PLOS ONE: Caracterización de genes expresados ​​diferencialmente implicados en las vías asociadas con el cáncer gástrico

Extracto

Para explorar los patrones de expresión génica en el cáncer gástrico, un total de 26 emparejado cancerosas y no cancerosas tejidos gástricos de pacientes se inscribieron para el análisis de microarrays de expresión génica. Se aplicaron métodos limma para analizar los datos, y se consideraron los genes que se expresa de forma diferente significativamente si el Descubrimiento Tasa de falsos (FDR) valor fue de < 0,01, P-valor
WAS < 0,01 y el pliegue del cambio (FC) era > 2. Posteriormente, se utilizaron ontología de genes (GO) categorías para analizar las principales funciones de los genes expresados ​​diferencialmente. De acuerdo con la Enciclopedia de Kyoto de genes y la base de datos de genomas (KEGG), encontramos vías asociadas significativamente con los genes diferenciales. red y co-expresión red de genes-Act se construyeron respectivamente sobre la base de las relaciones entre los genes, las proteínas y compuestos en la base de datos. Se seleccionaron 2371 mRNAs y 350 lncRNAs considerados genes como significativamente expresados ​​diferencialmente para el análisis ulterior. El GO categorías, vía análisis y la red de Gene-Ley mostró un resultado coherente que hasta reguladas genes eran responsables de la tumorigénesis, la migración, la angiogénesis y la formación microambiente, mientras que los genes regulados hacia abajo estaban involucrados en el metabolismo. Estos resultados de este estudio proporcionan unos resultados novedosos en la codificación RNAs, lncRNAs, caminos y la red de co-expresión en el cáncer gástrico que será útil para guiar una mayor investigación y elegir la terapia para esta enfermedad

Visto:. Li H , Yu B, Li J, Su L, Yan M, Zhang J, et al. (2015) Caracterización de genes expresados ​​diferencialmente implicados en las vías asociadas con el cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (4): e0125013. doi: 10.1371 /journal.pone.0125013

Editor Académico: Francisco J. Esteban, Universidad de Jaén, ESPAÑA

Recibido: 9 de noviembre de 2014; Aceptado: March 6, 2015; Publicado: 30 de abril 2015

Derechos de Autor © 2015 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. Todos los archivos de microarrays están disponibles en el NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) de bases de datos (número de acceso "GSE65801"; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801).

Financiación: Este trabajo fue apoyado por becas para el análisis de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [No. 81172324, 91229106 N °, N ° 81272749, 81372231 y N °], Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai [No. 13ZR1425600], y la clave de Proyectos en la Ciencia &Nacional; Programa de Tecnología Pilar de China (Nº 2014BAI09B03). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo, y su incidencia es particularmente alta en Asia Oriental, especialmente en china. Aproximadamente 952.000 nuevos casos de cáncer de estómago fueron diagnosticados en todo el mundo en 2012, y la mitad de ellos se produjeron en Asia oriental (principalmente en China) [1]. En China, la mayoría de los pacientes con GC son diagnosticados en una etapa avanzada con mal pronóstico. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de la GC es esencial para la identificación de biomarcadores clave y el desarrollo de terapias dirigidas efectivas.

Durante la última década, los microarrays de expresión génica se han convertido en una herramienta común para examinar los niveles de transcripción de genes en la investigación del cáncer. Microarray datos se utiliza para una amplia variedad de análisis, tales como la agrupación sin supervisión, la clasificación, el análisis de expresión diferencial, y la cartografía de expresión de loci de rasgos cuantitativos [2]. No sólo ayuda a identificar los genes disfuncionales clave en el cáncer, pero proporciona información de todo el genoma de la expresión de genes a la vez, así [3,4]. En este estudio, hemos realizado un estudio de todo el genoma de la expresión de ARNm y lncRNAs a partir de muestras pareadas de cáncer gástrico tejidos primarios y tejidos no cancerosos, para perfilar los lncRNAs expresados ​​diferencialmente y codificación de ARN. El estudio de estos datos proporcionará información valiosa sobre el mecanismo de la carcinogénesis y permitir el descubrimiento de genes clave que pueden actuar como objetivos futuros de la terapia contra el cáncer.

Métodos y materiales

Declaración Ética

escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. El estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de Ética del Hospital Ruijin, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine.

Las muestras de tejido

Los tejidos fueron tomados de los carcinomas gástricos primarios de pacientes no tratados que se sometieron a D2 gastrectomía radical en el hospital Ruijin de Shanghai. Para cada tejido de cáncer, una muestra de tejido no canceroso emparejado se recogió de la región adyacente al mismo tiempo. El tamaño de cada muestra fue de alrededor de 0,1 cm ^{3. Todas las muestras se colocaron en RNALater dentro de los 15 minutos después de la escisión y almacenados en nitrógeno líquido hasta la extracción de ARN. En este estudio, se recogieron 32 pares de tejidos para el microarray y 26 pares de muestras se inscribieron para el análisis de la próxima etapa de GO, y vía la red después del control de calidad mediante el análisis de componentes principales 3D (3D-PCA) y el análisis de conglomerados.}

experimentos de microarrays

Agilent SurePrint G3 humano GE 8x60K de microarrays (Design ID: 028004) ha sido utilizada en este estudio. El ARN total se aisló y se amplificó usando una entrada baja rápida Amp Kit de etiquetado, de un color (Catȇ0-2305, Agilent Technologies, EE.UU.). A continuación, los ARNc marcadas se purificaron mediante un kit RNeasy mini (Cat˥06, QIAGEN, Alemania).

Sobre la base de las instrucciones del fabricante, cada diapositiva se hibridó con 600 ng Cy3 marcado con cRNA usando un equipo de la Expresión Génica La hibridación (Cat.188-5242, Agilent Technologies, EE.UU.) y bañadas por el gene Expression tampón de lavado Kit (CatȆ8-5327, Agilent Technologies, EE.UU.).

Un escáner Agilent Microarray (Cat # G2565CA, Agilent tecnologías, EE.UU.) y el software de extracción de características (10,7 tecnologías de Agilent, USA) se aplicaron a escanear cada diapositiva con los mismos valores que se muestran como sigue, el canal del tinte: verde, resolución de escaneado = 3μm, 20bit. Los datos en bruto se normalizaron por el algoritmo de cuantiles, Gene Software Primavera 11.0 (Agilent Technologies, EE.UU.) (detallado en la Tabla S5).

Limma

Los modelos lineales y métodos empíricos de Bayes se aplicaron para analizar los datos de este estudio. Las resultantes P
-valores se ajustaron utilizando el algoritmo BH FDR. Había tres estándares para nosotros consideramos que un gen se expresó significativamente diferente, el valor FDR era < 0,01, P-valor
WAS < 0,01 y el pliegue del cambio era > 2. (Se detalla en la Tabla S5)

GO categoría

Se realizó ontología de genes (GO) analiza para analizar las funciones de los genes expresados ​​diferencialmente en nuestra microarrays de acuerdo con la clasificación funcional clave del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI). Por lo general, la prueba exacta de Fisher y el χ
^{2 de ensayo se aplicaron para clasificar la categoría GO, y la tasa de falso descubrimiento (FDR), se calculó para corregir el P-valor
( N
_{k
se refiere al número de la prueba de Fisher P-valores
menor que el χ
2 test P-valores
). El Re enriquecimiento fue dada por: Re = ( n
f
/ n
) /( N
f
/ N
) en las categorías significativas ( N
f
es el número de genes diferenciales dentro de la categoría en particular, n
es el número total de genes dentro de la misma categoría, n
f
es el número de genes diferenciales en todo el microarray, y N
es el número total de genes en el microarray) (se detalla en la Tabla S5)}}

análisis Camino

Pathway anotaciones de los genes diferenciales exressed se obtuvieron de KEGG (http: //www .genome.jp /KEGG /). Categorías de la vía con un FDR < 0,01 se ha marcado. El enriquecimiento de las vías significativas fue dada por: enriquecimiento = /, lo que nos ayudó a localizar las vías más importantes en nuestro estudio ( n
_{g
es el número de genes diferenciales dentro de la vía en particular, n
a
es el número total de genes dentro de la misma vía, N
g es la
número de genes diferenciales que tienen al menos una anotación de vía, y N
a
es el número de genes que tienen al menos una anotación de vía en todo el microarray.) (detalladas en la Tabla S5).}

red de genes-Ley

de acuerdo con la base de datos KEGG, un gen puede estar involucrado en varias vías o interactuar con varios otros genes. Todas las interacciones gen-gen se agruparon juntos para construir la red de genes-Ley sobre la base de las vías diferenciales, lo que nos ha ayudado a revelar las vías de señalización y los genes reguladores clave en GC.

Co-expresión de red

gene Red de co-expresión se construyó de acuerdo con la intensidad de la señal normalizada de expresión de genes específicos. centralidad de grado se define como el número de enlaces de un nodo tiene a otro, lo que determina la importancia relativa de los genes. Lo que es más, k-núcleos se aplicaron como un método de simplificación de los análisis de la topología gráfico. factores reguladores centrales (genes) que tienen los más altos grados conectan mayoría de los genes adyacentes y construir la estructura de la red (que se detallan en la Tabla S5).

PCR cuantitativa

Se extrajo el ARN total en tiempo real de los tejidos utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCR) se realizó mediante el uso de PCR Mix Master SYBR-verde en un Fast-PCR en tiempo real 7500 System (Applied Biosystems). Los cebadores de los 10 genes se mostraron en la Tabla S4. Las reacciones de PCR se realizaron a 50 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Ct se calculó restando el Ct de ARN β-actina (control) de la Ct de la ARN de la muestra, respectivamente. entonces ΔΔCt se calculó restando el Ct del control de la Ct de la muestra. Doble cambio se calculó mediante la ecuación 2-ΔΔCt.

El análisis estadístico

software SPSS 19 y Microsoft Excel 2010 se utilizó para analizar los datos. Los niveles de expresión entre los tejidos de cáncer y tejidos cancerosos adyacentes se analizaron mediante muestras pareadas t-tests. P
-valores por debajo de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

análisis de microarrays

En total, 42,405 genes humanos fueron perfilados en nuestro estudio utilizando un microarray Agilent G3 GE humano 8x60K. Hemos presentado nuestra base de datos en el repositorio de "Gene Expression Omnibus" y el número de acceso era "GSE65801" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801). Se utilizaron modelos lineales y métodos empíricos de Bayes para analizar los datos (ver Métodos). Hubo 2371 ARNm y 350 lncRNAs considerados como los genes expresados ​​diferencialmente por limma para el análisis siguiente paso (figura 1A).

Entre todos los ARNm 2371 diferenciales, hay 1142 ARNm regulados hacia abajo y arriba ARNm 1229 regulado en nuestra observación de alteraciones de la expresión génica entre cáncer gástrico y los tejidos de control (figura 1C). La mayoría de los mRNAs diferenciales han demostrado que se correlaciona con la carcinogénesis y metástasis en la mayoría de tipos de cáncer (Tabla 1). Los genes como GKN2, PGC, MUC6, Chia, PSCA y FBP2 estaban entre los 20 primeros genes regulados, mientras que KLK8, SFRP4, INHBA, CLDN1, CST1, FAP, SPP1, OLFM4, y KRT17 estaban entre los 20 primeros hasta genes -regulated (Tabla 1). Sin embargo, no se ha informado de algunos genes tales como HOXC9, FNDC1, Stra6, KCNE2, PGA3 y KCNJ16 en el cáncer gástrico y se desconoce (Tabla 1) sus roles.

Además, encontramos 193 el regulado lncRNAs y 156 lncRNAs hasta reguladas entre un total de 350 lncRNAs diferenciales en base a la elaboración de perfiles (figura 1B). La mayoría de los lncRNAs no se haya dado a los nombres oficiales y sus funciones siguen siendo desconocidos. Sin embargo, algunos se han reportado que juega un papel crítico en el cáncer, tales como H19, GUCY1B2, MEG3 y AKR7L (Tabla 2).

En nuestro informe anterior [36], el factor de cambio (FC) de H19 en el 74 cáncer gástrico en comparación con los tejidos no cancerosos pareadas fue 6.015, con un P
-valor de 0,017. Este resultado fue consistente con los datos de H19 (Absoluto FC = 6,06) en el análisis de este microarray. Por otra parte, la sobre-expresión de H19 contribuye a la proliferación, migración, invasión y metástasis de cáncer gástrico.

categorías de ontología de genes

Todos los genes expresados ​​diferencialmente fueron clasificados en diferentes categorías funcionales de acuerdo con la Gene Ontología proyecto (GO) para los procesos biológicos. En base a los datos de microarrays, GO análisis indicó que 208 GO términos fueron enriquecidos ( P Hotel < 0,01, FDR < 0,01) (Tabla S1). Los GO categorías primarias para 170 GO términos regulados hasta se han centrado en la adhesión celular, la angiogénesis, el desarrollo organismo multicelular, guía de axones, el desarrollo del sistema esquelético, organización de fibrillas de colágeno, la regulación positiva de la angiogénesis, hiriendo y la regulación negativa de la proliferación celular (Figura 2A) . Las principales categorías GO para reguladas por los genes eran la digestión, el metabolismo de xenobióticos, el transporte transmembrana, el transporte de iones, pequeñas proceso metabólico molécula, la regulación negativa de crecimiento, el metabolismo del glutatión, la respuesta celular a iones cadmio y el proceso metabólico (figura 2B).

Según los genes y las funciones diferenciales, se construyó un árbol de GO para explorar las interacciones entre todas las categorías diferencial GO. La diversidad en estas categorías cuando se comparan tejidos cancerosos y de control sugiere que el cáncer gástrico puede estar asociada con significativamente hasta reguladas la migración celular, la proliferación celular, la angiogénesis, la adhesión célula-célula y las vías de señalización del receptor de la superficie celular, mientras que los procesos de metabolismo celular y el transporte transmembrana de iones están regulados hacia abajo (figura 3).

analiza Camino

Camino análisis se utilizaron para identificar las vías significativas asociadas con los genes expresados ​​diferencialmente de acuerdo con KEGG. Hubo 32 vías hasta reguladas y 31 vías-regulado sobre la base de nuestros datos (figura 4). Además, el perfilado vía fue consistente con los resultados para las categorías GO en funciones biológicas relacionadas con el cáncer. Nuestros datos muestran algunos genes diferenciales altamente regulados hasta que sugerían sus vías de señalización implicadas fueron activiated. Por ejemplo, SFRP4, wnt11, FZD2, MYC fueron altamente expresado en tejidos de cáncer que representan la vía Wnt se activiated y BCL2A1, ICM1, TNFSF14 en ruta de NF-kB se expresa altamente también. La mayoría de las vías de señalización relacionadas con el cáncer tales como JAK /STAT, Wnt, NF-kB, PI3K, mTOR, Hedgehog y las vías de Notch se activaron en el cáncer gástrico en comparación con los tejidos no cancerosos sobre la base de nuestros datos (S2 tabla). Las vías regulados hasta que se centraban en la adhesión celular, la desregulación de la transcripción, la carcinogénesis y la diferenciación se correlacionaron con la tumorogénesis y metástasis (Figura 4A). Sin embargo, las vías reguladas por lo general eran responsables del metabolismo (Figura 4B).

Gene-Ley red

Sobre la base de categorías GO y análisis de vías, un gen puede estar involucrado en varias vías o interactuar con varios otros genes. Se agruparon los genes diferenciales y construimos una red de interacciones de los genes expresados ​​diferencialmente. Una proteína de alto grado regula o está regulada por muchas otras proteínas, lo que implica un papel importante en la red de genes-Act (S3 Tabla). El glutatión S-transferasa (GST) de la familia, de la familia del citocromo P450 (CYP), UDP glucuronosyltransferase 2 (UGT2) de la familia, factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y AMPc dependiente de la proteína quinasa beta catalítica (PRKACB) estaban en el núcleo de la gen-gen interacción red. Ellos pueden jugar un papel clave en la red, ya que poseían el grado más fuerte (grado > 25) centralidades (interacciones gen-gen) (figura 5). Se ha informado de que GST, EGFR y PRKACB son responsables de las vías de transducción de señales implicadas en el crecimiento tumoral y la diferenciación en diferentes tipos de cáncer [42,43].

Gene co-expresión de red

Hemos producido una red de genes co-expresión basado en el complejo expresado diferencialmente genes, proteínas y proteína en tejidos de cáncer y tejidos no cancerosos (control), respectivamente. En comparación con el control, las conexiones entre los genes en tejidos de cáncer eran menos, lo que sugiere que la mayoría de las interacciones gen-gen fisiológicos y vínculos en los tejidos normales se habían roto o perdido en los tejidos de cáncer (Figura 6A y 6B). Los genes con alto grado y k-núcleo que significa que poseían la mayor parte de las interacciones con otros geneswere conocida como genes clave en la red de interacción (Figura 6B) incluyendo TRO, GPR124, TIMP2, EMCN, SLIT3, HTRA1, SPARC, LAMA4 y MEOX2 (Tabla 3). Ellos fueron los responsables de la señalización celular, la adhesión, la angiogénesis, la migración, el crecimiento y la metástasis.

Confirmación de los resultados de microarrays por qPCR

Se realizó Cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR) el 6 hasta reguladas genes (COL1A, BGN, SPP1, Melk, IGFBP4, SPARC) y 4 genes regulados (PGC, SST, MT1X, S100P) para verificar nuestros datos en los tejidos de cáncer gástrico (tumor) y los tejidos no cancerosos (normal). Las proporciones de expresión de estos 10 genes (Tumor /Normal) de qPCR son consistentes con los de microarrays (S4 Tabla). Se sugirió que los datos de la expresión diferencial de los genes de microarrays era fiable. Lo que es más, nuestro equipo ha trabajado en algunos de los genes diferenciales tales como PHF10 [55], CEACAM6 [56], SFRP1 [57], SOX11 [58], CLDN1 [59] para investigar su expresión y funciones en el cáncer gástrico y los resultados perfectos demostraron nuestros datos de microarrays.

analiza Discusión

microarrays de expresión génica en el cáncer gástrico han sido previamente utilizado para predecir los marcadores de diagnóstico [60] y para identificar los patrones de expresión de genes relacionados con el pronóstico [ ,,,0],61,62], pero no se ha utilizado para revelar las interacciones moleculares entre lncRNAs y mRNAs en GC. En este estudio, se analizaron 26 tejidos de cáncer gástrico con tejidos no cancerosos pareadas y perfiladas los genes expresados ​​diferencialmente en función de su GO categorías, las vías, Gene-Ley de la red y la co-expresión de red.

El gen se obtuvieron resultados de la expresión mediante el uso de una micromatriz Agilent G3 GE humano 8x60K, que no sólo cubre las bases de datos del transcriptoma de mRNA objetivos pero también incluye sondas para lncRNAs (ARNs largos no codificantes). Con la combinación de ARNm y lncRNAs, se puede llevar a cabo dos experimentos en una sola microarrays y predecir la función lncRNA y la interacción con mRNAs. Los análisis revelaron un conjunto de genes que son expresados ​​diferencialmente entre el cáncer gástrico y el tejido normal. Algunos de ellos han sido reportados previamente en el cáncer gástrico o de otro tipo. Por ejemplo, la expresión de gastrokine-2 (GKN2) fue significativamente reguladas por o ausente en líneas celulares de cáncer gástrico, intestinal metaplasia gástrica, y tejidos tumorales. La sobreexpresión de la GKN2 contribuido a la proliferación celular, la migración y la invasión del cáncer gástrico y detuvieron el ciclo celular en la fase G1-S transición [6]. En contraste, los niveles de expresión de la beta inhibina A (INHBA) fueron significativamente mayores en el tejido canceroso que en la mucosa normal adyacente, y que es considerado como un factor pronóstico independiente en el cáncer gástrico [22]. Además, hemos descubierto algunos genes novedosos, tales como TMEM184A, PSAPL1, KIAA1199, CLRN3 y FNDC1, que no han sido reportados en el cáncer gástrico anteriormente, y su papel en el cáncer siguen siendo desconocidos.

Una de las ventajas de nuestro análisis de microarrays de expresión génica es que representa la expresión de ARNm y lncRNAs de manera que ambos podrían ser investigados juntos. Nuestro informe previamente sobre el papel de lncRNA H19 y su red de GC [36] se basó en estos datos de microarrays. Sin embargo, la mayoría de los lncRNAs como DRD5, FMO6P, SNAR-A3 y TPRXL mostraron en nuestra microarrays no han sido identificados y la necesidad de una mayor investigación para aclarar su papel en el cáncer gástrico.

Sobre la base de nuestra perfiles de expresión génica datos, los genes y sus funciones activadas en el cáncer gástrico fueron responsables de la proliferación, adhesión, migración y metástasis, que era consistente con los resultados de los análisis de vía. Curiosamente, descubrimos que la mayoría de las vías de señalización relacionadas con el cáncer reportados previamente como Notch, mTOR y erizo se activaron en GC en base a nuestros datos. Estos resultados apoyan el punto de vista de que la heterogeneidad es la característica de GC. La comparación de la red de co-expresión entre los tejidos normales y el cáncer sugiere que la expresión, funciones e interacciones de la mayoría de los genes fisiológica se pierden o se dañan en el cáncer gástrico, mientras que la proliferación, la migración y la metástasis se han mejorado de forma anormal. Estos hallazgos interesantes se ajustan a las características del cáncer, tales como la anaplasia y desdiferenciación. Estos genes expresados ​​diferencialmente implicados en las vías de señalización actuaron como genes clave en la red de co-expresión podrían ser los objetivos potenciales de la terapia contra el cáncer o marcadores de diagnóstico en el futuro.

Apoyo a la Información sobre Table S1. Pathway análisis de los genes diferenciales
doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s001 gratis (XLSX)
S2 tabla. GO análisis de los genes diferenciales
doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s002 gratis (XLSX)
S3 Tabla. red de genes-Ley de los genes diferenciales
doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s003 gratis (XLSX)
S4 Tabla. Los cebadores y la verificación
doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s004 gratis (DOCX)
S5 tabla. Métodos y materiales
doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s005 gratis (DOCX)

Reconocimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Fred Bogott en el Centro Médico de Austin , Universidad de Minnesota, y el Dr. Joshua Liao en el Instituto Hormel, Austin de Minnesota, para su edición de Inglés de este manuscrito. Nos gustaría dar las gracias a los donantes para apoyar este estudio. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [No. 81172324, 91229106 N °, N ° 81272749, 81372231 y N °], Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai [No. 13ZR1425600], y la clave de Proyectos en la Ciencia &Nacional; Programa Pilar Tecnología de China (Nº 2014BAI09B03).

• PLOS ONE: Análisis de supervivencia de pacientes con cáncer sometidos a cribado intervalo cáncer gástrico por Endoscopy
• PLOS ONE: Significado pronóstico de la matriz metaloproteinasa-7 en el cáncer gástrico Supervivencia: Un meta-Analysis