PLoS ONE: Характеристика дифференциально экспрессируются гены, участвующие в Pathways, связанных с желудочной Cancer

Абстрактный

Для того, чтобы изучить паттерны экспрессии генов при раке желудка, в общей сложности 26 парных рака желудка и нераковых тканей от пациентов были зачислены для экспрессии генов микрочипов анализа. Методы Limma были применены для анализа данных, а также были рассмотрены гены, которые будут значительно выражены по-разному, если значение False Discovery Rate (FDR) значение составило &л; 0,01, P
-value WAS &л; 0,01 и складка изменение (FC) был > 2. Впоследствии, Джин Онтология (ГО) категории были использованы для анализа основных функций дифференциально выраженных генов. В соответствии с Киотским Энциклопедия генов и базы данных геномов (KEGG), мы нашли пути в значительной степени связано с дифференциальными генов. сети и совместная экспрессия генной сети-Act были построены соответственно основаны на соотношениях между генами, белками и соединений в базе данных. 2371 и 350 мРНК lncRNAs считаются значительно дифференцированно выраженные гены были отобраны для дальнейшего анализа. GO категории, пути анализа и генной сети-Act показал последовательный результат, который до регулируемых генов ответственны за онкогенеза, миграцию, ангиогенез и формирование микроокружения, а понижающей регуляции генов участвуют в обмене веществ. Эти результаты этого исследования обеспечивают некоторые новые выводы по кодированию РНК, lncRNAs, пути и коэкспрессией сети при раке желудка, которая будет полезна для руководства дальнейшего изучения и целевой терапии этого заболевания
<р> Цитирование:. Ли H , Ю.Б., Li J, Су L, M Ян, Чжан J, и др. (2015) Характеристика дифференциально экспрессируются гены, участвующие в Pathways, связанных с раком желудка. PLoS ONE 10 (4): e0125013. DOI: 10.1371 /journal.pone.0125013
<р> Академический редактор: Francisco J. Эстебан, Университет Хаэн, Испания
<р> Поступило: 9 ноября 2014 года; Принято: 6 марта, 2015 года; Опубликовано: 30 апреля 2015
<р> Copyright: © 2015 Li и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в его сопутствующую информацию, файлы и бумаги. Все файлы микрочипов доступны из выражения NCBI Gene Omnibus (GEO) базы данных (инвентарный номер "GSE65801"; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801). <бр>

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами для анализа из Национального фонда естественных наук Китая [No. 81172324, № 91229106, № 81272749 и № 81372231], науке и технике комиссии муниципалитета Шанхая [No. 13ZR1425600], а также ключевых проектов в отечественной науке и Amp; Технология Столб программы Китая (№ 2014BAI09B03). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных видов рака во всем мире, и заболеваемость особенно высока в Восточной Азии, особенно в Китае. Около 952000 новых случаев рака желудка были диагностированы во всем мире в 2012 году, и половина из них имели место в Восточной Азии (в основном в Китае) [1]. В Китае, большинство пациентов с ГК диагностируется на поздней стадии с плохим прогнозом. Поэтому выяснении молекулярных механизмов, лежащих в основе прогрессии GC имеет важное значение для определения ключевых биомаркеров и разработка эффективных целевых методов лечения.

За последнее десятилетие, экспрессия генов микрочипов стали обычным инструментом для изучения уровней транскриптов генов в исследовании рака. Данные микрочипов используется для самых разнообразных анализов, таких как неконтролируемом кластеризация, классификация, анализ дифференциальной экспрессии и экспрессии картирования локусов количественных признаков [2]. Это не только помогает идентифицировать ключевые гены в дисфункциональных рака, но обеспечивает геному информацию о экспрессии генов в одно время, а также [3,4]. В данном исследовании мы провели геному исследование экспрессии lncRNAs и мРНК из спаренных образцов первичных раковых тканей желудка и нераковых тканей, к профилю дифференциально выраженные lncRNAs и кодирующие РНК. Изучение этих данных позволит получить ценную информацию о механизме канцерогенеза и позволяют открытие ключевых генов, которые могут выступать в качестве будущих целей противораковой терапии.

Методы и материалы

Этическое заявление <бр> <р> Письменное информированное согласие было получено от всех участников. Исследование было одобрено Комитетом по этике по населенным исследования Жуйцзинь больницы, Shanghai Jiao Tong University, Школа медицины по.

Образцы тканей
<р> Тканей были взяты из первичных карцином желудка от леченных пациентов, перенесших D2 радикальная резекция в Шанхае Жуйцзинь больницы. Для каждой ткани рака, парный образец нераковые ткани отбирали из смежной области, в то же время. Размер каждого образца составляла около 0.1cm 3. Все образцы были помещены в RNAlater в течение 15 минут после того, как иссечение и хранили в жидком азоте до экстракции РНК. В этом исследовании, 32 спаренных ткани были собраны для микрочипов и 26 парных образцов были зачислены для следующего шага анализа GO, пути и сети после контроля качества с использованием 3D-анализа главных компонент (3D-PCA) и кластерного анализа.

микрочипов эксперименты
<р> Agilent SurePrint G3 GE Human 8x60K микрочипов (Design ID: 028004) был использован в данном исследовании. Общую РНК выделяли и амплифицировали с использованием низкого входного Quick Amp Этикетировочное Kit, одноцветная (Catȇ0-2305, Agilent Technologies, США). Затем меченые кРНК очищали с помощью RNeasy Mini Kit (Cat˥06, QIAGEN, Германия).
<Р> На основании инструкции изготовителя, каждый слайд гибридизовали с 600ng Cy3-меченым кРНК с использованием экспрессии гена Kit гибридизации (CatȆ8-5242, технологии Agilent, США) и омывает Gene Expression промывочного буфера Kit (CatȆ8-5327, технологии Agilent, США).
<р> Agilent микрочипов сканер (Cat # G2565CA, Agilent технологии, США) и Feature Extraction программного обеспечения 10.7 (технологии Agilent, США) были применены для сканирования каждого слайда с теми же настройками, показанными как следуют, канал Dye: зеленый, разрешение сканирования = 3 мкм, 20bit. Исходные данные были нормированы квантильной алгоритмом, Gene Spring Software 11,0 (технологии Agilent, США) (подробно в S5 таблице).

Limma

Линейные модели и эмпирические методы Байеса были применены для анализа данные, приведенные в данном исследовании. Полученные в результате P
-значения были скорректированы с использованием алгоритма BH FDR. Существовали три стандарта для нас, чтобы рассмотреть, что значительно дифференцированно экспрессируется ген, значение FDR был &л; 0,01, P
-value WAS &л; 0,01 и складка изменение было > 2. (Подробно в таблице S5)

категория

Мы провели Джин Онтология (ГО) анализирует, чтобы проанализировать функции дифференциально выраженных генов в нашем микрочипов в соответствии с ключевой функциональной классификации Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Как правило, точный критерий Фишера и кнопку χ
^{2 теста были использованы для классификации категории GO, а также частоту ложных открытий (FDR,) рассчитывали исправлять P
-value ( N
<югу> к
относится к числу критерий Фишера P
-значения меньше х
2 теста P
-значения). Обогащение Ре определяется по формуле: Re = ( п
<югу> е
/<ет> п
) /( N
<суб> е
/ N
) в значимых категориях ( N
<югу> е
это число дифференциальных генов в пределах определенной категории, п
общее число генов в той же категории, п
<югу> е
это число дифференциальных генов во всем микрочипов, и N <бр ..>: общее число генов в микрочипе) (подробно в таблице S5)}

Тропинка анализ
<р> Pathway аннотаций дифференциальных exressed генов были получены из KEGG (HTTP: //WWW .genome.jp /KEGG /). Тропинка категории с Рузвельтом и ЛТ; 0,01 были отмечены. Обогащение значимых путей было дано: обогащение = /, что помогло нам найти более значимые пути в нашем исследовании ( п
<югу> г
это число дифференциальных генов в частности путь, <ет> п
<югу> а
общее число генов в пределах того же пути, N
<югу> г
является число дифференциальных генов, которые имеют по крайней мере один тропинка аннотацию, и N
<суб> а
это число генов, которые имеют по крайней мере один тропинка аннотацию во всем микрочипов.) (подробные в S5 таблице).

сеть Gene-Act
<р> Согласно базе данных KEGG, один ген может быть вовлечен в несколько путей или взаимодействовать с несколькими другими генами. Все взаимодействия генов-генов были объединены вместе, чтобы построить сеть Gene-Act на основе дифференциальных путей, что позволило нам выявить сигнальные пути и ключевых регуляторных генов в GC.

Co-выражение Сеть <р> Джин коэкспрессией сеть была построена по нормированной интенсивности сигнала конкретных экспрессии генов. Степень центральности определяется как количество ссылок, один узел имеет к другому, который определяет относительную значимость генов. Более того, K-ядер применялись в качестве способа упрощения топологии графа анализа. Основные регуляторные факторы (гены), которые имеют самые высокие степени соединяет большинство соседних генов и построить структуру сети (подробно в S5 таблицу).

в режиме реального времени количественный ПЦР
<р> Суммарную РНК экстрагировали из тканей с использованием реагента тризола (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Количественная в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили с использованием SYBR-зеленый PCR Master Mix в Fast ПЦР в реальном времени 7500 (Applied Biosystems). Праймеры 10 генов были показаны в Таблице S4. ПЦР-реакции проводили при 50 ° С в течение 2 мин, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин. Δ CТ рассчитывали путем вычитания КТ -актина РНК (контроль) из Ct РНК из образца, соответственно. ΔΔCt затем рассчитывается путем вычитания из Δ CТ управления от Δ CТ образца. Сложите изменение рассчитывали по уравнению 2-ΔΔCt.

Статистический анализ
<р> Программное обеспечение SPSS 19 и Microsoft Excel 2010 была использована для анализа данных. Уровни экспрессии между раковых тканей и прилегающих к ним нераковых тканей были проанализированы с помощью парных образцов т-тестов. P
-значения ниже 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

микрочипов анализ
<р> В общей сложности 42,405 человеческие гены были профилированные в нашем исследовании с использованием микрочипов Agilent G3 GE Human 8x60K. Мы представили наш набор данных в хранилище "экспрессии генов Омнибус" и инвентарный номер был "GSE65801" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801). Мы использовали линейные модели и эмпирические методы Байеса для анализа данных (см методы). Существовали 2371 и 350 МРНК lncRNAs рассматривается как дифференциально выраженных генов с помощью limma для следующего шага анализа (рис 1А).
<Р> Среди всех 2371 дифференциальных мРНК, есть 1142-мРНК вниз регулируется и 1229 МРНК вверх регулируется в нашем наблюдении на изменения экспрессии генов между раком желудка и тканей управления (рис 1C). Большинство дифференциальных мРНК, как было доказано, что коррелирует с канцерогенеза и метастазирования в большинстве видов рака (таблица 1). Эти гены, такие как GKN2, PGC, MUC6, Чиа, ВВЦУ и FBP2 были в числе 20 лучших вниз-регулируемых генов, в то время как KLK8, SFRP4, INHBA, CLDN1, CST1, FAP, SPP1, OLFM4 и KRT17 были в числе топ-20 до -regulated генов (таблица 1). Тем не менее, некоторые гены, такие как HOXC9, FNDC1, STRA6, KCNE2, PGA3 и KCNJ16 не сообщалось при раке желудка и их роли остаются неизвестными (таблица 1).
<Р> Кроме того, мы обнаружили 193 вниз регулируется lncRNAs и 156 вверх регулируемые lncRNAs среди в общей сложности 350 дифференциальных lncRNAs на основе профилирования (рис 1В). Большинство lncRNAs не дали ему официального названия и их функции остаются неизвестными. Тем не менее, некоторые из них были зарегистрированы играют решающую роль в раке, такие как H19, GUCY1B2, MEG3 и AKR7L (таблица 2).
<Р> В нашем предыдущем докладе [36], складка изменение (FC) от H19 в 74 рак желудка по сравнению с парными нераковых тканей был 6,015, с P
-Value 0,017. Этот результат согласуется с данными H19 (Absolute FC = 6,06) в этом микрочипов анализа. Кроме того, избыточная экспрессия H19 способствует пролиферации, миграции, инвазии и метастазирования рака желудка.

Джин Онтология категории
<р> Все дифференциально выраженные гены были классифицированы по различным функциональным категориям в соответствии с Джин Онтология (ГО) проект для биологических процессов. На основании наших данных микрочипов, GO анализ показал, что 208 терминов GO обогащались ( P
&л; 0,01, FDR &л; 0,01) (S1 Таблица). Основные категории GO 170 до регулируемых терминов GO были сосредоточены на клеточной адгезии, ангиогенеза, развитие многоклеточного организма, аксонов, развитие скелетной системы, коллагеном организации фибрилл, позитивное регулирование ангиогенеза, ранив и негативной регуляции клеточной пролиферации (рис 2A) , Основные категории GO для понижающей регуляции генов пищеварения, ксенобиотики метаболический процесс, трансмембранный транспорт, ионный транспорт, малая молекула метаболический процесс, негативная регуляция роста, глутатион метаболические процессы, клеточный ответ на кадмий ионов и метаболических процессов (рис 2В).

по данным дифференциальных генов и функций, мы построили GO Tree, чтобы исследовать взаимодействия между всеми категориями дифференциальной GO. Разнообразие этих категорий при сравнении раковыми и контрольных тканей предположили, что рак желудка может быть связано со значительно повышающей регуляции клеточной миграции, пролиферации клеток, ангиогенеза, межклеточной адгезии и рецептором клеточной поверхности сигнальных путей, в то время как клеточный метаболизм процессы и ионный трансмембранный транспорт которые вниз регулируется (рис 3).

Тропинка анализ
<р> Тропинка анализы были использованы для выявления значимых путей, связанных с дифференцированно выраженных генов согласно KEGG. Были 32 повышающей регуляции путей и 31 понижающей регуляции путей на основании наших данных (фиг.4). Кроме того, путь профилирование согласуется с результатами для категорий Займусь связанных с раком биологических функций. Наши данные показали некоторые дифференциальные гены высоко повышающей регуляции, которые предложены их задействованные пути были activiated. Например, SFRP4, Wnt11, FZD2, MYC были высоко экспрессируется в раковых тканях, которые представляют собой путь Wnt был activiated и BCL2A1, ICM1, TNFSF14 в NF-kB пути были высоко выражены как хорошо. Большинство связанных с раком сигнальных путей, таких как JAK /STAT, Wnt, NF-kB, PI3K, МРМ, еж и путей Notch активировались при раке желудка по сравнению с нераковых тканей на основе наших данных (S2 таблицу). Ультрасовременные регулируются пути, которые были сосредоточены на клеточной адгезии, транскрипционной дерегуляции, канцерогенеза и дифференцировки коррелировали с tumorogenesis и метастазирования (рис 4а). Тем не менее, вниз регулируемых путей, как правило, отвечают за обмен веществ (фиг.4В).

Gene-Act Сеть <р> На основе GO категорий и анализа путей, один ген может быть вовлечен в несколько путей или взаимодействовать с несколькими другими генами. Мы объединили дифференциальные гены и построили сеть взаимодействий дифференциально выраженных генов. Белок высокой степени регулирует или регулируется многими другими белками, что предполагает важную роль в сети Gene-Act (S3 Table). Глутатион S-трансферазы семьи, семьи цитохрома Р450 (CYP), UDP глюкуронозилтрансферазы 2 (UGT2) семья, семья (GST) Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и цАМФ-зависимой протеинкиназы каталитического бета (PRKACB) были в основе ген-ген сетевого взаимодействия. Они могут играть ключевую роль в сети, потому что они обладали самой сильной степени (степень ≫ 25) centralities (ген-генных взаимодействий) (рис 5). Сообщалось, что GST, EGFR и PRKACB отвечают за пути передачи сигналов, участвующих в опухолевом росте и дифференцировке в различных типов раковых заболеваний [42,43].

Джин коэкспрессией Сеть <р> Мы подготовили ген коэкспрессией сети на основе дифференциально экспрессированных генов, белков и белкового комплекса в раковых тканях и незлокачественных (контрольных) тканей, соответственно. По сравнению с контролем, соединения между генами в тканях рака были меньше, что предположение, что большинство физиологических взаимодействий генов-генов и связей в нормальных тканях были сломаны или потеряны в опухолевых тканях (рис 6A и 6B). Гены с высокой степенью и K-ядро, которое означает, что они обладают большинство взаимодействий с другими geneswere известный как ключевых генов в сети взаимодействия (6В), включая TRO, GPR124, TIMP2, EMCN, SLIT3, HTRA1, SPARC, LAMA4 и MEOX2 (Таблица 3). Они были ответственны за клеточной сигнализации, адгезии, ангиогенеза, миграции, роста и метастазирования.

Подтверждение результатов микрочипов КПЦР
<р> Мы провели количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) 6 повышающей регуляции гены (COL1A, BGN, SPP1, Мельк, IGFBP4, SPARC) и 4 вниз регулируемых генов (PGC, SST, MT1X, S100P), чтобы проверить наши данные в желудочном раковых тканей (опухоль) и нераковых тканей (нормальный). Выражение отношения этих 10 генов (Опухоль /Normal) от кПЦР согласуются с данными из микрочипов (S4 таблицы). Она предложила данные экспрессии генов из дифференциальных микрочипов был надежен. Более того, наша команда работала на некоторых дифференциальных генов, таких как PHF10 [55], CEACAM6 [56], SFRP1 [57], SOX11 [58], CLDN1 [59], чтобы исследовать их экспрессии и функции при раке желудка и результаты совершенные доказали нашу данные микрочипов.

Обсуждение
<р> микрочипов экспрессии генов анализы на рак желудка ранее были использованы для прогнозирования диагностических маркеров [60], и определить паттерны экспрессии генов, связанных с прогнозом [ ,,,0],61,62], но он не был использован для выявления молекулярных взаимодействий между lncRNAs и мРНК в GC. В данном исследовании мы проанализировали 26 желудка тканей рака с сопряженными нераковых тканей и профилированные гены дифференциально экспрессируются в соответствии с их категориями GO, путей, Джин-Act сети и коэкспрессией сети.
<Р> Ген были получены результаты экспрессии с помощью микрочипов компании Agilent G3 GE Human 8x60K, которая охватывает не только базы данных транскрипций для мРНК мишеней, но и включает в себя датчики для lncRNAs (длинные некодирующие РНК). Благодаря комбинации мРНК и lncRNAs, он может выполнять два эксперимента на одном микрочипе и предсказать функцию lncRNA и взаимодействие с мРНК. Анализы показали, набор генов, которые были дифференциально экспрессируемых между раком желудка и нормальной тканью. Некоторые из них были зарегистрированы ранее в желудочном или других видов рака. Например, экспрессия gastrokine-2 (GKN2) был значительно понижающей регуляции или отсутствует в желудочном линиях раковых клеток, желудочный кишечной метаплазией и опухолевых тканей. Избыточная экспрессия GKN2 способствовали клеточной пролиферации, миграции и инвазии рака желудка и арестовали клеточного цикла в фазе G1-S перехода [6]. В противоположность этому, уровни экспрессии ингибина бета-А (INHBA) были в ткани рака значительно выше, чем в смежной нормальной слизистой оболочки, и он рассматривается как независимый прогностический фактор при раке желудка [22]. Кроме того, мы обнаружили некоторые новые гены, такие как TMEM184A, PSAPL1, KIAA1199, CLRN3 и FNDC1, которые не были зарегистрированы в раке желудка ранее, и их роли в раке остаются неизвестными.
<Р> Одним из преимуществ наш анализ микрочипов экспрессии генов является то, что она представляет собой выражение lncRNAs и мРНК таким образом, чтобы оба могли быть исследованы вместе. Наша ранее доклад о роли lncRNA H19 и его сети в GC [36] было основано на этом микрочипов данных. Тем не менее, большинство из lncRNAs, таких как DRD5, FMO6P, СНАР-A3 и TPRXL показали в нашем микрочипов не были определены и требуют дальнейшего изучения для выяснения их роли при раке желудка.
<Р> На основе нашего профилирования экспрессии генов данные, гены и их функции активируются при раке желудка были ответственны за пролиферацию, адгезии, миграции и метастазирование, что согласуется с результатами анализов, проводимых с пути. Интересно, что мы обнаружили, что большинство связанных с раком сигнальных путей сообщалось ранее, такие как Notch, МРМ и Ежика были активированы в ГХ на основе наших данных. Эти результаты подтверждают точку зрения, что гетерогенность является характеристикой GC. Сравнение коэкспрессией сети между нормальными тканями и рак предположил, что выражение, функции и взаимодействие большинства физиологических гена были утрачены или повреждены при раке желудка, в то время как пролиферации, миграции и метастазирование были аномально увеличены. Эти интересные результаты в соответствии с характеристиками рака, такие как анаплазии и дифференцировке. Эти дифференциально выраженные гены, участвующие в сигнальных путях выступал в качестве ключевых генов в коэкспрессией сети могут быть потенциальными целями противораковой терапии или диагностических маркеров в будущем.

Поддержка Информация
S1 Таблица. Тропинка анализ дифференциальных генов
DOI: 10.1371 /journal.pone.0125013.s001
(XLSX)
S2 табл. GO анализ дифференциальных генов
DOI: 10.1371 /journal.pone.0125013.s002
(XLSX)
S3 таблицы. Gene-Act сеть дифференциальных генов
DOI: 10.1371 /journal.pone.0125013.s003
(XLSX)
S4 таблице. Грунтовки и проверка
DOI: 10.1371 /journal.pone.0125013.s004
(DOCX)
S5 Таблица. Методы и материалы
DOI: 10.1371 /journal.pone.0125013.s005
(DOCX)

Выражение признательности
<р> Мы хотели бы поблагодарить д-ра Фред Bogott в Austin Medical Center , университет Миннесоты, и д-р Джошуа Ляо в Хормел институте, Остин штата Миннесота, для их английского редактирования этой рукописи. Мы хотели бы поблагодарить спонсоров, чтобы поддержать это исследование. Эта работа была поддержана грантами от Национального фонда естественных наук Китая [No. 81172324, № 91229106, № 81272749 и № 81372231], науке и технике комиссии муниципалитета Шанхая [No. 13ZR1425600], а также ключевых проектов в отечественной науке и Amp; Технология Столб программы Китая (№ 2014BAI09B03).

• PLoS ONE: Анализ выживаемости пациентов с экранированием Интервальный рака Проходят рака желудка при эндоскопии
• PLoS ONE: прогностическое значение матричных металлопротеиназ-7 рака желудка выживания: мета-анализ