga, JAV); 1: 30.000 skiedimas. Nuplovus du kartus TBST, Membranos buvo inkubuojami su ožka prieš triušio antikūnai (zsgb-bio, Kinija) AT 1: 5000 ir 1:. 50000 skiedinių 2 val

Statistika

Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas bent tris kartus. Stjudento t testas (du-tailed) ir x ^{2 testas buvo atliktas, ir statistiškai reikšmingas lygis buvo nustatytas alfa = 0,05 dviejų pusėje). Vidurkis ± SD rodomi skaičiai.}

Rezultatai

MIR-137 yra žemyn reguliuojamos skrandžio vėžio ląsteles ir klinikinių mėginių

Mes pirmą kartą nagrinėję brandžios miR išraiška -137 4 žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 ir MKN-45) ir skrandžio epitelio ląstelių (GES-1). Šie GC ląstelių linijos eksponuojama nepaprastai mažą ekspresiją, miR-137, palyginti su GES-1 ląstelių linijos (pav 1A). Toliau mokytis PPN-137 santykius su GC atsiradimo, mes nustatėme, kad PPN-137 išraišką 100 klinikinių pacientų (vyrų 56, Moteris 44; vidutinis amžius 53 metai) iki TaqMan zondas-drived realaus laiko PGR, kaip aprašyta aukščiau. Iš 100 GC mėginių, iš miR-137 išraiška buvo žemyn reguliuojama 77 atvejų (77%), palyginti su gretimų audinių, kai nukirptas buvo įsteigta kaip 1,5. Tuo tarpu, PPN-137 buvo iki reguliuojama 23 atvejų (23%) (pav 1b ir 1c). Apskritai, miR-137 išraiška GC audiniuose buvo mažesnis nei gretimuose audiniuose statistiškai reikšmingų skirtumų (p = 0,00079, suporuotas T-testas, du-tailed pav 1C). Taip pat, mes nustatėme, kad statistiškai reikšmingas ryšys tarp miR-137 išraiškos ir skrandžio vėžio klinikinių etape. Pacientai, kurie turi mažesnes PPN-137 išraiškos buvo susijęs su aukštos kokybės ir vėlyvos stadijos navikų (pav 1d). Šie rezultatai parodė, kad pakeitimai PPN-137 gali būti įtraukti į skrandžio vėžio progresavimą.

MIR-137 slopina ląstelių proliferaciją in vitro ir in vivo,

perkeltų Pasaulis-137 imituoti į GC ląstelių linijų HGC-27 ir SGC-7901, kurie abu parodė didelį transfekciją efektyvumą (pav 2A). Iš CCK8 augimo bandymų rezultatus 0, 1, 2, 3 ir 4 D po miR-137 ir peštynės transfekciją yra parodyta Fig 2B. Palyginti su peštynės transfekciją, miR-137 transfekcija žymiai sumažino abiejų ląstelių linijų (pav 2b) proliferaciją. Tada mes tyrė PPN-137 poveikį ląstelių apoptozę. Ankstyvieji Apoptozinės ląstelės peštynės grupėje buvo apie 10%, HGC-27 ir 2,9% SGC-7901, o po Pasaulis-137 transfekciją, išankstinių apoptozinių ląstelių procentas buvo padidintas iki 17,5% per HGC-27 ir 8,3% visų SGC-7901, kuris žymiai parodė skirtumą (pav 2C). Iš šių rezultatų galima daryti išvadą, kad Pasaulis-137 gali slopinti plaučių vėžio ląstelių išgyvenimą stimuliuoja ankstyvą apoptozę.

Jei dar kartą patikrinti minėtas išvadas, in vivo modelis buvo pastatytas. Mes nustatėme, kad naviko augimas buvo žymiai lėtesnis Mir-137 raiškos pelių, nei kontroliniuose (pav 2D, 2E ir 2G). Pagal susitarimą su naviko augimo kreivės, iš sukeliamų plaktai ląstelių navikų svoriai buvo gerokai didesnis nei, kad Mir-137 raiškos (pav 2F). Šie rezultatai dar kartą patvirtino, kad Mir-137 raiška gali apriboti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją in vivo.

MIR-137 slopina ląstelių migraciją ir invazija in vitro ir in vivo

Mes taip pat įvertino poveikis nuo miR-137 ląstelių migracijos ir invazijos, kuri buvo pagrindiniai veiksniai piktybinės ligos progresavimo ir metastazių. Į PPN-137 poveikis ląstelių migracija buvo įrodyta žaizdų gijimas /įbrėžimams ištirtas HGC-27 ir SGC-7901 ląstelių. Tiek iš dviejų ląstelių linijų gydomiems miR-137 mimika buvo savitai mažiau migracijos nei peštynės kontrolės ar negydytų ląstelių 12, 24, ir 36 valandas po braižymo (pav 3a). Be to, mes atlikome ląstelių invazija tyrimą matuoti krypties invazija gebėjimus ląstelių po Pasaulis-137 raiškos. Kaip rezultatas, ląstelių transfektuotose Pasaulis-137 Mimic invazyvumas buvo smarkiai sumažėjo, palyginti su plaktai ląstelių HGC-27 ir SGC-7901 (pav 3b). Tada, in vivo bandymai dirbo tam, kad patikrintų šį rezultatą. Mes pirmiausia parodė, kad ląstelės transfektuotose Pasaulis-137 mimika ar mimika kontrolės neparodė reikšmingai sumažėjo ląstelių gyvybingumo, palyginti su negydytų ląsteles. Be to, nėra jokio skirtumo ląstelių gyvybingumo tarp ląstelių transfektuotose miR-137 mimika, palyginti su neigiamos kontrolės (S2 pav). Kaip parodyta Fig 3c Bioluminescent vaizdo gavimas pelių ir miR-137 raiška grupės parodė daug mažesnį vaizdą. Be to, iš plaučių metastazių per pelių ir miR-137 grupės numeris parodė daug žemesniame lygyje, palyginti su peštynės grupės, kuriame nurodyta, kad miR-137 gali slopinti metastazių in vivo. Šie rezultatai parodė, kad Pasaulis-137 suvaidino svarbų vaidmenį reguliuojant ląstelių migraciją ir invaziškumo skrandžio vėžio ir pasiūlė, kad žemyn reguliavimas miR-137, gali prisidėti prie naviko metastazių skrandžio kancerogenezėje.

Pasaulis-137 skirta AKT2 GC

miRNAs atliekamas biologines funkcijas per neigiamai reguliuoti savo tikslinę genus. Kaip prognozuojama, buvo papildomumas tarp turintis Taip-Pasaulis-137 ir AKT2 3'-UTR (pav 4A).

Norėdami patikrinti hipotezę, kad AKT2 gali tapti miR-137 tikslas, reporteris plazmidės slėpimas laukinių buvo pastatytas -type 3'-UTR regionas AKT2 pasroviui nuo liuciferazės kodavimo regione (pav 4A, AKT2_WT). HEK-293T ląstelės buvo cotransfected su reporterio plazmidės (AKT2_WT) ir peštynės. Kaip rezultatas, PPN-137 Transfekuoti ląstelės parodė žymų (≈58%) Iš liuciferazės veikla (pav 4b). Tada, tas pats tyrimas buvo atliktas kito reporterio plazmidės, kurių sudėtyje yra mutuotos AKT2 3'-UTR į miR-137 jungimosi vietų. Kaip ir tikėtasi, liuciferazės aktyvumo slopinimą miR-137 buvo iš dalies pašalintas privalomas svetainė 1 arba privalomas cituoti 2 mutantas ir beveik panaikino į AKT2_MUT dvigubo mutantas, o tai rodo, kad išsaugotų regionas buvo visiškai atsakingas Mir-137 funkcijos (pav 4B) .

Jei toliau tirti tarp miR-137 ir AKT2, HGC-27 ir SGC-7901 ląstelių sąveiką buvo transfekuotos miR-137. AKT2 iRNR raiška nulėmė realaus laiko PGR. Reikšmingo skirtumo nepastebėta tarp Pasaulis-137 gydytų ir peštynės-apdoroti arba neapdoroti HGC-27 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių (pav 4c). Tada imunoblotingu analizė buvo atlikta siekiant įvertinti AKT2 baltymų lygį. Mes nustatėme, kad AKT2 baltymo ekspresija buvo žemyn reguliuojama Pasaulis-137 gydytų HGC-27 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląsteles, bet ne peštynės ar negydytų ląstelių (pav 4d). Šie duomenys rodo, kad Pasaulis-137 tiesiogiai pripažįsta 3'-UTR iš AKT2 mRNR ir slopina AKT2 vertimą. Taigi, žemyn reguliuojama Pasaulis-137 skrandžio vėžio slopina AKT2 slopinimas, kuris savo ruožtu sulėtėja tumorigenezei.

AKT2 yra AKT šeimos narys. Mes taip pat nustatėme, savo tolesnius vykdymo įtaisai blogas ir GSK-B. Kaip rezultatas, p-blogas ir p-GSK-B buvo akivaizdžiai žemyn reguliuojama miR-137 apdoroto HGC-27 ir SGC-7901 ląstelių, palyginti su plaktai-apdoroti arba neapdoroti ląstelių. Nėra reikšmingų pokyčių buvo rasta ne fosforilinto blogai ar GSK (pav 4e). Šie rezultatai rodo, kad pagreitinti skrandžio vėžio ląstelių augimas buvo iš dalies dėl to, kad per actived akt kelius. Be skatinti ląstelių proliferaciją, actived Akt taip pat galėtų fosforilinti neblogai Ser112 ir Ser136, blokuoja Bad sukelta ląstelių žūtį. Atsižvelgiant į fosforilinimo nesant šių svetainių Bad Manoma, kad bendrauti su BCL-XL sukelti ląstelių žūtį. Priešingai, Akt tarpininkaujant hyperphosphorylation Bad gali skatinti ląstelių išgyvenamumą vėžinių ląstelių. Mūsų Imunoblotingo rezultatai patvirtino pirmiau spekuliacijas, kad skrandžio vėžio ląstelių veiklą būklės PPN-137-perkeltų ląstelių kaita gali būti rezultatas sumažėjo fosforilinimas blogai. Be to, mes išanalizavo baltymų lygius AKT2 į 12 GC patientsin kam Pasaulis-137 buvo žemyn reguliuojama. Tarp šių mėginių, AKT2 buvo reguliuojama in9patientsin jų GC audinių (pav 4f).

Iš AKT2 restauravimas švinu prie invazijos aktyvavimo ir apoptozės

slopinimo Siekiant toliau įrodyti kad PPN-137 ir AKT2 vaidmenis tumorigenesis metu, mes ištirti atkūrimo AKT2 poveikį Pasaulis-137 perkeltų ląstelių. Western blot testo parodė, kad AKT2 baltymų lygis AKT2 raiška mėginio, matyt, buvo didesnis nei, kad neigiamos kontrolės net pagal miR-137 slopinimo. Iš AKT2 restauravimas švinu prie invazijos aktyvavimo ir apoptozės slopinimo (5 pav).

Diskusijos

miRNAs dažnai buvo nurodyta būti dažnai dysregulated įvairiose žmogaus vėžio ir kai kurių miRNAs turi netgi buvo naudojamas naudojamas kaip terapinių tikslų vėžio. Tyrimai nuorodos į tarp miRNAs ir vėžio santykiai gali padėti mums su vėžiu supratimą.

Yra tik keli tyrimai, nurodantys vaidmenį Pasaulis-137 grojo skrandžio vėžio. Buvo pranešta, kad Mir-137 yra neigiamas reguliatorius Cdc42 ir nukreipiant kuri skatinančius apoptozę ir ląstelių G1 ciklas arešto skrandžio vėžio ląstelių [17]. Tačiau reglamente poveikis MicroRNA į vėžys yra gana sudėtinga. Atrodo neįmanoma, kad Mir-137 reglamentuoja skrandžio vėžį bendrosios keliu. Šiame tyrime, funkcijos ir mechanizmą, kuris Pasaulis-137 reglamentuoja skrandžio vėžio buvo toliau tiriami.

Pirmiausia, mes nustatėme, saviraiškos miR-137 iš 100 pacientų ir nustatė, kad miR-137 išraiška yra gerokai žemyn -regulated vėžio mėginyje. Taip pat, mes nustatėme, kad statistiškai reikšmingas ryšys tarp miR-137 išraiškos ir skrandžio vėžio klinikinių etape. Šie rezultatai parodė, kad pakitimai miR-137 gali būti įtraukti į skrandžio vėžio progresavimo. Mes bandėme rasti tarp Pasaulis-137 ir pacientų amžiaus ir lyties santykius, tačiau nerasta statistinis rezultatas. Kaip šis tyrimas parodė, kad miR-137 išraiška buvo žemyn reguliuojama dauguma GC audinių sritis lyginant su gretimų audinių (77%), mes galėtų apsvarstyti apie diagnozę ir prognostiniu naudojimo miR-137. Tolesnė validacija ir perspektyvinius tyrimus yra pagrįstas ir labiau prieinamos pavyzdžiai šaltinių, kaip antai Pasaulis-137-praturtintas naviko kilmės exosomes kraujo, turėtų būti tiriami. Be to, reikėtų pastebėti, kad tam tikru mastu nukirptas vertė (išnaikintas = 1,5), mes pasirinkome gali būti dar savavališkai. Kai jis buvo nustatytas didesnis, galėtų būti mažiau pacientams, sergantiems miR-137 žemyn reguliuojama vėžio audiniuose. Tačiau, net ir tokioje padėtyje, kyla buvo apie 23% iš vėžio turi aukštą miR-137 išraiška. Tai gali būti dėl to, kad individualios skirtumo tarp pacientų, kad kai kurie iš asmenų gali turėti skirtingas genų ekspresijos, modelį per tumorigenezei arba vėžio progresavimo.

Kadangi išraiškos miR-137 GC audinių buvo mažesnis nei, kad gretimų audinių statistiškai reikšmingi skirtumai (p = 0,00079), mes galime spėlioti, kad ši išraiška būdinga buvo susijęs su vėžio vystymąsi. Tai spekuliacijos buvo patvirtintas tyrimų in vitro ir in vivo tyrimų, Mir-137 gali neigiamai reguliuoja ląstelių dauginimosi, migracijos ir invazija. Mir-137 raiškos lygis gali išlaikyti aukšto lygio ilgą laikotarpį po transfekciją tiek skrandžio vėžio ląstelių linijų, paskutinės stadijos ksenografiniuose navikų ir inmetastatic vietą plaučius (S1A pav-S1C pav). Tačiau raiškos būdas veda prie labai didelių ekspresijos lygių miR-137 (pav 2A). Tai aukšto lygio miR-137 gali sukelti papildomų efektų. Pavyzdžiui, PPN-137 yra neigiamas reguliatorius Cdc42 ir nukreipiant kuri apoptozės sužadinimui ir ląstelių G1 ciklas arešto skrandžio vėžio ląstelių [17]. Kaip buvo aktyvinama tūkstančius kartų Mir-137 mūsų tyrime, ji gali sukelti ir kitų tikslų, pavyzdžiui, Cdc42 slopinimo. Akivaizdu, kad šiame tyrime mes negalime atmesti galimybės, kad auglio slopinamojo poveikio PPN-137 buvo procesų, kuriuose dalyvauja slopinant kitas tikslines genus.

Tada mes nustatėme, kad Pasaulis-137 veikia kaip naviko slopinamojo geno per tikslinę AKT2 , kuri yra AKT šeimos narys. Iš AKT2 restauravimas sukelia iki reguliavimą AKT2 į Pasaulis-137 perkeltų ląstelių, kuris yra daug didesnis nei, kad peštynės. Tai gegužę, kad AKT2 raiškos atstatomi baltymų lygį Pasaulis-137 slopinamas. Dar svarbiau, kad AKT2 restauravimas reguliuoja apoptozę ir invazija skrandžio vėžio ląsteles, todėl prie invazijos aktyvavimo ir apoptozės slopinimą (5 pav). Ši gelbėjimo eksperimentas suteikia papildomų įrodymų, kad Mir-137 aktyvus ląstelių apoptozę ir neigiamai reguliuoti ląstelių invaziją nukreipiant AKT2. In vivo eksperimentai taip pat parodė, kad Mir-137 išraiška yra neigiamai, palyginti su AKT2 išraiškos (S1D pav ir S1E pav). AKT yra lemiamas veiksnys PI3K /AKT kelio būdu. Žemyn reguliavimas AKT2 toliau veikia jos žemyn srautas baltymų blogas ir GSK-3B, kad P-blogas ir p GSK-B buvo akivaizdžiai žemyn reguliuojama. Blogas galite žaisti savo vaidmenis atliko fosforilinimo ir toliau reglamentuoja ląstelių likimą [18]. GSK-3B, kuris taip pat žinomas kaip GSK-3β paprastai kontroliuoja ląstelių migracija ir invazija. Taigi, mes nustatėme ryšį tarp miR-137 ir AKT2, kad yra nauja sudedamoji dalis skrandžio vėžio Tumorigenesis. Mir-137 buvo įrodyta, kad būti susiję su AKT2 reglamento [19]. Be kepenų ląstelių karcinoma, PPN-137 slopina vėžio ląstelių augimą ir metastazes per tiesiogiai skirta AKT2 [20]. Iš tiesų, mes e jau tikrinami 8 genus kaip potencialūs taikiniai miR-137 (S1 lentelė). Tačiau AKT2 yra tik tiesioginė tikslinė miR-137 po dvejopo liuciferazės reporteris genų tyrimo ir Western Blot tyrimą. Nuo pav 4D mes galime rasti thatmiR-137 gali turėti įtakos AKT2 ir p-AKT2in abu HGC-27 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių. Bet įdomiai, kad SGC-7901 fosforilinimo statusas matyt paveikė daugiau. Šis reiškinys gali būti nuosekliai stebima trijų pakartotinių dėmės mes atliekame. Kad išskaičiavome, kad gali būti dėl to, kad specialios objekto skirtingų vėžio ląsteles. Gali būti konkretus reglamentavimas kelias būdas miR-137 SGC-7901, kuris represuoti į fosforilinimo statusą AKT2.However, iš šio tyrimo, mes negalime visiškai paaiškinti šį mechanizmą. Kai mes pasirinkome pacientams, kurie turi mažą raišką PPN-137 savo GC audinio aptikti AKT2 baltymo ekspresiją, mes nustatėme, kad dauguma šių pacientų (9/12) turi aukštą AKT2 lygį jų GC audinio. Šis rezultatas rodo, kad Mir-137 gali nukreipti AKT2 pacientams. Taip pat buvo trys pacientai, kurie turi mažą raišką AKT2 GC audinio, nors miR-137 išraiška yra mažas. Šis rezultatas gali dėl individualaus skirtumo tarp pacientų.

Taigi, mūsų išraiškos ir funkciniai tyrimai rodo, kad Mir-137 yra dažnai žemyn reguliuoja skrandžio vėžio gali veikti kaip naviko slopintuvas GC ląsteles, atnaujinanti išraiška, kuri ant GC ląstelių slopino skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazija tiesiogiai nukreipti AKT2. Taigi, mūsų darbai yra geras priedas prie ankstesnio darbo ir yra naudinga mums suprasti Mir-137 reguliavimo mechanizmas vėžiu.

Pagalbinė informacija
S1 pav. Pasaulis-137 ir AKT2 išraiška po transfekcija.
A. Pasaulis-137 išraiška HGC-27 ląstelių ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių 72 val po transfekcijos. B. Pasaulis-137 išraiška paskutinės stadijos ksenografiniuose navikų. C. Pasaulis-137 išraiška metastazių lokalizaciją pelių plaučiuose. D. AKT2 išraiška metastazių lokalizaciją pelių plaučiuose. Mes maišyti penkis plaučius kartu į tą pačią grupę. E. AKT2 išraiška metastazių lokalizaciją pelių plaučiuose. Mes nustatėme, kad Akt2 baltymo ekspresija kiekvienoje pele atitinkamai. 30 mikrogramų bendras baltymų buvo naudojamas kiekvieno mėginio
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s001
(TIF)
S2 pav. Ląstelių gyvybingumas tyrimas prieš metastazių eksperimento
Ląstelių gyvybingumas tyrimas buvo atliktas praėjus 24 valandoms po transfekcija
Doi:.. 10,1371 /journal.pone.0130124.s002
(TIF)
S3 pav. Adensitometric analizė pav 4E
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s003
(TIF)
S1 lentelė. . galimoms tikslinėms genai PPN-137
potencialių tikslinių genų PPN-137 buvo prognozuojama on-line įrangą ir aptinka dvigubas liuciferazės reporteris genų tyrimo ir Vakarų bloting
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124. S004
(docx)

Padėka

autoriai dėkoja dr Chengyuan Feng nuo vėžio ligoninėje, kinų medicinos mokslų akademijos teikti techninę pagalbą ir straipsnis Peržiūra.

• PLoS ONE: identifikavimas ir apibūdinimas CXCR4 Teigiamas skrandžio vėžio kamienines ląsteles
• PLoS One: The MicroRNA-217 Funkcijos kaip potencialus auglio slopinamojo skrandžio vėžio nukreipiant GPC5