PLOS ONE: Caractérisation des gènes exprimés différentiellement impliqués dans les voies associées avec gastrique Cancer

Résumé

Pour explorer les modes d'expression des gènes dans le cancer gastrique, un total de 26 apparié cancer gastrique et les tissus non cancéreux de patients ont été inscrits pour le gène analyse expression microarray. méthodes limma ont été appliquées pour analyser les données, et les gènes ont été considérés comme étant significativement différentiellement exprimés si le taux de découverte False (FDR) valeur est < 0,01, P
-value Was < 0,01 et le facteur de changement (FC) a > 2. Par la suite, Gene Ontology (GO) catégories ont été utilisées pour analyser les principales fonctions des gènes exprimés de manière différentielle. Selon l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et génomes (KEGG) base de données, nous avons trouvé des voies significativement associées aux gènes différentiels. réseau de réseau et co-expression Gene-Act ont été construites respectivement sur la base des relations entre les gènes, les protéines et les composés dans la base de données. 2371 ARNm et 350 lncRNAs considérés comme significativement gènes exprimés de manière différentielle ont été choisis pour l'analyse plus loin. Les analyses GO catégories, la voie et le réseau Gene-Act a montré un résultat cohérent que les gènes régulés à la hausse ont été responsables de la tumorigenèse, la migration, l'angiogenèse et la formation de microenvironnement, alors que les gènes régulés à la baisse ont été impliqués dans le métabolisme. Ces résultats de cette étude fournissent des nouvelles découvertes sur le codage ARNs, lncRNAs, les voies et le réseau co-expression dans le cancer gastrique qui sera utile pour orienter les enquêtes et cibler la thérapie pour cette maladie

Citation:. Li H , Yu B, Li J, Su L, Yan M, Zhang J, et al. (2015) Caractérisation des différentiellement exprimés gènes impliqués dans les voies associées au cancer gastrique. PLoS ONE 10 (4): e0125013. doi: 10.1371 /journal.pone.0125013

Academic Editor: Francisco J. Esteban, Université de Jaén, Espagne

Reçu: 9 Novembre 2014; Accepté 6 Mars 2015; Publié: 30 Avril 2015

Droit d'auteur: © 2015 Li et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et. Tous les fichiers de puces à ADN sont disponibles à partir de l'expression NCBI Gene Omnibus (GEO) base de données (numéro d'accession "GSE65801"; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801).

financement: Ce travail a été soutenu par des subventions pour l'analyse de la national Natural science Foundation de Chine [No. 81172324, n ° 91229106, n ° 81272749, et n ° 81372231], Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai [No. 13ZR1425600] et projets clés dans la National Science & Technologie Programme de pilier de la Chine (n ° 2014BAI09B03). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est l'un des cancers les plus fréquents dans le monde entier, et son incidence est particulièrement élevée en Asie orientale, en particulier en Chine. Environ 952 000 nouveaux cas de cancer de l'estomac ont été diagnostiqués dans le monde en 2012, et la moitié d'entre eux ont eu lieu en Asie de l'Est (principalement en Chine) [1]. En Chine, la majorité des patients atteints de GC sont diagnostiqués à un stade avancé avec un mauvais pronostic. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents la progression de la GC est essentielle à l'identification de biomarqueurs clés et le développement de thérapies ciblées efficaces.

Au cours de la dernière décennie, microarrays d'expression génétique sont devenus un outil commun pour examiner les niveaux de transcription de gènes dans la recherche sur le cancer. les données de biopuces est utilisé pour une grande variété d'analyses, telles que le regroupement sans surveillance, classification, analyse de l'expression différentielle, et la cartographie d'expression quantitative trait loci [2]. Il permet non seulement d'identifier les gènes dysfonctionnels clés dans le cancer, mais fournit des informations sur le génome entier sur l'expression des gènes à un moment aussi bien [3,4]. Dans cette étude, nous avons effectué une enquête sur l'ensemble du génome de l'expression de lncRNAs et ARNm à partir d'échantillons appariés de tissus de cancer gastrique primaire et les tissus non cancéreux, le profil des lncRNAs différentiellement exprimés et ARNs codant. L'étude de ces données fournira des informations précieuses sur le mécanisme de la cancérogenèse et de permettre la découverte de gènes clés qui peuvent agir comme des cibles futures de la thérapie anti-cancer.

Méthodes et

Déclaration éthique de matériaux

Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de tous les participants. L'étude a été approuvée par le Comité de la recherche humaine éthique de l'Hôpital Ruijin, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine.

Des échantillons de tissus

Tissues ont été prélevés dans les carcinomes gastriques primaires de patients non traités qui ont subi D2 gastrectomie radicale à l'hôpital Ruijin de Shanghai. Pour chaque tissu de cancer, un échantillon de tissu non cancéreux apparié a été recueilli à partir de la région adjacente en même temps. La taille de chaque échantillon était d'environ 0.1cm ^{3. Tous les échantillons ont été placés dans RNALater dans les 15 minutes après l'excision et stockées dans de l'azote liquide jusqu'à l'extraction d'ARN. Dans cette étude, 32 tissus appariés ont été recueillies pour la puce et 26 échantillons appariés ont été inscrits pour l'analyse de la prochaine étape de GO, voie et réseau après contrôle de la qualité en utilisant Principal analyse 3D de composants (3D-PCA) et l'analyse de cluster.}

expériences de biopuces

Agilent SurePrint G3 humain GE 8x60K Microarray (Conception ID: 028004) a été utilisé dans cette étude. L'ARN total a été isolé et amplifié en utilisant une faible entrée Amp rapide Labeling Kit, One-Color (Catȇ0-2305, Agilent technologies, États-Unis). Ensuite, les ARNc marqués ont été purifiés par un kit RNeasy (Cat˥06, QIAGEN, Allemagne).

D'après les instructions du fabricant, chaque lame a été hybridée avec 600 ng marqué au Cy3 ARNc en utilisant un kit Gene Expression Hybridation (CatȆ8-5242, Agilent technologies, des États-Unis) et lavé par le Gene expression Wash Buffer Kit (CatȆ8-5327, Agilent technologies, des États-Unis).

Un Agilent Microarray Scanner (Cat # G2565CA, Agilent technologies, États-Unis) et Feature logiciel d'extraction 10.7 (Agilent technologies, des États-Unis) ont été appliquées pour balayer chaque diapositive avec les mêmes paramètres indiqués comme suivre, canal Dye: vert, résolution de numérisation = 3 pm, 20bit. Les données brutes ont été normalisées par l'algorithme quantile, Gene Software Spring 11.0 (Agilent technologies, Etats-Unis) (détaillées au S5 Tableau).

Limma

Les modèles linéaires et des méthodes empiriques de Bayes ont été appliquées pour analyser les données de cette étude. Les résultants P
-values ​​ont été ajustées en utilisant l'algorithme BH FDR. Il y avait trois normes pour nous de considérer qu'un gène a été significativement exprimé de manière différentielle, la valeur FDR était < 0,01, P
-value Was < 0,01 et le facteur de changement est > 2. (Détaillé dans S5 Table)

GO catégorie

Nous avons effectué Gene Ontology (GO) analyse pour analyser les fonctions des gènes exprimés de manière différentielle dans notre microréseau selon la classification fonctionnelle clé du Centre national for Biotechnology information (NCBI). En règle générale, le test exact de Fisher et le χ
^{2 tests ont été appliqués pour classer la catégorie GO, et le taux de fausses découvertes (FDR,) a été calculé pour corriger le P
-value ( N
_{k
se réfère au nombre de test de Fisher P
-values ​​inférieure à la χ
Test 2 P
-values). L'enrichissement Re a été donnée par: Re = ( n
f
/ n
) /( N
f
/ N
) dans les catégories importantes ( N
f
est le nombre de gènes différentiels dans la catégorie particulière, n
est le nombre total de gènes au sein de la même catégorie, n
f
est le nombre de gènes différentiels dans l'ensemble de puces à ADN, et N
est le nombre total de gènes dans le microarray) (détaillé dans S5 Table)}}

analyses Pathway

annotations Pathway des gènes différentiels exressed ont été obtenus à partir de KEGG (http: //www .genome.jp /KEGG /). catégories Pathway avec un FDR < 0,01 ont été marquées. L'enrichissement des voies importantes a été donnée par: enrichissement = /, qui nous a permis de localiser les voies les plus importantes dans notre étude ( n
_{g
est le nombre de gènes différentiels dans le voie particulière, n
un
est le nombre total de gènes au sein de la même voie, N
g
est le nombre de gènes différentiels qui comportent au moins une annotation de la voie, et N
un
est le nombre de gènes qui ont au moins une annotation de la voie dans l'ensemble de puces à ADN). (détail S5 Tableau).}

réseau Gene-Act

Selon la base de données KEGG, un gène peut être impliqué dans plusieurs voies ou interagir avec plusieurs autres gènes. Toutes les interactions entre les gènes ont été regroupées pour construire le réseau Gene-Loi sur la base des voies différentielles, ce qui nous a permis de révéler les voies de signalisation et des gènes régulateurs clés de GC.

Co-expression réseau

Réseau co-expression génique a été construit selon l'intensité du signal normalisé de gènes d'expression spécifiques. Degré central est défini comme le nombre de liaisons comporte un noeud à un autre, ce qui détermine l'importance relative des gènes. De plus, k-carottes ont été appliqués en tant que méthode de simplification de l'analyse de la topologie du graphe. facteurs de régulation de base (gènes) qui ont les plus hauts degrés relient la plupart des gènes adjacents et de construire la structure du réseau (détaillées au tableau S5).

quantitative en temps réel
PCR

L'ARN total a été extrait à partir de tissus en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Le temps réel la réaction en chaîne par polymérase (PCR) quantitative a été réalisée en utilisant SYBR vert PCR Master Mix en temps réel rapide PCR 7500 Système (Applied Biosystems). Les amorces des 10 gènes ont été présentées dans le Tableau S4. Les réactions de PCR ont été réalisées à 50 ° C pendant 2 min, puis 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 1 min. ACt a été calculé en soustrayant le Ct de la β-actine de l'ARN (témoin) à partir du Ct de l'ARN de l'échantillon, respectivement. ΔΔCt a ensuite été calculé en soustrayant le ACt du contrôle de la ACt de l'échantillon. Pliez le changement a été calculé par l'équation 2-ΔΔCt.

L'analyse statistique

logiciel SPSS 19 et Microsoft Excel 2010 a été utilisé pour analyser les données. Les niveaux d'expression entre les tissus cancéreux et les tissus non cancéreux adjacents ont été analysés par des tests t-des échantillons appariés. P
-values ​​inférieure à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
de

Résultats des analyses de biopuces

Au total, 42,405 gènes humains ont été profilées dans notre étude en utilisant une puce à ADN Agilent G3 GE humaine 8x60K. Nous avons soumis notre jeu de données dans le référentiel de "Gene Expression Omnibus" et le numéro d'adhésion était "GSE65801" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801). Nous avons utilisé des modèles linéaires et des méthodes empiriques de Bayes pour analyser les données (voir Méthodes). Il y avait 2371 et 350 ARNm lncRNAs considérés comme les gènes exprimés de manière différentielle par limma pour l'analyse suivante-étape (figure 1A).

Parmi tous les 2371 ARNm différentielles, il y a 1142 ARNm down-régulés et 1229 mARN amont régulée dans notre observation sur les altérations de l'expression génique entre le cancer gastrique et les tissus témoins (figure 1C). La plupart des ARNm différentiels ont été révélés être en corrélation avec la carcinogenèse et les métastases dans la plupart des types de cancer (tableau 1). Les gènes tels que GKN2, PGC, MUC6, CHIA, PSCA et FBP2 étaient parmi les 20 gènes régulés à la baisse, tandis que KLK8, SFRP4, INHBA, CLDN1, CST1, FAP, SPP1, OLFM4 et KRT17 étaient parmi les 20 premiers jusqu'à des gènes régulés (tableau 1). Cependant, certains gènes tels que HOXC9, FNDC1, STRA6, KCNE2, PGA3 et KCNJ16 n'a été signalé dans le cancer gastrique et leurs rôles demeurent inconnus (tableau 1).

De plus, nous avons trouvé 193 régulé vers le bas lncRNAs et 156 lncRNAs régulés à la hausse parmi un total de 350 lncRNAs différentielles sur la base du profilage (figure 1B). La plupart des lncRNAs ont pas été donné un nom officiel et leurs fonctions restent inconnues. Cependant, certains ont été signalés à jouer un rôle critique dans le cancer, tels que H19, GUCY1B2, MEG3 et AKR7L (tableau 2).

Dans notre précédent rapport [36], le facteur de changement (FC) de H19 dans 74 cancer de l'estomac contre les tissus noncancerous appariés était 6.015, avec un P
-value de 0,017. Ce résultat est cohérent avec les données de H19 (Absolute FC = 6,06) dans les analyses de cette microarray. En outre, la surexpression de H19 contribue à la prolifération, la migration, l'invasion et les métastases du cancer gastrique.

catégories Gene Ontology

Tous les gènes exprimés de manière différentielle ont été classés en différentes catégories fonctionnelles selon le Gene Ontology (GO) projet pour les processus biologiques. Sur la base de nos données de biopuces, GO analyses ont indiqué que 208 termes GO ont été enrichis ( P
< 0,01, FDR < 0,01) (S1 Table). Les catégories de GO primaires pour 170 termes GO régulés à la hausse ont été axées sur l'adhésion cellulaire, l'angiogenèse, le développement de l'organisme multicellulaire, guidage axonal, le développement du système squelettique, le collagène organisation de fibrilles, une régulation positive de l'angiogenèse, blessant et la régulation négative de la prolifération cellulaire (figure 2A) . Les principales catégories de GO pour les gènes régulés à la baisse ont été la digestion, le métabolisme des xénobiotiques, transport transmembranaire, le transport d'ions, petit processus métabolique molécule, la régulation négative de la croissance, le métabolisme du glutathion, la réponse cellulaire aux ions de cadmium et de processus métaboliques (figure 2B).

Selon les gènes et les fonctions différentielles, nous avons construit un arbre GO pour explorer les interactions entre toutes les catégories différentielles GO. La diversité de ces catégories lorsque l'on compare les tissus cancéreux et de contrôle a suggéré que le cancer gastrique peut être associé de manière significative régulée à la hausse la migration cellulaire, la prolifération cellulaire, l'angiogenèse, l'adhérence cellule-cellule et des récepteurs de surface cellulaire des voies de signalisation, tandis que les processus du métabolisme cellulaire et le transport transmembranaire d'ions sont régulés à la baisse (figure 3).

analyse Pathway

analyses Pathway ont été utilisées pour identifier les voies significatives associées aux gènes exprimés de manière différentielle selon KEGG. Il y avait 32 voies régulés à la hausse et 31 voies régulés à la baisse sur la base de nos données (figure 4). En outre, le profilage de la voie était compatible avec les résultats pour les catégories GO dans les fonctions biologiques liées au cancer. Nos données ont montré certains gènes différentiels hautement régulés à la hausse qui suggéraient leurs voies concernées ont été Activiated. Par exemple, SFRP4, Wnt11, FZD2, MYC sont fortement exprimés dans les tissus cancéreux qui représentent la voie Wnt est Activiated et BCL2A1, ICM1, TNFSF14 dans la voie NF-kB était fortement exprimé aussi. La plupart des voies de signalisation liées au cancer telles que JAK /STAT, Wnt, NF-kB, la PI3K, mTOR, Hedgehog et des voies de Notch ont été activés dans le cancer gastrique par rapport aux tissus non cancéreux à base de nos données (S2 tableau). Les voies régulés à la hausse qui ont été axées sur l'adhésion cellulaire, la dysrégulation de la transcription, la carcinogenèse et la différenciation ont été corrélées avec tumorogénèse et les métastases (Fig 4A). Cependant, les voies de bas réglementés étaient généralement responsables du métabolisme (figure 4B).

Gene-Act réseau

Sur la base de catégories GO et l'analyse des voies, un gène peut être impliqué dans plusieurs voies ou interagir avec plusieurs autres gènes. Nous avons regroupé les gènes différentiels et construit un réseau des interactions des gènes exprimés de manière différentielle. Une protéine de degré élevé réglemente ou est régulée par de nombreuses autres protéines, ce qui implique un rôle important dans le réseau (S3 Tableau) Gene-Act. Le glutathion S-transférase (GST) de la famille, le cytochrome P450 (CYP), UDP glucuronosyltransferase 2 (UGT2) famille, Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) de la famille et de l'AMPc-protéine kinase dépendante de bêta catalytique (PRKACB) étaient au cœur de la gène-gène de réseau d'interaction. Ils peuvent jouer un rôle clé dans le réseau parce qu'ils possédaient le degré le plus fort (degré > 25) centralités (interactions gène-gène) (figure 5). Il a été rapporté que la TPS, EGFR et PRKACB sont responsables de voies de transduction du signal impliqués dans la croissance tumorale et la différenciation dans différents types de cancers [42,43].

Gene co-expression réseau

nous avons produit un réseau de gènes co-expression sur la base des gènes, des protéines et des protéines exprimées de manière différentielle complexe dans les tissus cancéreux et les tissus (témoins) non cancéreuses, respectivement. Par rapport à la commande, les liens entre les gènes dans les tissus cancéreux étaient moins, ce qui suggère que la plupart des interactions et des liens gène-gène physiologiques dans les tissus normaux avaient été cassé ou perdu dans les tissus cancéreux (figure 6A et 6B). Les gènes ayant un degré élevé et k-core ce qui signifie qu'ils possédaient la plupart des interactions avec d'autres geneswere connu comme gènes clés dans le réseau d'interaction (figure 6B), y compris TRO, GPR124, TIMP2, EMCN, Slit3, HTRA1, SPARC, LAMA4 et Meox2 (Tableau 3). Ils étaient responsables de la signalisation cellulaire, l'adhérence, l'angiogenèse, la migration, la croissance et la métastase.

Confirmation des résultats de puces à ADN par qPCR

Nous avons effectué Quantitative PCR en temps réel (qPCR) sur 6 régulés à la hausse gènes (col1a, BGN, SPP1, Melk, IGFBP4, SPARC) et 4 gènes régulés vers le bas (PGC, SST, MT1X, S100P) pour vérifier nos données dans les tissus gastriques de cancer (tumorales) et les tissus non cancéreux (normal). Les rapports de ces 10 gènes (tumeur /normal) provenant qPCR de l'expression sont identiques à ceux de puces à ADN (S4 tableau). Il a suggéré que les données de gènes différentiels expression de microarray était fiable. Quoi de plus, notre équipe a été travaillé sur certains des gènes différentiels tels que PHF10 [55], CEACAM6 [56], SFRP1 [57], SOX11 [58], CLDN1 [59] pour étudier leur expression et fonctions dans le cancer gastrique et les résultats parfaits prouvé nos données de microréseau.

analyses Discussion

biopuces d'expression du gène sur le cancer gastrique ont été précédemment utilisés pour prédire les marqueurs de diagnostic [60] et d'identifier les profils d'expression des gènes associés à un pronostic [ ,,,0],61,62], mais il n'a pas été utilisé pour révéler des interactions moléculaires entre lncRNAs et les ARNm en GC. Dans cette étude, nous avons analysé 26 tissus de cancer gastrique avec des tissus noncancerous appariés et profilées les gènes exprimés de manière différentielle en fonction de leur catégorie GO, les voies, le réseau de réseau Loi de Gene et co-expression.

Le gène résultats d'expression ont été obtenus en utilisant une puce à ADN Agilent G3 GE humaine 8x60K, qui couvre non seulement les bases de données pour les cibles d'ARNm transcriptomiques, mais comprend également des sondes pour lncRNAs (longues ARN non codants). Avec la combinaison de l'ARNm et lncRNAs, il peut effectuer deux expériences sur une seule puce à ADN et de prédire la fonction lncRNA et l'interaction avec les ARNm. Les analyses ont révélé un ensemble de gènes qui ont été exprimés de manière différentielle entre le cancer gastrique et les tissus normaux. Certains d'entre eux ont été signalés précédemment dans les cancers gastriques ou d'autres. Par exemple, l'expression de gastrokine-2 (GKN2) est significativement régulée à la baisse ou absente dans des lignées de cellules gastriques, du cancer gastrique, une métaplasie intestinale et les tissus tumoraux. Surexpression de GKN2 contribué à la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion du cancer gastrique et arrêté le cycle cellulaire à la phase de transition G1-S [6]. En revanche, les niveaux d'expression de l'inhibine beta A (INHBA) étaient significativement plus élevés dans le tissu cancéreux que dans la muqueuse normale adjacente, et il est considéré comme un facteur pronostique indépendant dans le cancer gastrique [22]. En outre, nous avons découvert quelques nouveaux gènes, tels que TMEM184A, PSAPL1, KIAA1199, CLRN3 et FNDC1, qui n'a pas été rapporté dans le cancer gastrique précédemment, et leur rôle dans le cancer reste inconnue.

L'un des avantages de notre expression génique analyse des microréseaux est qu'il représente l'expression de lncRNAs et ARNm de telle sorte que les deux pourraient être étudiés ensemble. Notre rapport précédemment sur le rôle des lncRNA H19 et son réseau en GC [36] était fondée sur ces données de puces à ADN. Cependant, la plupart des lncRNAs tels que DRD5, FMO6P, SNAR-A3 et TPRXL montré dans notre microréseau ont pas été identifiés et ont besoin d'une enquête plus approfondie afin de clarifier leur rôle dans le cancer gastrique.

Sur la base de notre profil d'expression génique données, les gènes et leurs fonctions activées dans le cancer gastrique ont été responsables de la prolifération, l'adhésion, la migration et la métastase, ce qui était cohérent avec les résultats des analyses de la voie. Fait intéressant, nous avons découvert que la plupart des voies de signalisation liées au cancer signalés précédemment tels que Notch, mTOR et Hedgehog ont été activés en GC sur la base de nos données. Ces résultats soutiennent le point de vue que l'hétérogénéité est la caractéristique de GC. Comparaison du réseau co-expression entre les tissus normaux et le cancer a suggéré que l'expression, les fonctions et les interactions de la majorité des gènes physiologiques ont été perdues ou endommagées dans le cancer gastrique, tandis que la prolifération, la migration et les métastases ont été anormalement améliorées. Ces résultats intéressants correspondent aux caractéristiques du cancer, tels que anaplasia et dédifférenciation. Ces gènes différentiellement exprimés impliqués dans les voies de signalisation ont agi comme gènes clés dans le réseau co-expression pourraient être les cibles potentielles de la thérapie anti-cancer ou des marqueurs de diagnostic dans le futur.

Informations complémentaires
Tableau S1. Les analyses Pathway de gènes différentiels
doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s001
(XLSX)
Tableau S2. GO analyse de gènes différentiels
doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s002
(XLSX)
Tableau S3. Gene-Act réseau de gènes différentiels
doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s003
(XLSX)
Tableau S4. Amorces et vérification
doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s004
(DOCX)
S5 Table. Méthodes et matériel de la doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s005
(DOCX)

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Fred Bogott au Centre médical Austin , Université du Minnesota, et le Dr Joshua Liao à l'Institut Hormel, Austin du Minnesota, pour leur édition anglaise de ce manuscrit. Nous tenons à remercier les bailleurs de fonds pour appuyer cette étude. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation naturel de la Chine [No. 81172324, n ° 91229106, n ° 81272749, et n ° 81372231], Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai [No. 13ZR1425600] et projets clés dans la National Science & Technologie Programme de pilier de la Chine (n ° 2014BAI09B03).

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