PLoS ONE: mikrornk-137 Doprinosi namočenom tumorigenezi u ljudskoj raka želuca ciljajući AKT2

Sažetak pregled

MiRNAs igraju važnu ulogu u nastanku tumora. Ova studija usmjerena na istraživanje efekata i regulacija mehanizam Mirna-137 na biološke ponašanja raka želuca. Ukupna RNA je ekstrahirana iz tkiva od 100 pacijenata s karcinomom želuca i iz četiri želučanom staničnim linijama raka. Ekspresija Mir-137 detektirana je u realnom vremenu PCR od 100 pacijenata. Učinci miR-137 prekomjerne ekspresije na stanicama raka želučanog 'proliferacije, apoptoze, migraciju i invaziju sposobnosti ispitivane su in vitro i in vivo. Ciljani gen Mir-137 je bio predviđen Targetscan on line programa, prikazan dvostrukom Luciferaze reporter gena i pokazuje western blot. Kao posljedica, ekspresija Mir-137 je značajno smanjio u želučanom raka stanične linije HGC-27 HGC-803, SGC-7901 i MKN-45 kao u želučanom tkivu karcinoma u usporedbi s GES-1 stanice, ili se podudaraju susjedni non -neoplastic tkiva ( p pregled < 0,001). Ponovno uvođenje Mir-137 u želučanih stanica raka je mogao inhibirati proliferaciju stanica, migraciju i invaziju. In vivo eksperimenti pokazali su da je Mir-137 prekomjerna ekspresija može smanjiti proliferaciju i metastaze želučane stanica raka. Bioinformatika i Western blot analiza je pokazala da je Mir-137 djelovao kao suzbijanje tumora uloga na želučanih stanica raka kroz ciljanje Akt2 i dalje utječe na loše i GSK-3β. U zaključku, Mir-137 koja je često dolje regulirano raka želuca potencijalno uključena u želučanom tumorigenezi raka i metastaza reguliranjem AKT2 vezane signala pregled

Izvor:. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Y, W Yang, et al. (2015) mikrornk-137 Doprinosi namočenom tumorigenezi u ljudskim karcinoma želuca ciljajući AKT2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10,1371 /journal.pone.0130124 pregled

Akademska Urednik: Irina V. Lebedeva, Sveučilište Columbia, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 15. kolovoza 2014.; Prihvaćeno: 18. svibnja 2015; Objavljeno: 23. lipanj 2015 pregled

Copyright: © 2015 Wu i sur. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegove popratne podatke datoteke

financiranja.. Ovaj rad je podržan od strane medicinske znanosti i tehnologije istraživačkih projekata provinciji Henan, Kina (2011030004)

suprotstavljenih interesa: autori su izjavio je da ne postoje suprotstavljeni interesi. pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je drugi uzročnik smrti od raka u svijetu [1]. Do sada, mehanizam želučane karcinogeneze je u velikoj mjeri nepoznanica. Istraživači su pokušali učiti GC s obzirom na biokemije i molekularne biologije da neki tumor supresorski geni i geni povezan s tumorom su iskazane u GC. MikroRNA (miRNAs) su endogeno male ne-kodiranje RNA od 18 ~ 22 nukleotida koji su identificirani kao posttranskripcijsko regulatori ekspresije gena [2, 3]. MiRNAs igraju kritičnu ulogu u mnogim biološkim procesima, kao što su proliferacije, razvoj, diferencijaciju i apoptozu. U međuvremenu, miRNAs su potvrđene da djeluje kao onkogena ili tumor supresorski geni tijekom nastanku tumora. Primjerice miR-31 je identificiran kao onkogena u karcinom skvamoznih stanica jednjaka, [4] i miR-451 djeluje kao supresor tumora kod humanog raka ne-malih stanica pluća [5]. Tu su i brojne mikroRNA su identificirani u vezi s rakom želuca događa i razvoj [6-13]. Također je izvijestio da je prekomjerna ekspresija Mir-1, Mir-20a, Mir-27a, Mir-34a i Mir-423-5p može se koristiti kao dijagnostički kriterij raka želuca [14] .Stoga, miRNAs su potencijalni kandidati novih dijagnostičkih biljega ili terapijskih ciljeva raka želuca. pregled

mikrornk-137 (mir-137) je izvijestila da se regulirati na dolje i igrati uloge kao supresor tumora kod raka debelog crijeva i raka usne šupljine [15, 16]. Međutim, funkcija Mir-137, a mehanizam u podlozi želučane karcinogeneze su još uvijek nije jasno. Chen i sur pokazali da je miR-137 može predstave kao tumor-supresor ciljanjem CDC42 regulira stanični ciklus rakom želuca [17]. Čak i tako, to je jasno da nam da mikrornk regulira biološki ponašanja po više put tako da bi moglo biti više mehanizam regulacije Mir-137 prema GC nastanku tumora. U ovoj studiji, izmjerili smo ekspresiju Mir-137 u 100 bolesnika s karcinomom želuca i istražiti uloge Mir-137 u želučanim stanicama raka. Pronašli smo i neke druge funkcije Mir-137 u GC, kao i neki drugi put put kojim Mir-137 igrao ulogu tumor supresor u GC tumorigenezi. pregled

materijali i postupci

Etika izjava

Sve ljudske studije su odobreni od strane odbora odgovarajuće etike i zato su provedena u skladu s etičkim standardima. Sve osobe koje su dali svoj pristanak prije njihovog uključivanja u studiju. Pregled

Pacijenti i primjerci pregled

Ljudska uzoraka raka želuca su prikupljeni od kirurških uzoraka od 100 bolesnika (muško 56, ženka 44) s GC u Cancer Institute i bolnica, Prva povezana bolnicu Sveučilišta Henan; Druga bolnica Narodne oslobodilačke vojske Kine; Hebei bolnica raka. Uzorci netumorskih iz makroskopskog tumora marginu izolirane su u isto vrijeme i koristi se kao podudarne susjednim ne-maligne tkiva. Svi uzorci su bili podijeljeni u dva dijela. Uzorci tkiva se prikupe odmah nakon toga brzinski zamrznute u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 ° C do ekstrakciju RNK. Uporaba uzoraka tkiva za sve eksperimente odobrilo je Etičko povjerenstvo Instituta osnovnih medicinskih znanosti, Kineske akademije medicinskih znanosti. Svi sudionici izrazili usmeno informirani pristanak za sudjelovanje u ovom istraživanju, a njihovi verbalni informirani pristanak su zapisane. Ovaj onsent proces također je odobren od strane etičkog odbora. Četiri želučani stanične linije raka (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 i MKN-45), sve su sačuvani u našem laboratoriju i održavane u DMEM ili 1640 u 10% FBS. Pregled

ekstrakcija RNA sinteze cDNA i real-time PCR testovi

ukupne RNA iz tkiva i stanica se ekstrahira Trizol metodi (Ambion, USA) u potpunosti slijedeći upute. Jedan lanac cDNA sintetiziran je M-MLV (Ambion, USA) korištenjem 2 ug ukupne RNA, kao predložak. Oligo (dT) 18 korišten je za mRNA reverznu transkripciju, a stabljika petlja se koristi za Mirne. Realnom vremenu PCR (RT-PCR) Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) upotrebom SYBR mix (Tiangen, Kina). PCR uvjet je bio: 95 ° C × 30s, nakon čega slijedi 40 ciklusa od 95 ° C × 5S, 60 ° C × 34s. Za mRNA, GAPDH je korišten kao kontrola normalizacijom. Za miRNAs, U6 snRNA je bio korišten za Mirne kontrole. Relativna izraz Mir-137 je izračunat metodom 2-ΔΔCT. Nizovi primera su prikazani u Tablici 1. pregled

Plazmid konstrukcija pregled

miR-137 prekursor sekvenca generira otpornosti i Mir-137-prekursora-F i miR-137-prekursor-R produženje bilo međuvremenu probavljaju BamHI i BglII, od kojih se proizvodi je umeće u BamHI-BglII fragment pcDNA-GW /EmGFP-Mir vektor (GenePharma, Kina). U međuvremenu, negativna kontrola također je izgrađena. Pregled

kultura stanica i Mirna transfekcija pregled

stanične linije HGC-27, SGC-7901 MKN-45 i GES-1 je kupljen od Cell Resource Centar Instituta za osnovne medicinske znanosti, kineske akademije medicinskih znanosti i Peking Union Medical College (Peking, Kina). Ljudske želučane stanične linije HGC-27, SGC-7901 i MKN-45 uzgajane su u RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medij, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma i ljudskog želučanog epitela stanične linije GES-1 držana je u DMEM ( Gibco, BRL, UK) mediji. Mir-137 oponašatelj i jagma oponašana koje je ne-homologna ljudskog genoma su sintetizirani GenePharma (Šangaju, Kina) i transficirana u stanicama do konačne koncentracije oligonukleotida od 10nmol /l. Sve stanične transfekcije uveo DharmaFECT1 reagensa (Dharmacon, TX, USA) prema koriste uputama proizvođača. Za svaku staničnu transfekcije provedene su dvije ili tri replikacije pokusa. Pregled

Stanična proliferacija i apoptoza test pregled

Stanična proliferacija Pokus je proveden CCK8 metodi (DOJINDO, Japan). Ukratko, oko 5000 miR-137 oponašati transfektirane stanice i stanice Scramble znatno su nasađene u ploče s 96 jažica i uzgajane. Proliferacije stope utvrđene su na 0, 12, 24, 48, 72, 96 sata nakon transfekcije dodavanjem 10 ul CCK8 regenta i ispitani u skladu s rukopisa. Apoptoze Testovi su testirani u HGC-27 i SGC-7901 staničnih linija, sa ili bez miR-137 prekomjernom ekspresijom apoptozom Detection kit I (BD Biosciences, USA) i C6 protočnom citometru (USA). Pregled

migracija stanica i Invazija testovi pregled

Izvršili smo test za liječenje rana za testiranje migracije stanica sposobnost sa ili bez mir-137 ubacivanja. Umjetni rane su proizvedeni na staničnog konfluentnom s FBS slobodne pomoću pipete 200 ul u 24 sata nakon miR-137 transfekciju. Slike su redom uzeti 0, 12, 24 i 36 sati nakon stvaranja rane. Pregled

Nakon toga obavlja transjažičnih testova za procjenu stanica, a invaziji sposobnosti. 5 × 10 ^{4 stanice su suspendirane u 200 ul medija bez FBS, postavljen na gornju komoru svake umetka sa 430μl od 1 mg /ml Matrigel (Millipore, USA). 600pl mediju s 10% FBS kao nutritivni privlačenje stavljen u donje komore. Nakon 24 sata, stanice priključeni na donju površinu komore su fiksne 20 min 20% metanola i obojene 10 minuta s 10% -tnim maygruwald-Giemsa (MGG). Invazije Membrane se zatim smanjiti i ugrađeni pod poklopcima. Računali smo stanice u 3 različite vizije poljima u stanju s 20 × Magni fi kaciju koja su potom koristi kao prosječan broj stanica. Sva ispitivanja provedena su u tri neovisna pokusa. Pregled}

pokus na životinjama pregled

Eksperimenti sa životinjama su provedeni prema Vodiču za njegu i korištenje laboratorijskih životinja i institucionalnih etičkih smjernica za pokuse na životinjama. Protokol je odobren od strane Odbora za etiku u životinjama CAM (Kineske akademije medicinskih znanosti) (broj dozvole: C72-14-0664). Sve operacije se izvode pod natrijev pentobarbitala anestezijom, a učinjeni su svi napori kako bi se smanjili patnju. Scramble transfektirane i Mir-137 Prekomjerna ekspresija HGC-27 stanice (5 × 10 ^{6 stanice) cijepljeno s.c. u dorzalni bokova BALB /c golih miševa (žensko, nu /nu, stari 6 tjedana), svi koji su kupili od životinja centra Sveučilišta Henan i odrastao u patogena stanja. Volumen tumora je izmjerena nakon 5 tjedana. Svi miševi su ubijeni i s.c. Tumori su resekcirani i težina tumora testiran. Za in vivo eksperimentima metastaza, HGC-27 stanice su sakupljene 24 sati nakon transfekcije. Pokusna vijabilnost stanica je provedeno pomoću testa XTT kit24 sata nakon transfekcije u skladu s uputama proizvođača (Roche, Tokyo, Japan). Zatim miševi (ženka, nu /nu, stari 6 tjedana) se injicira HGC-27 stanica sa ili bez miR-137 prekomjernoj ekspresiji kroz repnu venu sa 2 × 10 5 stanica u PBS-u. U HGC-27 stanice su modificirani koja stabilno mogu izraziti luciferazu (sagradio GENECHEM, Šangaju, Kina). Stanice su provjerene od strane mikroskopom kako bi bili sigurni da su ćelije bile u dobrom stanju. Nakon šest tjedana, Bioluminescencija slikanje je provedeno pomoću vrijednosti Ivis spektra i slika Radiance su normalizirane pomoću živa slika (Debljina Life Science, SAD). Pregled}

Imunohistokem pregled

Tkiva su ugrađene u parafinske rezove i liječi 2 sata na 65 ° C, a zatim deparaffinised. Prije nanošenja primarnih protutijela na 4 ° C tijekom noći, proveli smo korak pronalaženje antigen. Nakon toga, stakalca su inkubirana sa sekundarnim protutijelom oko 2 sata na 25 ° C konjugiranim na HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, Kina). Liquid DAB + podloge (zsgb-Bio, Kina) se koristi za detekciju aktivnosti HRP. Pregled

luciferaza Mirna meta reporter Test pregled

Puna duljina 3'UTR ljudskih AKT2 mRNA bile svaki PCR-om i kloniran u pMIR-REPORTTM luciferaza reporter vektor (Ambion, USA) za generiranje izvjestitelja. Mutacije predviđenih sjemenske regije u sekvenci mRNA su stvorene pomoću klica, uključujući mutiranih stranicama. HEK-293 stanice su nasađene na 24-jažične ploče (1 × 10 ^{5 stanica po komorici) dan prije transfekcije su izvedene. Stanice (~70% konfluentnosti) su transficirane sa reportera pRL-TK luciferazom (50 ng /jažici), PGL-3firefly luciferaze (10 ng /jažici) i imitirati-137 (50 nmol /L, GenePharma, Shanghai, Kina) i otimati (50 nmol /L) pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Luciferase aktivnosti mjerene su pomoću Dual luciferaze Test (Promega, USA). pregled}

Western blot pregled

Proteini su odvojeni na 10% SDS-PAGE i zatim se prenese u 0.45 um PVDF membrane (Amersham, UK). Membrane su inkubirane s 5% bezmasnim mlijekom sušena preko noći na 4 ° C s anti-AKT2 monoklonsko antitijelo (Proteintech, USA) pri 1: 1000 razrjeđenju; anti-Bad monoklonalno antitijelo (Bioworld, USA) u omjeru 1: 500 razrjeđenje; anti-GSK-3B poliklonska antitijela (Bioworld, USA), 1: 1000 razrjeđenju; anti-GAPDH antitijela (Proteintech, Chicago, USA) na 1: 30.000 razrjeđivanje. Nakon ispiranja dva puta s TBST, membrane su inkubirane s kozjim anti-zečjim antitijelom (zsgb-bio, Kina) pri 1: 5000 i 1:. 50000 razrjeđenja 2h pregled

Statistika pregled

Svaki pokus je ponovljen najmanje tri puta. Studentov t-test (dvosmjerni) i x ^{2 test je i statistički značajna na razini je postavljena na a = 0,05 dvije strane). Srednja vrijednost ± SD je prikazan na slikama. Pregled}

Rezultati

Mir-137 je dolje regulirana u želučanim stanicama raka i kliničkih uzoraka

Prvo smo istraživali ekspresiju zrele MIR -137 u 4 staničnih linija raka želuca (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 i MKN-45), te želučanog epitela stanica (GES-1). Ti GC stanične linije izložene iznimno nisku ekspresiju Mir-137 u odnosu na stanične linije GES-1 (Slika 1A). Kako bi se dodatno proučiti odnos Mir-137 sa GC pojavu, otkrio je izraz Mir-137 u 100 kliničkih pacijenata (muških 56, ženski 44, prosječne dobi 53 godina) pomoću TaqMan sonda-osušena realnom vremenu PCR kao što je gore opisano. Od 100 uzoraka GC, ekspresija Mir-137 je dolje regulirano u 77 slučajeva (77%) u usporedbi sa susjednim tkivima kada je cut off je bio postavljen kao 1.5. U međuvremenu, Mir-137 se regulira prema gore u 23 slučajeva (23%) (Slika 1B i 1C). Općenito, izraz Mir-137 u GC tkiva bila je niža nego u susjednim tkivima u statistički značajne razlike (p = 0,00079, u paru t-test, dvostruko puzajući, slika 1C). Također, utvrdili smo statistički značajnu povezanost između ekspresije Mir-137 i raka želuca kliničkoj fazi. Pacijenti koji imaju nižu razinu Mir-137 izražavanja su bili povezani s visoko kvalitetni i kasni stupanj tumora (Slika 1D). Ovi rezultati pokazuju da promjene Mir-137 može biti uključen u želučanom progresiju tumora. Pregled

Mir-137 inhibira proliferaciju stanica in vitro i in vivo pregled

transfektirane smo miR-137 ličiti na stanične linije GC HGC-27 sGC 7901, od kojih su oba pokazala veliku učinkovitost transfekcije (Slika 2). Rezultati pokusa rasta CCK8 na 0, 1, 2, 3 i 4 dana nakon MIR-137 i otimati transfekcije su prikazani na slici 2B. U usporedbi s otimati transfekcije, Mir-137 transfekcija značajno smanjilo širenje obje stanične linije (slika 2b). Onda smo istražili učinak Mir-137 na staničnoj apoptozi. Rani apoptotične stanice u otimati skupine u HGC-27 i 2,9% u SGC-7901 bio je oko 10%, a nakon Mir-137 transfekcije, postotak ranog apoptotičnih stanica je povećan na 17,5% u HGC-27 i 8,3% u SGC-7901, što je značajno je pokazao razliku (Slika 2C). Iz ovih rezultata može se zaključiti da je Mir-137 mogao potisnuti preživljavanje stanica raka pluća pomoću poticanja ranog apoptozu. Pregled

Kako bi dodatno potvrdili ranije nalaze, in vivo je model. Otkrili smo da je rast tumora bio je znatno sporiji u Mir-137 Prekomjerna ekspresija miševa nego u kontrolnoj skupini (Slika 2D, 2E i 2G). U dogovoru s krivuljom rasta tumora, težine tumora izazvanih otimati stanica bila je značajno viša od one koju Mir-137 ekspresijom (Sl 2F). Ti rezultati nadalje potvrđeno da miR-137 prekomjerna ekspresija može ograničiti želučani proliferaciju stanica raka in vivo. Pregled

Mir-137 inhibira migraciju i invaziju in vitro i in vivo

dalje procjenjuje učinke Mir-137 na migraciju stanica i invazije, što su bili ključni odrednice malignih napredovanja i metastaze. Učinci Mir-137 na stanične migracije su pokazali testu zacjeljivanje rana /ogrebotine na HGC-27 i SGC-7901 stanica. Oba dvije stanične linije liječenih Mir-137 imitira su izrazito manje selica nego otimati kontroli ili netretiranih stanica na 12, 24 i 36 sati nakon grebanje (3A). Osim toga, proveli smo invaziju stanica testa za mjerenje smjera invazije sposobnosti stanica nakon Mir-137 prekomjernom ekspresijom. Kao rezultat, invazivnost stanica transficiranih miR-137 ličiti značajno smanjen u usporedbi s meteža stanicama HGC-27 i SGC-7901 (slika 3B). Zatim, u vivo eksperimenti su primjenjena na dalje potvrditi taj rezultat. Se prvo pokazali da stanice transfecirane miR-137 imitira ili imitira kontrole nisu pokazale značajno smanjenje stanične vijabilnosti u odnosu na netretirane stanice. Također, ne postoji razlika u vijabilnost među stanicama koje su transfektirane s MIR-137 imitira usporedbi s negativnom kontrolom (S2 sl). Kao što je prikazano na slici 3c bioluminiscentni slike miševa u miR-137 nadekspresijom skupine, pokazali su mnogo manju sliku. Isto tako, broj metastaza pluća po miševa u Mir-137 skupine pokazala znatno nižu razinu u odnosu na otimati skupini koja je pokazala da je Mir-137 mogao potisnuti metastaza in vivo. Ovi rezultati pokazuju da je Mir-137 je odigrao važnu ulogu u regulaciji stanične migracije i invazivnosti u rak želuca i predložio da se dolje regulacija Mir-137 može doprinijeti tumorskih metastaza u želučanom karcinogeneze. Pregled

Mir-137 cilja AKT2 u GC Netlogu

MiRNAs obavlja bioloških funkcija kroz negativno reguliraju svoje ciljne gene. Kao što je predvidio, bilo je komplementarnost između mora-MIR-137 i AKT2 3'-UTR (slika 4a). Pregled

Kako bi testirali hipotezu da AKT2 bi mogla biti meta Mir-137, reporter plazmid divlje -tipa 3'-UTR područja AKT2 nizvodno od luciferaze kodirajuće regije (Slika 4A, AKT2_WT) konstruiran. HEK-293T stanice su transfektirano s reporter plazmid (AKT2_WT) i otimati. Kao rezultat toga, miR-137 transfektirane stanice pokazale su značajno smanjenje (≈58%) aktivnosti luciferaze (Slika 4B). Zatim, isti test je izveden za još jedan reporter plazmida koji sadrži mutirani AKT2 3'-UTR u vezna mjesta Mir-137. Kao što se očekivalo, inhibicija aktivnosti luciferaze od Mir-137 je djelomično uklonjena sa vezanja 1 ili vezni navode dva mutanta i gotovo ukinuta u AKT2_MUT dvostrukom mutantu, što sugerira da je konzervirana regija je u potpunosti odgovoran za Mir-137 funkcije (Slika 4B) . pregled

Kako bi se dodatno istražiti interakciju između Mir-137 i AKT2, HGC-27 i SGC-7901 stanice su transficirane s MIR-137. Ekspresija mRNA AKT2 je određena u realnom vremenu PCR. Nema značajne razlike između tretiranih miR-137 i jagma-obrađenih ili neobrađenih HGC-27 i SGC-7901 stanica (Slika 4C). Zatim, Western blot analiza provedena je za mjerenje razine AKT2 proteina. Otkrili smo da je izraz AKT2 proteina dolje je regulirano Mir-137 liječenih HGC-27 i SGC-7901 stanica, ali ne i otimati ili netretiranih stanica (Slika 4D). Ovi podaci ukazuju na to da Mir-137 izravno priznaje 3'-UTR AKT2 mRNA i inhibira AKT2 prijevod. Dakle, lijepo uređeno Mir-137 kod raka želuca inhibira suzbijanje AKT2, što zauzvrat usporiti tumorigenezi. Pregled

AKT2 je član obitelji AKT. Nadalje otkriti svoje silaznih efektora Bad i GSK-B. Kao rezultat toga, p-Bad i p-GSK-B je očito dolje regulirana u MIR-137 tretira HGC-27 i SGC-7901 stanica u usporedbi s otimati obrađen ili netretirane stanice. Nema značajne promjene pronađen je u ne-fosforilirani loše ili GSK (Slika 4E). Ovi rezultati sugeriraju da je ubrzani rast rak želuca stanica bila je djelomično zbog prekomjernog actived Akt puteva. Osim promicanja proliferaciju stanica, actived Akt mogao fosforiliraju loše na Ser112 i Ser136, blokiranje Bad izazvanu smrt stanice. U nedostatku fosforilacije na tim mjestima, Bad se misli da interagira s Bcl-XL da se izazove smrt stanica. Za razliku od toga, Akt posredovane hiperfosforilaciju lošeg može promovirati preživljavanje stanica u stanice raka. Naši zapadni hibridizacije rezultati potvrđuju gore nagađanja da je promjena želučane aktivnosti stanica raka u stanju Mir-137-inficiranim stanicama može biti rezultat smanjenja fosforilacije lošeg. Nadalje, analizirali smo razine proteina u AKT2 u 12 GC patientsin kojih Mir-137 je dolje propisane. Među tim uzorcima, AKT2 bio regulira prema gore in9patientsin svojim GC tkiva (Slika 4f). Pregled

Obnova AKT2 čelu s aktivacijom invazije i suzbijanje apoptoze Netlogu

Kako bi se dodatno pokazati uloge Mir-137 i AKT2 igrao u nastanku tumora, istražili smo učinak obnove AKT2 u Mir-137 inficiranim stanicama. Western blot je pokazala da je razina AKT2 proteina u AKT2 nadekspresijom uzorku je očito veći nego u negativnom kontrolom čak iu suzbijanju Mir-137. Obnova AKT2 čelu s aktivacijom invazije i suzbijanje apoptoze (Slika 5). Pregled

Rasprava pregled

miRNAs Često su naznačeno da se često dereguliran u različitim humanih karcinoma, a neki miRNAs ima čak se koristi zaposlen kao terapijske mete raka. Istraživanja se odnose na odnos između miRNAs i raka može nam pomoći u razumijevanju raka. Pregled

Postoji samo nekoliko istraživanja koji se odnose na ulogu Mir-137 je igrao u raka želuca. Ona je izvijestila da je Mir-137 je negativan regulator Cdc42 i ciljajući koji inducira apoptozu i staničnog ciklusa G1 uhićenja u želučanih stanica raka [17]. Međutim, regulacija učinak mikrornk u rak je dosta komplicirano. Čini se nemogućim da je Mir-137 regulira raka želuca od strane jednog puta. U ovom istraživanju, funkciju i mehanizam koji Mir-137 uređenog raka želuca je dodatno istražiti. Pregled

Kao prvo, otkrili smo ekspresiju Mir-137 u 100 pacijenata i otkrili da je izraz Mir-137 je znatno dolje -regulated u uzorku raka. Također, utvrdili smo statistički značajnu povezanost između ekspresije Mir-137 i raka želuca kliničkoj fazi. Ovi rezultati pokazuju da promjene Mir-137 bi mogao biti uključen u želučanog raka progresije. Mi smo pokušali pronaći vezu između Mir-137 i pacijenti 'dob i spol, ali ne i statistički rezultat pronađen. Kao što je ova studija pokazala je da je izraz Mir-137 je dolje regulirana u većini GC tkiva u usporedbi sa susjednim tkivima (77%), mogli bismo razmisliti o dijagnozi i prognostički korištenje MIR-137. Nadalje valjanosti u budućim studijama je to opravdano i više dostupni uzorci izvora, kao što su Mir-137-obogaćenih s tumorom izvedeni exosomes iz krvi, treba istražiti. Isto tako, treba primijetiti da u određenoj mjeri odrezani vrijednost (cut off = 1,5) izabrali smo mogli biti još uvijek proizvoljne. Kada je postavljena više, bit će manje pacijenata s MIR-137 se regulirati u tkivu raka. Međutim, čak iu tom stanju, bilo je oko 23% od raka imaju visok Mir-137 izraza. To može biti zbog individualnog razlike među pacijentima da su neki pojedinci mogu imati različite ekspresije gena uzorak tijekom tumorigenezi ili raka progresije. Pregled

Kao izražavanje Mir-137 u GC tkiva bila je niža nego u susjednim tkivima u statistički značajne razlike (p = 0,00079), možemo nagađati da je to izraz karakterističan je povezan s razvojem raka. To nagađanja potvrđena je u in vitro i in vivo da miR-137 može negativno regulira proliferaciju stanica, migraciju i invaziju. Razina ekspresije Mir-137 može zadržati na visokoj razini tijekom dugog razdoblja nakon transfekcije, kako u želučanom staničnim linijama karcinoma, krajnji stupanj stranog tijela tumora i inmetastatic lokaciji u plućima (S1A Sl-S1C sl). Međutim, ova metoda prekomjerna ekspresija dovodi do vrlo visokih razina ekspresije Mir-137 (Slika 2). Ova visoka razina Mir-137 mogu uzrokovati dodatne efekte. Na primjer, Mir-137 je negativan regulator Cdc42 i ciljanje koje inducira apoptozu i staničnog ciklusa G1 uhićenja u želučanih stanica raka [17]. Kao što je Mir-137 u našem istraživanju je upregulated tisuće puta, to može dovesti do inhibicije drugih ciljeva, kao što su Cdc42. Očito, u ovom istraživanju ne možemo isključiti mogućnost da je tumor supresorski učinci Mir-137 je posredovana suzbijanju drugih ciljnih gena. Pregled

Nakon toga, otkrili smo da Mir-137 djeluje kao supresor gena tumora kroz AKT2 ciljanje koja je član obitelji AKT. Obnova AKT2 uzrokuje povećanje regulacije AKT2 u Mir-137 inficiranim stanicama, što je znatno veći nego u meteža. To može biti uzrokovano da AKT2 prekomjerna ekspresija preinačio udio proteina Mir-137 potisnuta. Što je još važnije, obnova AKT2 regulira apoptozu i invaziju želučanih stanica raka, što dovodi do aktivacije invazije i suzbijanje apoptoze (Slika 5). Ovaj spašavanja eksperiment pruža dodatne dokaze da je Mir-137 Aktivni apoptoze stanica i negativno reguliraju staničnu invaziju ciljajući AKT2. In vivo eksperimenti također pokazala da je Mir-137 je izraz negativan u odnosu na izrazu AKT2 (S1D sl i S1E sl). AKT je ključni faktor PI3K /AKT put koji način. Na dolje regulacija AKT2 dodatno utječe na njegov nizvodno proteina Bad i GSK-3B, da je p-Bad i p-GSK-B je očito dolje regulirano. Loše mogu igrati svoje "uloge koju fosforilacije i dalje regulira staničnu sudbinu [18]. GSK-3B, koji je također poznat kao GSK-3β obično kontrolira stanični imigracije i invaziju. U zaključku, identificirali smo vezu između Mir-137 i AKT2 da je roman sastavni dio želučane nastanku tumora raka. Mir-137 je pokazao da se odnose na reguliranje AKT2 [19]. U hepatocelularnog karcinoma, Mir-137 inhibira rast stanica raka i metastaza putem AKT2 izravno ciljanje [20]. U stvari, mi e su prikazani 8 gene kao potencijalne mete Mir-137 (S1 tablicu). Međutim, AKT2 je jedina izravna meta Mir-137 nakon testa dual reporterskog gena i Western blot istrage. Iz Sl 4D možemo naći thatmiR-137 može utjecati na Akt2 i p-AKT2in oba HGC-27 i SGC-7901 stanica. No, zanimljivo, u SGC-7901 status fosforilacija je očito pod utjecajem više. Ova pojava može se dosljedno pratiti u tri ponovljene mrlje smo obavili. oduzeli smo da bi moglo biti s obzirom na posebnu imovinu različitih stanica raka. Tu bi moglo biti posebna uredba Put način Mir-137 u SGC-7901 koji je potisnut status fosforilaciju AKT2.However iz ovog istraživanja, ne može u potpunosti objasniti taj mehanizam. Kada smo odabrali pacijentima koji imaju nisku ekspresiju Mir-137 u svom GC tkiva za detekciju ekspresije AKT2 proteina, našli smo većina tih bolesnika (9/12) imaju visoku razinu AKT2 u svom GC tkiva. Ovaj rezultat sugerira da je Mir-137 može ciljati AKT2 kod pacijenata. Tu su i tri pacijenta koji imaju nisku ekspresiju AKT2 u GC tkiva, iako je izraz Mir-137 je niska. Ovaj rezultat može s obzirom na individualne razlike među pacijentima. Pregled

Na kraju, naš izraz i funkcionalne studije tvrde da je Mir-137 je često dolje regulirano raka želuca može djelovati kao supresor tumora u GC stanicama, ponovnog uvođenja ekspresija u GC stanicama potisnut rak želuca proliferaciju stanica, migraciju i invaziju, izravno ciljanje AKT2. Dakle, naša djela je dobar dodatak na prethodni rad i korisno za nas razumjeti mehanizam Mir-137 regulacije u rak. Pregled

popratne podatke
S1 Sl. Mir-137 i izraz AKT2 nakon ubacivanja.
A. Izraz Mir-137 u HGC-27 stanica i SGC-7901 stanica 72 h nakon infekcije. Izraz B. Mir-137 u end-stage ksenografta tumora. Izraz C. Mir-137 u metastatskog lokalizaciju miševa pluća. Izraz D. AKT2 u metastatskog lokalizaciju miševa pluća. mješoviti smo pet pluća zajedno u istoj skupini. Izraz E. AKT2 u metastatskog lokalizaciju miševa pluća. Otkrili smo ekspresiju AKT2 proteina u svakom mišu respektivno. 30 ug ukupnog proteina korišten je za svaki uzorak pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s001 pregled (TIF) pregled S2 Sl. Sposobnost stanica za život proba prije metastaza eksperimenta pregled stanica održivost je analiza provedena 24 sata nakon transfekcije pregled doi:.. 10,1371 /journal.pone.0130124.s002 pregled (TIF) pregled S3 Sl. Adensitometric analiza Sl 4E pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s003 pregled (TIF) pregled S1 stol. . potencijalna meta geni Mir-137
The potencijalne ciljne gene Mir-137 su predvidjeli on line softver i otkriven dual Luciferaze reporter gena i zapadne upijajući pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124. S004 pregled (docx) pregled

priznanja

autori zahvaljuju dr Chengyuan Feng od raka bolnice, kineske akademije medicinskih znanosti za tehničku pomoć i članak revizije. pregled