PLoS One: a mikro-RNS-137 Hozzájárul, hogy a nedves tumorképzésért Emberi gyomorkarcinóma által célzás Akt2

absztrakt katalógusa

miRNS fontos szerepet játszanak a tumorok. Ez a tanulmány középpontjában hatásainak feltárása és a szabályozás mechanizmusa miRNS-137 a biológiai viselkedés gyomorrák. Teljes RNS-t extraháltunk a szövetekből, 100 gyomorrákos betegeknél és négy gyomor rákos sejtvonalak. Expression miR-137 detektáltuk real-time PCR-rel 100 beteg. A hatások a miR-137 fokozott expressziója a gyomor rákos sejteket "proliferáció, apoptózis, a migráció és invázió képesség vizsgálták in vitro és in vivo. A célgén miR-137-ben megjósolta Targetscan on line szoftver, átvizsgáljuk kettős luciferáz riporter gén vizsgálat, és bizonyította Western-blottal. Ennek eredményeként, a kifejezés a miR-137-ben jelentős csökkent a gyomorrák sejtvonalon HGC-27, HGC-803, SGC-7901 és MKN-45, valamint a gyomorrák szövetekben összehasonlítva GES-1 sejt, vagy kiegyenlített szomszédos, nem -neoplastic szövetek ( p katalógusa < 0,001). Az újbóli bevezetése miR-137 a gyomor rákos sejtek volt képes gátolni a sejtproliferációt, a migrációt és inváziót. Az in vivo kísérletek kimutatták, hogy a miR-137 fokozott expressziója csökkentheti a gyomorrák sejtek proliferációját és a metasztázist. Bioinformatikai és Western blot analízis azt mutatta, hogy a miR-137 járt el, mint tumorszuppresszor szerepek a gyomor rákos sejtek keresztül célzási Akt2 és további befolyásoló Bad és a GSK-3β. Összefoglalva, a miR-137, amely gyakran lefelé szabályozni a gyomorrák potenciálisan részt gyomorrák tumorigenezis és metasztázis szabályozásával kapcsolatos Akt2 szignálútvonalak. Katalógusa

Citation: Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Y, Yang W, et al. (2015) a mikro-RNS-137 Hozzájárul, hogy a nedves tumorképzésért Emberi gyomorkarcinóma által célzás Akt2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10,1371 /journal.pone.0130124 katalógusa

Akadémiai Kiadó: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: augusztus 15, 2014; Elfogadva: május 18, 2015; Megjelent: június 23, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Wu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: Ezt a munkát támogatott orvosi tudomány és a technológia kutatási projektek Henan tartomány, Kína (2011030004). katalógusa

Érdekütközés: a szerzők kijelentette, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető katalógusa

a gyomorrák (GC) a második gyakori halálok a rák világszerte [1]. Eddig, a mechanizmus a gyomor carcinogenesis nagyrészt ismeretlen. A kutatók megpróbálták, hogy tanulmányozza GC a kilátás biokémia és molekuláris biológia, hogy bizonyos tumor-szuppresszor gének és a tumor kapcsolatos gének számoltak be GC. A mikroRNS (miRNS-ek) endogén módon kis nem-kódoló RNS-ek 18 ~ 22 nukleotidok, amelyeket azonosítottak, mint poszttranszkripciós szabályozók génexpresszió [2, 3]. MiRNS-ek döntő szerepet játszanak a sok biológiai folyamatok, mint például proliferáció, a fejlesztés, a differenciálódást és apoptózist. Eközben miRNS validált fellépni onkogének vagy tumor szupresszor gének alatt tumorogenezisben. Például a miR-31 azonosították egy onkogént a nyelőcső pikkelyes sejtes karcinóma [4] és a miR-451 működik, mint egy tumorszuppresszor a humán nem kissejtes tüdőrák [5]. Van számos mikroRNS azonosítottak kapcsolódó gyomorrák történik és fejlesztés [6-13]. Azt is leírták, hogy a túlzott expressziója a miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34a és miR-423-5p lehet használni, mivel a diagnosztikai kritériumok a gyomorrák [14] .Ezért miRNS potenciális jelöltjei új diagnosztikus biomarkerek és terápiás célpontok gyomorrák. katalógusa

mikroRNS-137 (miR-137) leírták, hogy lefelé szabályozni és játszik szerepet, mint a tumor szupresszor colorectalis rák és a szájüregi rák [15, 16]. Azonban, a funkció a miR-137 és mechanizmusa gyomor carcinogenesis még mindig nem világos. Chen és munkatársai: feltárta, hogy a miR-137 is játszik a tumor szuppresszor megcélzásával CDC42, hogy szabályozzák a sejtciklus gyomorrákban [17]. Még így is egyértelműen számunkra, hogy a mikro-RNS szabályozza a biológiai viselkedést a többutas módon, hogy ott lehet a további szabályozás mechanizmusa a miR-137 felé GC tumorogenezisben. Ebben a vizsgálatban mértük a kifejezés a miR-137 100 gyomorrákos betegeknél és vizsgálták a szerepek a miR-137 a gyomor rákos sejteket. Találtunk néhány más funkcióját miR-137 GC, valamint egy másik utat út, melyen a miR-137 szerepet játszott a tumor szupresszor GC tumorogenezisben. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai nyilatkozat

az összes humán tanulmányok hagyta jóvá a megfelelő etikai bizottság és ezért a megfelelően elvégzett etikai normákat. Minden személy adta beleegyezését megelőzően a vizsgálatba való bevonás. Katalógusa

A betegek és minták katalógusa

Az emberi gyomorrák gyűjtöttünk sebészeti mintákban 100 beteg (férfi 56, nő 44) GC a Cancer Institute és a Kórház első kapcsolt kórház Henan Egyetem; A második Kórház a Népi Felszabadító Hadsereg Kínában; Hebei Cancer Kórház. Nem-daganatos mintát a makroszkopikus tumor árrés izoláltunk egy időben, és ezt használjuk az egyező szomszédos, nem neoplasztikus szövetekben. Minden mintát két részre oszlik. A szövetmintákat gyűjtöttük azonnal hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -80 ° C-on, amíg az RNS extrakció. A használata a szövetminták minden kísérlet hagyta jóvá az etikai testület az Institute of Basic Medical Sciences, kínai Orvostudományi Akadémia. Minden résztvevő biztosított a verbális tájékozott beleegyezés, hogy vegyenek részt ebben a vizsgálatban, és a szóbeli tájékoztatást hozzájárul lejegyezték. Ez onsent folyamat is jóváhagyta az etikai bizottság. Négy gyomor rákos sejtvonalat (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 és MKN-45) adunk valamennyi konzervált a laboratóriumunkban és DMEM vagy 1640 10% FBS-t.

RNS extrakció, cDNS-szintézis , és a valós idejű PCR-assay

teljes RNS-t a szövetek és sejtek extraháltuk Trizol módszerrel (Ambion, USA) teljesen utasításokat követve. Egyszálú cDNS-t szintetizáltunk az M-MLV (Ambion, USA) alkalmazásával 2 ug teljes RNS templátként. Oligo (dT) 18 alkalmaztunk az mRNS reverz transzkripció míg szár hurok használt miRNS. Real Time-PCR-t (RT-PCR) végeztünk Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) alkalmazásával SYBR keverék (Tiangen, Kína). A PCR-feltétel volt: 95 ° C × 30-as, majd 40 ciklus: 95 ° C × 5S, 60 ° C × 34s. Az mRNS-ek, GAPDH-t használunk normalizált ellenőrzés. A miRNS-ek, U6 snRNS használtuk miRNS ellenőrzés. A relatív expresszióját miR-137 számítottuk ki 2-ΔΔCT módszerrel. Primer szekvenciákat az 1. táblázat mutatja katalógusa

A plazmid építőipari katalógusa

A miR-137 prekurzor szekvenciát által generált illesztjük és miR-137-prekurzor-F és miR-137-prekurzor-R meghosszabbítás közben emésztettük BamHI és BglII, amelynek termékei volt behelyez a BamHI-BglII fragmenst a pcDNA-GW /EmGFP-miR vektorba (GenePharma, Kína). Az időközben a negatív kontroll megépült. Katalógusa

Sejttenyészetek és miRNS transzfekció katalógusa

A sejtvonalak HGC-27, SGC-7901 MKN-45 és GES-1-ben vásárolta a Cell Resource Központ Intézet Basic Medical Sciences, kínai Orvostudományi Akadémia és Peking Unió Medical College (Peking, Kína). Az emberi gyomor sejtvonalak HGC-27, SGC-7901 és MKN-45 tenyésztettünk RPMI 1640 (Gibco, BRL, Egyesült Királyság) Media, kiegészítve 10% magzati borjúszérumot és az emberi gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1 DMEM ( Gibco, BRL, Egyesült Királyság) a média. A miR-137 utánozzák, és a Scramble utánzó, amely nem homológ a humán genom szintetizáltuk GenePharma (Shanghai, Kína), és transzfektáltuk a sejtekbe, hogy a végső oligonukleotid koncentrációja 10nmol /l. Minden sejt transzfekciót vezették be DharmaFECT1 reagens (Dharmacon, TX, USA), a gyártó által felhasznált utasításokat. Minden egyes cella transzfekciós két vagy három replikációs kísérletet végeztünk.

sejt proliferáció és apoptózis assay

A sejtproliferációt vizsgálatot úgy végezzük, CCK8 módszerrel (Dojindo, Japán). Röviden, a körülbelül 5000 miR-137 utánozzák transzfektált sejtek kódoltakat sejteket rendre oltottunk 96 lyukú lemezekre és tenyésztettünk. Proliferációs sebességet meghatároztuk a 0, 12, 24, 48, 72, 96 órával a transzfekció után hozzáadásával 10 jil CCK8 Regent és tesztelt szerint a kézirat. Az apoptózis assay-teszteltük HGC-27 és SGC-7901 sejtek vonalak vagy anélkül miR-137 fokozott expressziója az apoptózis által Detection Kit I (BD Biosciences, USA) és a C6 Áramlási citométer (USA).

-migráció és inváziós vizsgálati katalógusa

végeztünk Humilin assay tesztelni sejtmigráció képes vagy anélkül miR-137 transzfekciója. A mesterséges sebek termeltek az összefolyó egyrétegű sejteket FBS szabad, egy 200 pl pipetta hegyét 24 órával a miR-137 transzfekciós. A kép rendre venni a 0, 12, 24 és 36 óra után a seb létrehozását. Katalógusa

Ezután végre transzwell vizsgálatok értékelésére sejtek invázióját képességét. 5 × 10 ^{4 sejteket szuszpendáljuk 200 ul tápközegben FBS nélküli helyeztünk a felső kamrába az egyes betét 430μl 1 mg /ml-es Matrigel (Millipore, USA). 600 ul tápközegben, amely 10% FBS-t, mint a táplálkozási attraktáns került az alsó kamrában. 24 óra elteltével a sejteket csatolt alsó felületéhez kamra voltak fi x 20 perc 20% -os metanollal, és megfestettük 10 percig 10% -os maygruwald-Giemsa (MGG). Az invázió membránokat ezután vágjuk le, és a beágyazott alatt kenjük. Mi számít a sejteket 3 különböző látás mezők állapotban 20 × Magni fi kation, amely ezután használjuk a sejtek átlagos számát. Minden vizsgálatot végeztünk három független kísérlet. Katalógusa}

állatkísérleti katalógusa

A kísérleteket állatok bevonásával végeztük útmutatója szerint az ápolás és a laboratóriumi állatok felhasználását, valamint az intézményi etikai irányelvek az állatkísérletek. A protokoll hagyta jóvá a Bizottság Etikai Állatkísérletek az MEGTEKINTÉSE (Kínai Orvostudományi Akadémia) (engedély száma: C72-14-0664). Minden műtét alatt végeztük nátrium pentobarbitál érzéstelenítés, és minden erőfeszítést tettek arra, hogy minimálisra csökkentsék a szenvedést. Habar transzfektált és miR-137 túltermelése HGC-27 sejteket (5 x 10 ^{6 sejt) oltunk szubkután dorzális szárnyakon BALB /c csupasz egerek (nőstény Nu /Nu, 6 hetes), amelyek mindegyike vásárolt Animal Centre Henan Egyetem és nevelkedett, kórokozóktól mentes körülmények között. A kötet a tumor mértük 5 héten át. Az egereket megölték és sc tumorokat kimetszettük, és a tumorok tömegére teszteltük. Az in vivo metasztázis kísérletekben HGC-27 sejteket összegyűjtjük 24 órával a transzfekció után. A sejt életképesség vizsgálatot végeztünk egy XTT próbával kit24 órával a transzfekció, a gyártó utasításai szerint (Roche, Tokió, Japán). Ezután az egerek (nőstény Nu /nu 6 hetes) injektálunk HGC-27 sejtek vagy anélkül miR-137 fokozott expressziója a farokvénán keresztül, 2 × 10 5 sejt PBS-ben. A HGC-27 sejteket módosított amely stabilan kifejezni luciferáz (épült GENECHEM, Shanghai, Kína). A sejteket ellenőrizni mikroszkóp, hogy megbizonyosodjon arról, hogy a sejtek jó állapotban. Hat hét után Biolumineszcencia képalkotó végeztünk egy IVIS Spectrum és a kép ragyogását értékek normalizálódtak a Living Image (Caliper Life Science, USA). Katalógusa}

Az immunhisztokémiai katalógusa

A szöveteket paraffinba ágyaztuk szakaszok és kezelt 2 órán át 65 ° C-on, majd deparaffinised. Alkalmazása előtt a primer antitesteket 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át végeztünk az antigén visszakeresés lépés. Ezt követően, a metszeteket inkubáltuk szekunder antitesttel mintegy 2 órán át 25 ° C-on konjugált HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, Kína). A Liquid DAB + Hordozó (zsgb-bio, Kína) volt kimutatására használt HRP aktivitást. Katalógusa

Luciferase miRNS target riporter vizsgálat katalógusa

A teljes hossza a 3'UTRs emberi Akt2 mRNS voltak minden PCR és klónozva pMIR-REPORTTM luciferáz riportert Vector (Ambion, USA), hogy létrehoz a riporterek. Mutációk a megjósolt mag régiók a mRNS-szekvenciákat segítségével létrehozott primerek, beleértve a mutált helyek. HEK-293T sejt oltunk 24 mérőhelyes lemezekre (1 × 10 ^{5 sejt per lyuk), a nap előtt transzfekció végeztünk. Cells (~70% összefolyó) transzfektáltuk pRL-TK luciferáz riporter (50 ng /lyuk), pGL-3firefly luciferáz (10 ng /lyuk), és utánozzák-137 (50 nmol /L, GenePharma, Shanghai, Kína), vagy Scramble (50 nmol /l) Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Luciferase tevékenységek mértük a Dual Luciferase Reporter Assay (Promega, USA).}

Western blot

a fehérjéket elválasztottuk 10% SDS-PAGE, majd átvisszük 0,45 um PVDF membránra (Amersham, UK). A membránokat 5% zsírmentes szárított tej egy éjszakán át 4 ° C-on, és az anti-Akt2 monoklonális antitest (Proteintech, USA) 1: 1000 hígításban; anti-Bad monoklonális antitest (Bioworld, USA) 1: 500 hígítás; anti-GSK-3B poliklonális antitest (Bioworld, USA) 1: 1000 hígításban; anti-GAPDH antitest (Proteintech, Chicago, USA) 1: 30,000 hígításban. Kétszeri mosás után TBST-vel, a membránokat inkubáltuk kecske anti-nyúl antitesttel (zsgb-Bio, Kína), 1: 5000 és 1: 50000 hígítások 2 órán át.

Statisztika

Valamennyi kísérletet megismételjük legalább három alkalommal. Student-féle t-teszt (kétfarkú), és az X ^{2 tesztet végeztünk, és statisztikailag szignifikáns szinten állítottuk α = 0,05 két-oldalon). Átlag ± SD megjelenik a számok. Katalógusa}

Eredmények katalógusa

miR-137 lefelé szabályozni a gyomorrák sejtek és klinikai minták katalógusa

Először kifejeződését vizsgáltuk érett miR -137 4 humán gyomor rákos sejtvonalat (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 és MKN-45) és a gyomornyálkahártya sejt (GES-1). Ezek a GC sejtvonalak mutatott rendkívül alacsony expressziója miR-137, mint a GES-1 sejtvonal (1A ábra). Ahhoz, hogy tovább tanulmányozza a kapcsolatot a miR-137 GC előfordulása találtunk, a kifejezés a miR-137 100 klinikai beteg (férfi 56, nő 44, átlagéletkor 53 év) Taqman próba-drived real-time PCR a fent leírtak szerint. 100 GC minta, a kifejezés a miR-137-ben leszabályozott 77 esetben (77%), mint a környező szövetek, amikor a levágott hozták létre, 1.5. Eközben a miR-137 volt, akár szabályozott 23 esetben (23%) (1B ábra és 1C). Általában a kifejezés a miR-137 GC szövetekben alacsonyabb volt, mint a szomszédos szövetekben statisztikailag szignifikáns különbséget (p = 0,00079, páros t-teszt, kétfarkú, ábra 1C). Továbbá azt találtuk, statisztikailag szignifikáns összefüggést a kifejezése miR-137 és a gyomorrák klinikai fázisban. A betegek, akik az alacsonyabb szintű miR-137 expresszió kapcsolódó magas minőségű és a késői stádiumú daganatok (1d). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a megváltozott miR-137 lehetne vonni a gyomorrák progresszió. Katalógusa

A miR-137 gátolja a sejtek szaporodását in vitro és in vivo katalógusa

transzfektált miR-137 utánozzák a GC-sejtvonalak HGC-27 és SGC-7901, amelyek mindegyike mutatott nagy transzfekciós hatékonyságot (2A ábra). Az eredmények a CCK8 növekedési assay 0, 1, 2, 3 és 4-d Miután miR-137 kódoltakat transzfekció ábrán mutatjuk be a 2B. Összehasonlítva Scramble transzfekció miR-137 transzfekciós szignifikánsan csökkentette a proliferációt mindkét sejtvonal (2B ábra). Aztán hatását vizsgálták a miR-137 sejt apoptózist. A korai apoptotikus sejtek a tülekedés csoportban 10% körüli volt a HGC-27 és 2,9% SGC-7901, mivel miután a miR-137 transzfektálás százaléka korai apoptotikus sejtek emelkedett 17,5% HGC-27 és 8,3% SGC-7901, amely szignifikánsan különbség (2C ábra). Ezekből az eredményekből arra lehet következtetni, hogy a miR-137 képes elnyomni tüdőrák sejtek túlélését indukálásával korai apoptózis.

további igazolására a fentiekre, egy in vivo modell került kialakításra. Azt találtuk, hogy a daganat növekedését lényegesen kisebb volt, a miR-137 túltermelése egerekben, mint a kontrollcsoportban (ábra 2D, 2E és 2G). Egyetértésben a tumor növekedési görbe, a súlyok által indukált tumorok tülekedés sejtek szignifikánsan magasabb volt, mint a miR-137 túltermelése (ábra 2F). Ezek az eredmények is megerősítette, hogy a miR-137 fokozott expressziója korlátozhatja a gyomorrák sejtek proliferációját in vivo.

miR-137 gátolja a sejt migrációs és behatolás in vitro és in vivo

további értékelte a hatásokat a miR-137 sejtek migrációját és invázióját, melyek a legfontosabb tényezők a rosszindulatú progresszió és metasztázis. A hatások a miR-137 sejtek migrációját is bizonyítja a sebgyógyulást /scratch esszé HGC-27, SGC-7901 sejtek. Mind a két sejtvonalat kezeljük miR-137 utánzó voltak jellegzetesen kevesebb vándorló mint Scramble kontroll vagy kezeletlen sejtek 12, 24, és 36 óra után a karcolás (3A ábra). Továbbá, mi végzett sejt inváziós vizsgálati eljárás mérésére irányított invázió képességeit után a sejtek miR-137 fokozott expressziója. Ennek eredményeként, a invazivitását transzfektált sejtek miR-137 utánzó drámaian képest csökkent a Scramble sejtek HGC-27 és SGC-7901 (3B ábra). Ezután in vivo kísérletekben alkalmazott további igazolására, ezt az eredményt. Elsőként kimutattuk, hogy transzfektált sejtek miR-137 utánozzák vagy utánozzák kontroll nem mutatott szignifikáns csökkenést a sejtek életképességét, mint a kezeletlen sejtek. Továbbá, nincs különbség a sejtek életképességében a transzfektált sejtek miR-137 utánzó képest negatív kontroll (S2 ábra). Amint azt a 3C, a biolumineszcens képalkotás az egerek a miR-137 overexpresszió csoport mutatott sokkal kisebb képet. Továbbá, a több tüdő áttét per egerek miR-137 csoport szignifikánsan alacsonyabb, mint a tülekedés csoport, amely jelezte, hogy a miR-137 lehetett elnyomni metasztázis in vivo. Az eredmények azt mutatták, hogy a miR-137 fontos szerepet játszottak a szabályozó-migráció és invazív gyomorrákban, és azt javasolta, hogy a down-regulációja miR-137 hozzájárulhat a daganatos áttétek a gyomor kialakulásában. Katalógusa

miR-137 céloz Akt2 GC katalógusa

miRNS végzett biológiai funkciók révén negatívan szabályozzák célgénjeinek. Ahogy várható volt közötti komplementaritás van-miR-137 és Akt2 3'-UTR (ábra 4A). Katalógusa

A teszt a feltételezést, hogy Akt2 lehet a cél a miR-137, egy riporter plazmidot a vad típusú 3'-UTR régióban Akt2 folyásirányban luciferáz kódoló régió (ábra 4A AKT2_WT) került kialakításra. HEK-293T sejteket kotranszfektáltunk riporter plazmiddal (AKT2_WT) kódoltakat. Ennek eredményeként, a miR-137 transzfektált sejtek mutattak jelentős csökkenését (≈58%) a luciferáz aktivitást (ábra 4B). Ezután ugyanazt a vizsgálatot végeztünk egy másik riporter plazmidot tartalmazó mutált Akt2 3'-UTR in miR-137 kötőhelyeket. Ahogy az várható volt, a gátlása luciferázaktivitást miR-137 részben eltávolítjuk kötőhely 1 vagy kötelező cite 2 mutáns és majdnem megszüntette a AKT2_MUT kettős mutáns, ami arra utal, hogy a konzervált régió volt teljes mértékben felel miR-137 funkció (ábra 4B) .

Ahhoz, hogy tovább vizsgálják a kölcsönhatás miR-137 és Akt2, HGC-27, SGC-7901 sejteket a miR-137. Akt2 mRNS expresszióját határoztuk meg real-time PCR. Nem volt szignifikáns különbség között a miR-137-kezelt és tülekedés kezelt vagy kezeletlen HGC-27, SGC-7901 sejtekben (4C). Ezután Western-blot elemzést végeztünk, hogy szintjének mérésére Akt2 fehérje. Azt találtuk, hogy a kifejezés a Akt2 fehérje le volt szabályozva miR-137 kezelt HGC-27 és SGC-7901 sejtek, de nem Scramble vagy kezeletlen sejtek (ábra 4d). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a miR-137 közvetlenül elismeri a 3'-UTR Akt2 mRNS és gátolja Akt2 fordítás. Így lefelé szabályozott miR-137 a gyomorrák gátolja a elnyomása Akt2, ami viszont lassul tumorigenezis.

Akt2 tagja AKT család. Mi tovább észlelt downstream hatások Bad és a GSK-B. Ennek eredményeként, a p-Bad és p-GSK-B nyilvánvalóan lefelé szabályozni miR-137 kezelt HGC-27 és SGC-7901 sejtek összehasonlítva Scramble-kezelt vagy kezeletlen sejtekben. Nincs jelentős változás találtak nem foszforilezett Bad vagy GSK (ábra 4E). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a gyorsított gyomorrák sejtek növekedését csak részben volt köszönhető, hogy a túlzott aktivizálódik Akt utak. Emellett elősegíti a sejtek szaporodását, aktivizálódik Akt is foszforilálni rossz Ser112 és Ser136, blokkoló Bad-indukált sejthalált. Hiányában foszforilációs ezeken a helyeken, Bad úgy gondolják, hogy kölcsönhatásba lépnek a Bcl-XL indukál sejthalált. Ezzel ellentétben, az Akt által közvetített hiper-Bad elősegítheti a sejtek túlélését a rákos sejtekben. A Western blot eredmények megerősítették a fenti spekuláció, hogy a változás a gyomorrák sejt tevékenységek állapotának miR-137-transzfektált sejtek lehetnek eredményeként csökkent foszforilációját Bad. Továbbá elemeztük a fehérje szintje Akt2 12 GC patientsin akit miR-137-ben leszabályozott. E minták közül Akt2 volt, akár szabályozott in9patientsin a GC szövetekben (ábra 4F). Katalógusa

A helyreállítás Akt2 ólmozott aktiválási invázió és elnyomása apoptózis katalógusa

Annak érdekében, hogy bizonyítani a szerepek a miR-137 és Akt2 alatt játszott tumorigenezis, megvizsgáltuk a hatását helyreállítása Akt2 a miR-137 transzfektált sejtekben. A Western-blot bizonyította, hogy a Akt2 fehérje szinten Akt2 overexpresszió minta láthatóan nagyobb, mint a negatív kontroll alatt is elnyomása miR-137. A helyreállítás Akt2 ólmozott aktiválási invázió és elnyomása apoptózis (5. ábra). Katalógusa

Vita katalógusa

miRNS már gyakran jelezték, hogy gyakran megbomlik különböző emberi rák és bizonyos miRNS van még használták alkalmazott terápiás célpontként a rák. A kutatások hivatkozva közötti kapcsolat miRNS és a rák segíthet nekünk a megértés rák. Katalógusa

Már csak néhány kutatás utaló szerepét miR-137 játszott gyomorrák. Leírták, hogy a miR-137 egy negatív szabályozója Cdc42 és megcélzásával, amelyek apoptózis indukálására és sejtciklus G1 leállítását a gyomorrák-sejtek [17]. A rendelet azonban hatása mikroRNS rák meglehetősen bonyolult. Úgy tűnik, lehetetlen, hogy a miR-137 szabályozza a gyomorrák az egységes útvonalon. Ebben a kutatásban, a funkció és a mechanizmus, amely a miR-137 szabályozott gyomorrák tovább vizsgálták. Katalógusa

Először is kimutatható a kifejezés a miR-137 100 beteg, és megállapította, hogy ez a kifejezés a miR-137 jelentősen le -regulated rákos mintában. Továbbá azt találtuk, statisztikailag szignifikáns összefüggést a kifejezése miR-137 és a gyomorrák klinikai fázisban. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a megváltozott miR-137 lehetne vonni gyomorrák progresszió. Megpróbáltuk megtalálni a kapcsolatát a miR-137 és a betegek életkora, neme, de nem statisztika eredménye találtak. Mivel a jelen tanulmány kimutatta, hogy a kifejezés a miR-137-ben alulszabályozott a legtöbb GC szövetek képest szomszédos szövetekben (77%), tudtuk vizsgálni a diagnózis és prognosztikai felhasználása miR-137. További hitelesítés prospektív tanulmányok indokolt és könnyebben hozzáférhető minták források, mint például a miR-137-ban dúsított tumor eredetű exoszómák vérből, meg kell vizsgálni. Továbbá meg kell jegyezni, hogy bizonyos mértékig a cut off érték (vágva = 1,5) választottuk lehetne még önkényes. Amikor hozták a magasabb, ott lehet kevesebb betegnél miR-137 le van szabályozva a rákos szövetekben. Azonban még ebben az állapotban volt körülbelül 23% -a a rákos megbetegedések magas miR-137 expressziót. Ez lehet az oka, hogy az egyedi különbség betegek körében, hogy egyes egyének eltérő génexpressziós mintázat alatt tumorigenezis, vagy a rák progressziójának.

Mivel a kifejezés a miR-137 GC szövetekben alacsonyabb volt, mint a szomszédos szövetekben statisztikailag szignifikáns különbséget (p = 0,00079), tudtuk feltételezés, hogy ez a kifejezés jellegzetes járt a rák fejlődését. Ez a spekuláció is megerősítették az in vitro és in vivo vizsgálatok, hogy a miR-137 negatívan szabályozzák a sejtproliferációt, a migrációt és inváziót. A miR-137 expressziós szint folyamatosan magas szinten hosszú időn transzfekció után mind a gyomorrák sejtvonalakon, végstádiumú xenograft tumorok és inmetastatic helyét a tüdőben (S1A Fig-S1C ábra). Azonban a túltermelése módszer vezet nagyon magas expressziós szintjének miR-137 (2A ábra). Ez a magas szintű miR-137 okozhatnak további hatásokat. Például, miR-137 egy negatív szabályozója Cdc42 és megcélzásával, amelyek apoptózis indukálására és sejtciklus G1 leállítását a gyomorrák-sejtek [17]. Mivel a miR-137 a mi vizsgálatot upregulált ezerszer, akkor vezethet a gátlása más célok, mint például Cdc42. Nyilvánvaló, hogy ebben a tanulmányban nem zárhatjuk ki azt a lehetőséget, hogy a tumor szupresszor hatásait miR-137 közvetítik elnyomja más target gének. Katalógusa

Ezt azt találtuk, hogy a miR-137 működik, mint egy tumor szupresszor gén keresztül célzott Akt2 , amely tagja az AKT család. A helyreállítás Akt2 okozza a szabályozás kialakítása Akt2 a miR-137 transzfektált sejtekben, ami sokkal nagyobb, mint a tülekedés. Ez annak köszönhető, hogy a Akt2 túltermelése megfordította a fehérje szintje a miR-137 elnyomott. Még fontosabb, hogy a helyreállítás Akt2 szabályozza az apoptózis és invázió gyomorrák-sejtek, ami az aktiváló invázió és elnyomása apoptózis (5. ábra). Ez mentési kísérletben további bizonyítékot szolgáltatnak, hogy a miR-137 aktív sejt apoptózis és negatívan szabályozza a sejtek invázióját célzási Akt2. In vivo kísérletek is igazolták, hogy a miR-137 expresszió negatívan képest Akt2 kifejezés (S1D ábra és S1E ábra). AKT döntő tényező a PI3K /AKT-ösvény. A lefelé szabályozása Akt2 tovább befolyásolja a down-stream fehérje Bad és a GSK-3B, hogy a p-Bad és p-GSK-B nyilván le van szabályozva. Bad játszhat a szerepek foszforiláció és tovább szabályozza a sejt sorsa [18]. A GSK-3B, amely szintén ismert, mint a GSK-3β általában, szabályozza a sejt bevándorlási és invázió. Összefoglalva, az általunk azonosított összefüggés miR-137 és Akt2 hogy egy új összetevője gyomorrák tumorogenezisben. A miR-137 kimutatták, hogy kapcsolatban áll Akt2 rendelet [19]. A hepatocelluláris karcinóma, miR-137 gátolja a rákos sejtek növekedését és a metasztázist keresztül közvetlenül megcélzó Akt2 [20]. Tény, hogy e már átvizsgált 8 gének potenciális célpontjai miR-137 (S1 táblázat). Azonban a Akt2 az egyetlen közvetlen célpontja a miR-137 után kettős luciferáz assay és western blot vizsgálatot. Ábrán 4D találunk thatmiR-137 befolyásolhatja a Akt2 és p-AKT2in mind HGC-27, SGC-7901 sejtek. De érdekes módon, az SGC-7901 a foszforilációs állapotát nyilvánvalóan érintett több. Ez a jelenség következetesen megfigyelhető a három ismétlődő blotokat végeztünk. Mi levonni, hogy ott lehet az oka, hogy a speciális tulajdonsága különböző rákos sejteket. Lehet, hogy külön rendeletben-ösvény a miR-137 SGC-7901, amely elnyomta a foszforilációs állapotát AKT2.However, a jelenlegi kutatások, nem tudjuk teljes mértékben megmagyarázni ezt a mechanizmust. Amikor kiválasztottuk a betegeknél, akiknek alacsony expressziója a miR-137 a saját GC szövetek kimutatására a Akt2 fehérje expresszió, azt találtuk, hogy e betegek többségénél (12/09) magas Akt2 szinten, saját GC szövetben. Ez az eredmény azt javasolta, hogy a miR-137 célozhatja Akt2 betegeknél. Voltak három betegnél, akiknek alacsony kifejeződése Akt2 GC szövet, bár a kifejezés a miR-137 alacsony. Ez az eredmény miatt az egyes különbség betegek körében. Katalógusa

Összefoglalva, a véleménynyilvánítás és a funkcionális vizsgálatok arra utaltak, hogy a miR-137 gyakran lefelé szabályozni a gyomorrák járhat tumorszuppresszorként GC sejtek visszaállításának kifejeződése, amely a GC-sejtek elnyomják gyomorrák sejt proliferáció, migráció és inváziója közvetlenül megcélzó Akt2. Így munkánk egy jó kiegészítés a korábbi munka és hasznos számunkra, hogy megértsük a miR-137 állító mechanizmus a rák. Katalógusa

alátámasztó információk
S1 ábra. miR-137 és Akt2 kifejezés transzfekció után. katalógusa A. miR-137 expresszió HGC-27 sejtek, SGC-7901 sejtek 72 órával a transzfektálás. B. miR-137 expresszió a végstádiumú xenograft tumorokban. C. miR-137 expresszió metasztatikus lokalizáció egerek tüdejét. D. Akt2 kifejezés metasztatikus lokalizáció egerek tüdejét. Mi összekeverjük az öt tüdő együtt ugyanabban a csoportban. E. Akt2 kifejezés metasztatikus lokalizáció egerek tüdejét. Azt észleltük a Akt2 fehérje expresszió mindegyik egér volt. 30 ug teljes fehérje használtunk minden egyes minta.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0130124.s001 katalógusa (TIF) katalógusa S2 ábra. Életképesség teszt előtt metasztázis kísérlet. Katalógusa sejtek életképességét vizsgálatot végeztünk 24 órával a transzfekció. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0130124.s002 katalógusa (TIF) hotelben S3 ábra. Adensitometric elemzése ábra 4E. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0130124.s003 katalógusa (TIF) hotelben S1 táblázat. Lehetséges célgénjeit miR-137.
Potenciális célgénjeit miR-137 is megjósolta on-line szoftver által észlelt kettős luciferáz assay és nyugati bloting. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0130124. S004 katalógusa (DOCX) hotelben

Köszönetnyilvánítás katalógusa

A szerzők köszönetet mondanak Dr. Chengyuan Feng: Cancer kórház, kínai orvostudományi Akadémia a technikai segítségnyújtás és a cikk felülvizsgálatára. katalógusa

• PLoS One: azonosítása és jellemzése CXCR4-pozitív gyomorkarcinóma Stem Cells
• PLoS One: A mikro-RNS-217 működik, mint egy potenciális tumor szupresszor gyomorrákban megcélozva GPC5