Plos ONE: MicroRNA-137 Prispeva k zavirala tumorigeneze v humani želodca raka, ki ga ciljanje Akt2

Povzetek

MiRNAs igrajo pomembno vlogo pri tumorigeneze. Ta raziskava se je osredotočila na raziskovanje mehanizma učinkov in ureditev miRNA-137 na bioloških vedenj raka želodca. Celotno RNA je bila vzeta iz tkiv 100 bolnikov z rakom želodca in iz štirih želodčnega raka celičnih linij. Izraz miR-137 je bila odkrita s PCR v realnem času od 100 bolnikov. Učinki miR-137 prekomerno na orožja, apoptoze, migracije in invazije sposobnost želodca rakave celice "so raziskovali in vitro in in vivo. Ciljni gen miR-137 je napovedoval Targetscan na programsko opremo linije, pregleda z dvojno luciferazni reporter genski test in dokazali z western blot. Kot rezultat, je bil izraz miR-137 pomembno zmanjša rak celični liniji želodca HGC-27, HGC-803, SGC-7901 in MKN-45, kakor tudi v želodčnih rakavih tkivih v primerjavi z ges-1 celice ali se ujema sosednji non -neoplastic tkiva ( p
< 0,001). Ponovna uvedba miR-137 v želodcu rakavih celic je lahko zavirajo proliferacije celic, migracije in invazijo. In vivo eksperimenti pokazali, da lahko miR-137 prekomerno zmanjša želodčne proliferacijo rakavih celic in metastaz. Bioinformatika in western blot analiza je pokazala, da je miR-137 je deloval kot zaviralnih vlog na želodcu rakavih celic s ciljanjem Akt2 in je dodatno vplivalo na Bad in GSK-3P. Skratka, miR-137, ki je pogosto navzdol urejeno z rakom želodca je lahko vključena v želodčni tumorigeneze raka in metastaz z ureditvijo v zvezi Akt2 poti signalne

Navedba. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S Zhu Y, Yang W, et al. (2015) MicroRNA-137 Prispeva k zavirala tumorigeneze v humani Rak želodca z usmerjanjem Akt2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10,1371 /journal.pone.0130124

Akademska urednika: Irina V. Lebedeva, Columbia University, UNITED STATES

Prejeto: 15. avgust 2014; Sprejeto: 18. maj 2015; Objavljeno: 23. junij 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

financiranje:.. To delo je podprl Medical znanstvenih in tehnoloških raziskovalnih projektov provinci Henan, Kitajska (2011030004)

Konkurenčni interesi: avtorji imajo izjavil, da ne obstajajo konkurenčni interesi.

Uvod

rak želodca (GC) je drugi pogost vzrok smrti zaradi raka v svetu [1]. Do zdaj je bil mehanizem želodca rakotvornosti je v veliki meri neznan. Raziskovalci so poskušali študirati GC z vidika biokemije in molekularne biologije, da so bili nekateri zaviralnih genov in s tem povezane s tumorjem geni so poročali v GC. MicroRNAs (miRNAs) so endogeno majhne RNA nekodiranih za 18 ~ 22 nukleotidov, ki so bile opredeljene kot posttranscriptional regulatorji izražanja genov [2, 3]. MiRNAs igrajo ključne vloge v veliko bioloških procesih, kot so širjenje, razvoj, diferenciacijo in apoptozo. Medtem so bili miRNAs potrjena, da deluje kot onkogeni ali zaviralnih genov med tumorigeneze. Na primer, miR-31 opredeljen kot onkogen v požiralniku karcinoma skvamoznih celic [4] in miR-451 deluje kot supresorski tumorjem pri človeku nedrobnoceličnim pljučnim rakom [5]. Obstajajo tudi so bile povezane z rakom želodca dogaja in razvoj [6-13] veliko microRNAs. Ugotovljeno je bilo tudi, da je prekomerno izražanje miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34a in miR-423-5p se lahko uporabljajo kot diagnostični kriteriji raka želodca [14] .Zato miRNAs so potencialni kandidati novih diagnostičnih biomarkerjev ali terapevtskih ciljev raka želodca.

MicroRNA-137 (miR-137) so poročali, da je navzdol regulirano in igrajo vlogo kot supresorski tumorjev pri raku debelega črevesa in rakom ustne votline [15, 16]. Vendar funkcijo miR-137 in njegovega mehanizma osnovnega želodca karcinogenezo še vedno ni jasno. Chen et al pokazala, da miR-137 se lahko igra kot zaviralnih po ciljnih CDC42 urediti celic cikel rakom želodca [17]. Kljub temu, da je jasno, da nam da microRNA uravnava biološke vedenje po večkratnem tako pot, da bi bilo bolj ureditev mehanizem miR-137 proti GC tumorigeneze. V tej študiji smo izmerili izražanje miR-137 pri 100 bolnikih z rakom želodca in raziskovali vloge miR-137 v želodčnih rakavih celic. Našli smo nekaj drugih funkcij miR-137 v GC, kakor tudi drugo pot pot po kateri miR-137 igral vlogo zaviralnih v GC tumorigeneze.

Materiali in metode

izjava Etika

Vsi ljudje študije je odobril odbor ustrezne etike in so bile zato izvedene v skladu z etičnimi standardi. Vse osebe, ki je dal svoje informirano privolitev pred njihovo vključitvijo v študijo.

Bolniki in osebki

Človekove želodca vzorcev raka bili zbrani od kirurške vzorcev od 100 bolnikov (moški 56, ženske 44), z GC na Cancer Institute in bolnišnica, prva pridružena bolnišnica Henan univerze; Drugi Hospital Ljudske osvobodilne armade na Kitajskem; Bolnišnica Hebei Rak. Non-tumor vzorci iz makroskopski robu tumorja smo izolirali ob istem času in se uporablja kot izravnanih sosednjih non-neoplastičnih tkiv. Vsi vzorci so bili razdeljeni v dva dela. Vzorce tkiva zberemo takoj hitro zmrznili v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C, dokler ekstrakcijo RNA. Uporaba vzorcev tkiv za vse poskuse je odobril etičnega sveta Inštituta za osnovne medicinske vede, kitajske akademije medicinskih znanosti. Vsi udeleženci pod svojo ustno privolitev za sodelovanje v tej študiji, in njihove verbalne obveščeni soglasij so zapisali. Ta onsent postopek je odobril tudi etičnega krovu. Štiri želodca rakave celične linije (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 in MKN-45), so bili vsi ohranjena v našem laboratoriju in vzdržujejo v DMEM ali 1640 z 10% FBS.

ekstrakcijo RNA, sinteza cDNA in PCR v realnem času

Total RNA iz tkiva in celice so pridobljeni z metodo TRIzola (Ambion, ZDA) popolnoma v skladu z navodili. cDNA enovlakenske sintetiziramo z M-MLV (Ambion, ZDA) z uporabo 2 ug celotne RNA kot šablono. Oligo (dT) 18 smo uporabili za mRNA reverzno transkripcijo medtem izvornih zanko uporablja za miRNA. Realnem času PCR (RT-PCR) smo izvedli z Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, ZDA) z uporabo SYBR mešanice (Tiangen, Kitajska). Pogoj PCR je bil: 95 ° C × 30s, ki mu sledi 40 ciklov 95 ° C × 5s, 60 ° C × 34s. Za mRNA smo GAPDH uporabimo kot normalizirana kontrolo. Za miRNAs je U6 snRNA uporablja za nadzor miRNA. Relativna izraz miR-137 je bila izračunana z metodo 2-ΔΔCT. Primer sekvence so prikazane v tabeli 1.

plazmida visoka

miR-137 prekurzor zaporedje ustvari žarjenje in miR-137-prekurzor-F in podaljšanje miR-137-prekurzor-R je medtem prebavi BamHI in BglII, proizvodi od tega vstavi v BamHI-BglII fragment pcDNA-GW /EmGFP-miR vektorja (GenePharma, Kitajska). V tem času je bila zgrajena tudi negativno kontrolo.

celične kulture in miRNA transfekciji

celične linije HGC-27, SGC-7901 MKN-45 in GES-1 je bila kupljena iz mobilni viri center inštituta osnovnih medicinskih znanosti, kitajske akademije medicinskih znanosti in Peking Union Medical College (Peking, Kitajska). Človeški želodca celične linije HGC-27, SGC-7901 in MKN-45 smo kultivirali v RPMI 1640 (Gibco, BRL, Velika Britanija), mediji dopolnjene z 10% fetalnega govejega seruma in želodčnega epitela celične linije humanega GES-1 je hranjen v DMEM ( Gibco, BRL, UK) mediji. MIR-137 posnemajo in pehanje posnema ki niso homologna človeškega genoma smo sintetizirali z GenePharma (Šanghaj, Kitajska) in transfektirali v celice do končne koncentracije oligonukleotida 10nmol /L. Vse celic Transfekcije uvedla DharmaFECT1 Reagent (Dharmacon, TX, ZDA) glede na uporabljene navodili proizvajalca. Za vsako celico transfekciji smo izvedli dve ali tri podvajanja poskusov.

Cell proliferacijo in apoptozo test

Cell širjenje test je bil izveden s CCK8 metodi (DOJINDO, Japonska). Na kratko, so okoli 5000 miR-137 posnemati transficirane celice in Utrka celice vsakokrat zasejali v 96-vdolbinami in kultiviramo. cene orožja so bili določeni na 0, 12, 24, 48, 72, 96 ur po transfekciji z dodajanjem 10 u.l CCK8 regent in preizkušeno v skladu s rokopisov. Apoptozo testi so bili testirani v HGC-27 in SGC-7901 celičnih linij z ali brez miR-137 prekomerno ga Apoptoza Detection kit I (BD Biosciences, ZDA) in C6 pretočnim citometrom (ZDA).

Cell migracije in invasion testi

smo izvedli na celjenje rane test za testiranje migracije celic možnost z ali brez miR-137 transfekciji. Umetna rane so bili proizvedeni na celični enoplastni zlit z FBS prostem, z uporabo 200 ul vrh pipete na 24 ur po miR-137 transfekciji. Slike so bile sicer sprejete na 0, 12, 24 in 36 ur po ustvarjanju rane.

smo nato izvedli transwell teste za oceno invazijo sposobnost celic. 5 × 10 ^{4 celice, suspendirane v 200 ul mediju brez FBS so bili dani na zgornji komori vsak vložek z 430μl 1 mg /ml Matrigel (Millipore, ZDA). 600μl medij z 10% FBS kot prehranske atraktant bila dana v spodnji komori. Po 24 urah celice pritrjeni na spodnjo površino komore bili fi xed 20 min z 20% metanola in obarvamo 10 minut z 10% maygruwald-Giemsa (MGG). Invazija membrane so nato posekali in vgrajeni pod lažnimi zdrsi. Mi šteje celice v 3 različnih vizija fi elds v stanju z 20 × Magni fi kacije, ki so bile nato uporabljene kot povprečno število celic. Vse teste smo izvedli v treh neodvisnih poskusih.}

eksperiment Animal

Preizkusi vključujejo živali so bile izvedene v skladu z navodili za nego in laboratorijskih živalih in institucionalnih etičnih smernic za poskuse na živalih. Protokol je odobril Odbor za etiko o poskusih na živalih v živo (kitajske akademije medicinskih znanosti) (številka dovoljenja: C72-14-0664). Vse operacija je bila izvedena v skladu z natrijevim pentobarbital anesteziji, in si je prizadevala za zmanjšanje trpljenja. Scramble-transfekcije in miR-137 Čezmerno HGC-27 celice (5 × 10 ^{6 celic) smo cepili s.c. v hrbtnih boki BALB /c golih miši (ženske, Nu /Nu, stari 6 tednov), ki so bile kupljene od centra živali Henan univerze in odraščal v pogojih brez patogenov. Volumen tumorja smo izmerili 5 tednov. Vse miši je bilo ubitih in s.c. tumorjev smo resekcija je testirana teža tumorjev. Za in vivo metastazami poskusih smo HGC-27 celice zberemo 24 ur po transfekciji. viabilnost celic testu je bila izvedena z uporabo xtt test kit24 uro po transfekciji v skladu z navodili proizvajalca (Roche, Tokio, Japonska). Potem miši (moški, Nu /Nu, stari 6 tednov) so vbrizgali HGC-27 celic z ali brez miR-137 prekomerno skozi repno veno z 2 × 10 5 celic v PBS. Celice HGC-27 so bili spremenjeni, ki lahko trajno izraziti luciferazo (s GENECHEM, Šanghaj, Kitajska zgrajena). Celice smo preverili z mikroskopom zagotoviti, da so bile celice v dobrem stanju. Po šestih tednih so Bioluminiscenca slikanje izvaja z uporabo vrednosti an IVIS spektra in slike Radiance so normalizirani z uporabo Dnevna sliko (Caliper bioloških znanosti, ZDA).}

Imunohistokemija

Robčki so bili vgrajeni v parafin oddelkov in obdelan 2 uri pri 65 ° C in nato deparaffinised. Pred uporabo primarnih protiteles pri 4 ° C čez noč, smo izvedli korak nalaganja antigen. Po tem smo drsi inkubirali s sekundarno protitelo približno 2 uri pri 25 ° C, konjugiran HO (1: 100; Zhongshanjinqiao, Kitajska). Liquid DAB + Substrat (zsgb-bio, Kitajska), je bila uporabljena za odkrivanje dejavnosti HRP.

luciferaza miRNA tarča novinar test

Celotna dolžina 3'UTRs človekovih Akt2 mRNA bilo vsak PCR pomnožili in klonirali v pMIR-REPORTTM luciferaza Reporter Vector (Ambion, ZDA), da ustvarjajo novinarji. Mutacije napovedanih semenskega regij v sekvencah mRNA bila ustvarjena s pomočjo začetnih oligonukleotidov, vključno z mutirani straneh. HEK-293T celično smo zasejali v 24-vdolbinami (1 x 10 ^{5 celic na vdolbino) na dan pred bile izvedene transfekcije. Celice (~70% Strnjena) so transfekciji s PRL-TK luciferaza novinarji (50 ng /dobro), PGL-3firefly luciferaza (10 ng /dobro), in posnemajo-137 (50 nmol /L, GenePharma, Šanghaj, Kitajska), ali scramble (50 nmol /L) z Lipofectamine 2000 dejavnosti (Invitrogen) .Luciferase so bile izmerjene z uporabo Dual luciferaza Reporter testom (Promega, ZDA).}

Western blot

Proteine ​​smo ločili na 10% SDS-PAGE in nato prenese na 0,45 um PVDF membrane (Amersham, UK). Membrane inkubiramo pri 5% nemastnega mleka sušimo preko noči pri 4 ° C in z anti-Akt2 monoklonskega protitelesa (Proteintech, USA) na 1: 1000 razredčitvijo; anti-Bad monoklonsko protitelo (Bioworld, ZDA) v razmerju 1: 500 razredčenje; anti-GSK-3B poliklonsko protitelo (Bioworld, USA) na 1: 1000 razredčitvijo; anti-GAPDH protitelesa (Proteintech, Chicago, ZDA) 1: 30.000 za redčenje. Po dvakratnem spiranju s TBST, smo membrane inkubirali z kozji anti-rabbit protitelesa (zsgb-bio, Kitajska) na 1: 5000 in 1:. 50000 razredčitev 2 uri

Statistika

Vsak poskus smo ponovili vsaj trikrat. Test Študentska t (dva repa) in 2 preizkus x ^{so bile izvedene, in statistično pomembna stopnja je bila določena pri a = 0,05 dve stranski). Povprečje ± se SD prikazan na slikah.}

Rezultati

MIR-137 je navzdol urejeni v želodčnih rakavih celic in kliničnih vzorcev

Najprej smo preučeni izraz zrelega miR -137 v 4 človeške želodčne raka celičnih linijah (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 in podjetja MKN-45) in želodčnih epitelijskih celic (GES-1). Te GC celične linije razstavljena izredno nizko izražanje miR-137 v primerjavi s celično linijo GES-1 (slika 1A). Da bi še dodatno preučiti odnos miR-137 z GC nastanka, smo zaznali izražanje miR-137 100 kliničnih bolnikih (moški 56, ženske 44, povprečna starost 53 let), ki jih TaqMan sondo drived PCR v realnem času, kot je opisano zgoraj. Od 100 GC vzorcev, izraz miR-137 je navzdol urejena v 77 primerih (77%) v primerjavi s sosednjimi tkivi, ko je bil cut off ustanovljena kot 1,5. Medtem, miR-137 je bil up-urejena v 23 primerih (23%) (slika 1B in 1C). Na splošno je izraz miR-137 v GC tkivih nižja od tiste v sosednjih tkivih statistično pomembne razlike (p = 0,00079, paru t-test, dva repa, slika 1C). Prav tako smo ugotovili statistično pomembno povezavo med izražanjem miR-137 in raka želodca klinični fazi. Bolniki, ki imajo nižje ravni miR-137 izražanja so bila povezana z visoko kvalitetnega in pozni fazi tumorjev (slika 1D). Ti rezultati so pokazali, da lahko spremembe v miR-137 vpleten v želodčnem napredovanje raka.

MIR-137 inhibira proliferacijo celice in vitro, in vivo

transfektirana smo miR-137 posnemajo v celičnih linijah GC HGC-27 in GSS-7901, ki sta pokazala odlično učinkovitost transfekcije (slika 2A). Rezultati testov rasti CCK8 na 0, 1, 2, 3 in 4 d po miR-137 in žoga transfekcijo so prikazani na sliki 2B. V primerjavi s žoga transfekciji miR-137 transfekciji znatno zmanjša širjenje obeh celičnih linij (slika 2b). Nato smo raziskovali vpliv miR-137 na celične apoptoze. Zgodnje apoptotske celice v skupini, žoga je bila okoli 10% v HGC-27 in 2,9% v SGC-7901, ker je po miR-137 transfekciji je odstotek zgodnjih apoptotskih celic v HGC-27 povečala na 17,5% in 8,3% v SGC-7901, kar bistveno pokazala razliko (slika 2C). Iz teh rezultatov je mogoče sklepati, da bi miR-137 zatreti preživetja pljučnega raka celic, tako da spodbujajo zgodnje apoptoze.

Da bi še dodatno preveriti ugotovitve zgoraj, in vivo model je bil zgrajen. Ugotovili smo, da je bila rast tumorja v čezmerni miših miR-137 bistveno počasneje kot v kontrolni skupini (slika 2D, 2E in 2G). V dogovoru s krivuljo rasti tumorja, so uteži tumorjev, ki ga žoga celice induciranih bistveno višja od tiste, ki jo miR-137 prekomerno (slika 2F). Ti rezultati še dodatno potrdili, da bi miR-137 prekomerno omeji širjenje želodčni rak celic in vivo.

MIR-137 zavira migracijo celic in invazijo in vitro in in vivo

dodatno ocenjeni vplivi miR-137 o migracijah in invazijo celic, ki so bili ključni dejavniki malignega napredovanja in metastaz. Učinki miR-137 na celični migraciji so pokazala celjenje ran /praske testu v HGC-27 in SGC-7901 celic. Oba dveh celičnih linij, ki so se zdravili z miR-137 posnemajo so izrazito manj migracijski kot žoga nadzora ali neobdelanih celic na 12, 24 in 36 ur po praskanju (slika 3A). Poleg tega smo izvedli celica invazijo test za merjenje smernih invazijo sposobnosti celic po miR-137 prekomerno. Kot rezultat, invazivnost celic transficiranih z miR-137 posnemajo je dramatično zmanjšalo v primerjavi s žoga celic v HGC-27 in SGC-7901 (slika 3B). Nato so bili zaposleni in vivo poskusi na ta rezultat še dodatno preveriti. Smo najprej pokazali, da celice transficirane z miR-137 posnemajo ali posnemajo nadzor ni pokazal znatno zmanjšanje sposobnosti preživetja celic v primerjavi z nezdravljenimi celicami. Prav tako ni nobene razlike v preživetja celic med celic, transfektiranih z miR-137 posnemajo v primerjavi z negativno kontrolo (S2 Sl). Kot je prikazano na sliki 3C je bioluminescentno slikanje miši v čezmerni skupini miR-137 je pokazala mnogo manjšo sliko. Tudi število pljučne metastaze na miši v skupini miR-137 pokazale bistveno nižjo stopnjo v primerjavi s žoga skupino, ki je pokazala, da bi miR-137 zatiranje metastaze in vivo. Ti rezultati pokazali, da miR-137 igral pomembno vlogo pri urejanju migracije celic in invazivnost pri raku želodca in predlagal, da bi lahko navzdol ureditev miR-137 prispevajo k tumorske metastaze želodčnega rakotvornost.

miR-137 je namenjen Akt2 v GC

MiRNAs izvaja bioloških funkcij z negativno urejanje svojih ciljnih genov. Kot je napovedal, se je dopolnjevanje med ima-miR-137 in Akt2 3'-UTR (slika 4A).

Za testiranje hipoteze, da bi lahko Akt2 cilj miR-137, novinar plazmid zatočišča za divje -Type 3'-UTR regija Akt2 nižje od luciferazno kodirni regiji (slika 4A, AKT2_WT) je bil zgrajen. HEK-293T celice kotransfektiramo z reporter plazmida (AKT2_WT) in žoga. Kot rezultat, miR-137 transficirane celice so pokazali izrazito znižanje (≈58%) od luciferazne aktivnosti (slika 4B). Nato je bil isti test izvedemo drug reporterski plazmida, ki vsebuje mutirano Akt2 3'-UTR v miR-137 vezavnih mest. Kot je bilo pričakovati, je bilo zaviranje luciferazne aktivnosti, ki jih miR-137 delno odstranimo z vezno mesto 1 ali vezavo citirati 2 mutant in skoraj odpravljena v AKT2_MUT dvojni mutant, kar kaže, da je bila ohranjena regija v celoti odgovorna za miR-137 funkcijo (slika 4B) .

Da bi še dodatno raziskati interakcijo med miR-137 in Akt2, HGC-27 in SGC-7901 celice so transfekcirajo s miR-137. Akt2 mRNA izražanja smo določili z PCR v realnem času. Ni bistvene razlike je opaziti med miR-137-obdelano in-žoga obdelanih ali neobdelanih HGC-27 in SGC-7901 celic (slika 4c). Nato je bila izvedena western blot analizo za merjenje ravni Akt2 proteina. Ugotovili smo, da je bila ekspresija Akt2 proteina navzdol regulirano v miR-137 zdravljenih HGC-27 in GSS-7901 celicami, toda ne žoga ali nezdravljenimi celicami (slika 4D). Ti podatki kažejo, da miR-137 neposredno priznava 3'-UTR za Akt2 mRNA in zavira Akt2 prevod. Tako navzdol urejeno miR-137 v raka želodca zavira zatiranje Akt2, kar upočasnila tumorigeneze.

Akt2 je član AKT družino. Nadaljevali smo zaznali njegovega nadaljnjega efektorji Bad in GSK-B. Kot rezultat, p-Bad in p-GSK-B je očitno dol urejena v pokoj-137 obdelane HGC-27 in SGC-7901 celic v primerjavi z bitki obdelana ali neobdelanih celic. Ni pomembna sprememba je bila najdena v non-fosforiliranega slabo ali GSK (slika 4E). Te ugotovitve kažejo, da je bila pospešena rast želodca karcinom delno zaradi prekomernega Actived Akt poti. Poleg spodbujanja celične proliferacije, lahko actived Akt tudi fosforilacije slabo Ser112 in Ser136, blokiranje Bad inducirane celične smrti. V odsotnosti fosforilacije na teh mestih, je Bad mislil, da interakcijo z Bcl-xl povzroči celično smrt. V nasprotju s tem lahko Akt posredovano hyperphosphorylation slabih spodbujanje preživetja celic v rakave celice. Naši zahodni rezultati blot potrdili zgoraj špekulacije, da bi lahko bila sprememba dejavnosti želodca rakavih celic v stanju miR-137-transfekciji celic rezultat zmanjšal fosforilacijo slabega. Poleg tega smo analizirali raven beljakovin za Akt2 v 12 GC patientsin katerim je miR-137 navzdol regulirane. Med temi vzorci, je Akt2 up-urejena in9patientsin svojih GC tkiva (slika 4f).

Obnova Akt2 osvinčen do aktivacije invazije in preprečevanju apoptoze

Da bi lahko še naprej izkazovali vloge miR-137 in Akt2 igral med tumorigeneze, smo raziskovali učinek obnove Akt2 v miR-137 transfekciji celic. Western Blot je pokazala, da je bila stopnja Akt2 protein Akt2 čezmernim vzorcu očitno višja od negativne kontrole celo pod zatiranje miR-137. Obnova Akt2 osvinčen do aktivacije invazije in preprečevanju apoptoze (slika 5).

Pogovor

miRNAs so pogosto naveden ki se pogosto dysregulated v različnih človeških rakavih obolenj in ima nekaj miRNAs čeprav je bila uporabljena uporabimo kot terapevtske tarče raka. Raziskave, ki se nanašajo na odnos med miRNAs in raka bi nam lahko pomagajo pri razumevanju raka.

Obstaja le malo raziskav, ki se nanašajo na vlogo miR-137 igral z rakom želodca. Ugotovljeno je bilo, da je miR-137 negativni regulator CDC42 in z usmerjanjem ki inducira apoptozo in celičnega ciklusa G1 aretaciji v želodcu rakavih celic [17]. Vendar pa ureditev učinek microRNA pri raku je precej zapletena. Zdi se nemogoče, da miR-137 ureja raka želodca po enotni poti. V tej raziskavi, funkcijo in mehanizem, ki miR-137 reguliran raka želodca, je bilo dodatno raziskati.

Najprej smo zaznali izražanje miR-137 od 100 bolnikov in ugotovili, da je izraz miR-137 občutno navzdol -regulated v vzorcu raka. Prav tako smo ugotovili statistično pomembno povezavo med izražanjem miR-137 in raka želodca klinični fazi. Ti rezultati so pokazali, da lahko spremembe v miR-137 vpleten v želodčnem napredovanje raka. Poskušali smo najti razmerje med miR-137 in bolniki, starost in spol, vendar ni statistični rezultat je bilo. Ker ta študija pokazala, da je bila ekspresija miR-137 navzdol urejeno v večini tkiv GC primerjavi s sosednjimi tkivi (77%), lahko menimo o diagnostiki in prognostičnega uporabo miR-137. Nadaljnje potrjevanje v prospektivnih študijah je previdnost in bolj dostopne vzorcev viri, kot so miR-137-obogatenih tumor izvira eksozomov, prostazomov iz krvi, je treba raziskati. Prav tako je treba vedeti, da je do neke mere odrezati vrednost (odrezan = 1,5), smo se odločili, lahko še vedno arbitrarna. Ko je bila ustanovljena višja, bi lahko prišlo do manj bolnikov z miR-137 navzdol urejeno v tumorskih tkivih. Vendar pa tudi v tem stanju je bilo približno 23% vseh rakov imajo visoko miR-137 ekspresijo. To je lahko posledica posameznih razlike med bolniki, ki imajo lahko nekateri posamezniki različno izražanje genov vzorec med tumorigeneze ali raka napredovanje.

Kot izraz miR-137 v GC tkivih je bila nižja kot v sosednjih tkivih statistično značilne razlike (p = 0,00079), smo lahko domnevajo, da je ta izraz značilnost, povezano z razvojem raka. Ta ugibanja je potrdil in vitro in in vivo, da lahko miR-137 negativno urejajo proliferacije celic, migracije in invazijo. Nivo izražanja miR-137 more obdržati na visoki ravni v daljšem obdobju po transfekciji tako v želodcu raka celičnih linijah, ksenotransplantskih tumorjev končni fazi in inmetastatic lokaciji v pljučih (S1A slika-S1C Fig). Vendar pa je metoda prekomerno privede do zelo visoke stopnje izraženosti miR-137 (slika 2A). Ta visoka raven miR-137 lahko povzroči dodatne učinke. Na primer, miR-137 je negativni regulator CDC42 in ciljno usmerjenostjo, ki inducira apoptozo in celičnega ciklusa G1 aretaciji v želodcu rakavih celic [17]. Ker je bil miR-137 v naši raziskavi molekul tisočkrat, lahko to privede do inhibicije drugih ciljev, kot CDC42. Očitno je, da v tej raziskavi ne moremo izključiti možnosti, da so učinki zaviralnih Mir-137, ki jo posreduje zatiranja drugih ciljnih genov.

Potem smo ugotovili, da miR-137 deluje kot gen supresor tumorja skozi ciljanje Akt2 , ki je član AKT družino. Obnova Akt2 povzroča up uredbi o Akt2 v miR-137 transfekciji celic, ki je precej višja, kot je v kazenskem prostoru kmalu končala. To so lahko posledica, da Akt2 prekomerno obrnil raven beljakovin miR-137 zatreti. Še pomembneje pa je obnova Akt2 ureja apoptozo in vdor želodčnih rakavih celic, kar vodi do aktivacije invazije in preprečevanju apoptoze (slika 5). Ta reševanje poskus zagotavlja dodatne dokaze, da je miR-137 aktivni apoptoza celic in negativno uravnavajo celično invazijo z usmerjanjem Akt2. In vivo poskusi tudi pokazala, da je miR-137 izraz negativno glede na Akt2 izražanja (S1D slika in S1E slika). AKT je ključni dejavnik PI3K /AKT poti poti. Določene ureditev Akt2 še dodatno vpliva na njeno po toku navzdol protein Bad in GSK-3B, da je p-Bad in p-GSK-B očitno navzdol urejeno. Bad lahko igrajo svoje "vloge, ki jih fosforilacije in dodatno urejeno mobilni usodo [18]. GSK-3B, ki je znan tudi kot GSK-3p ponavadi nadzoruje priseljevanje celic in invazijo. Na koncu smo opredelili povezavo med miR-137 in Akt2, da je nova sestavina želodca tumorigeneze raka. MIR-137 je bilo dokazano, da so povezani z urejanjem Akt2 [19]. V karcinomom jetrnih celic, miR-137 zavira rast rakavih celic in metastaz preko neposredno ciljanje Akt2 [20]. V bistvu se mi e pregledani 8 genov, kot potencialnih tarč Mir-137 (S1 tabeli). Vendar pa je Akt2 je edina neposredna tarča miR-137 po dvojni luciferazne reporter genskega testa in zahodni blot preiskave. Od slika 4D najdemo thatmiR-137 lahko vplivajo na Akt2 in p-AKT2in obeh HGC-27 in SGC-7901 celic. Ampak zanimivo, v SGC-7901 status fosforilacija je očitno prizadela več. Ta pojav lahko dosledno upoštevati pri treh ponovljenih blot analiz smo izvedli. odšteti smo, da bi bilo treba zaradi posebnega premoženja različnih rakavih celic. Morda obstaja posebna ureditev pot način miR-137 v SGC-7901, ki zatira status fosforilacijo AKT2.However, od sedanje raziskave, ne moremo v celoti razložiti ta mehanizem. Ko smo se odločili za bolnike, ki imajo nizko izražanje miR-137 v svojem GC tkiva za odkrivanje izražanja v Akt2 proteinov smo ugotovili, da je večina teh bolnikov (9/12), imajo visoko stopnjo Akt2 v svojem GC tkiva. Ta rezultat je predlagal, da bi miR-137 ciljajo Akt2 pri bolnikih. Tam so bili tudi trije bolniki, ki imajo nizko izražanje Akt2 v GC tkivo, čeprav je izraz miR-137 nizka. Ta rezultat je lahko posledica posameznih razlike med bolniki.

Skratka, naš izraz in funkcionalne študije kažejo, da je miR-137 pogosto navzdol ureja raka želodca lahko deluje kot supresorski tumorja v GC celic, ponovno uvedbo izraz, ki na GC celice zatreti želodčni rak proliferacijo, migracijo in invazijo neposredno ciljanje Akt2. Tako, naša dela je dober dodatek k preteklega dela in je koristno za nas, da razumemo ureditev mehanizma miR-137 v raka.

Podpora Informacije
S1 Sl. miR-137 in Akt2 izraz po transfekciji.
A. miR-137 izraz v HGC-27 celic in SGC-7901 celic 72 ur po transfekcijskih. B. miR-137 izraz v ksenotransplantskih tumorje končni fazi. C. miR-137 izraz v metastatskega lokalizacijo miših pljuča. D. Akt2 izraz v metastatskega lokalizacijo miših pljuča. Smo mešati pet pljuča skupaj v isti skupini. E. Akt2 izraz v metastatskega lokalizacijo miših pljuča. Zaznali smo proteinski izraz Akt2 pri vsaki miši oz. 30 mikrogramov skupne beljakovine je bila uporabljena za vsak vzorec
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s001
(IOD)
S2 Sl. Cell preživetja test pred metastaz poskusom
sposobnost preživetja celic test je bil izveden 24 ur po transfekciji
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0130124.s002
(IOD)
S3 Sl. Adensitometric analiza slika 4E
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124.s003
(IOD)
S1 tabeli. . Potencialne ciljne geni miR-137
možne ciljne gene miR-137 je bilo napovedano, ki ga na programski opremi linije in zazna dvojno luciferazni reporter genski test in zahodni bloting
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130124. s004
(DOCX)

Zahvala

avtorji hvala dr Chengyuan Feng od raka bolnišnice, kitajske akademije medicinskih znanosti za tehnično pomoč in člen revizijo.

• Plos ONE: Identifikacija in karakterizacija CXCR4-Pozitivni Rak želodca Stem Cells
• Plos ONE: V MicroRNA-217 Deluje kot potencialnega zaviralnih želodčnega raka z usmerjanjem GPC5