PLOS ONE: ADN metilado XAF1 circulante Indica mal pronóstico para gástrico Cancer

Extracto

Antecedentes

ADN metilado en los fluidos puede ser un biomarcador adecuado para pacientes con cáncer. XAF1
se ha demostrado que con frecuencia las reguladas en el cáncer gástrico humano (GC). A continuación, se investigó si XAF1
metilación en GC podría ser un biomarcador útil.

Métodos

En tiempo real RT-PCR se utilizó para detectar XAF1
expresión de ARNm; inmunohistoquímica y transferencia de Western se utilizaron para examinar la expresión de proteínas en los tejidos XAF1 GC (n = 202) y sus correspondientes tejidos normales histológicos para-cancerosos (PCHNTs). se utilizó en tiempo real específica de metilación-PCR para investigar XAF1
promotor de la metilación en el mismo grupo de tejidos GC, sus PCHNTs y sueros.

Resultados

Nos confirmó frecuentes XAF1
regulación a la baja, tanto en los niveles de proteína en los tejidos GC ARNm y en comparación con los controles y PCHNTs normales. XAF1
hipermetilación se evidenció en 83,2% (168/202) de los tejidos GC y 27,2% (55/202) de PCHNTs, mientras que no metilación se detectó en los 88 controles normales. El nivel de metilación en los tejidos GC fue significativamente más alta que en PCHNTs ( p < 0,05
). La hipermetilación de XAF1
correlacionó significativamente con la baja regulación de XAF1 Hoteles en tejidos GC, tanto en los niveles de ARNm y proteínas ( p Hotel < 0,001 cada uno). Por otra parte, se detectó alta frecuencia de XAF1
metilación (69,8%, 141 de 202) en los ADN de suero de los mismos pacientes, mientras que los ADN de sueros de 88 controles no tumorales fueron negativos para XAF1
metilación. El XAF1
metilación en ambos tejidos GC y en el suero podría ser un buen biomarcador para el diagnóstico de GC (AUC = 0,85 para el tejido y el AUC = 0,91 para sueros) y se correlacionó significativamente con peor pronóstico ( p Hotel < 0,001). Además, después de la cirugía negativo a positivo transición de XAF1
metilación en los sueros fuertemente asociada con la recurrencia del tumor.

Conclusiones

1) La disfunción de XAF1
es frecuente y se regula a través promotor XAF1
hipermetilación; 2) La detección de circulante metilado XAF1
ADN en el suero puede ser un biomarcador útil para el diagnóstico, la evaluación de los resultados del paciente (pronóstico y la recurrencia) para los pacientes con cáncer gástrico

Visto:. Ling ZQ, Lv P , Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) circulantes metilado XAF1
ADN Indica Mal pronóstico para el cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10.1371 /journal.pone.0067195

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 12 Marzo, 2013; Aceptado: 16-may de 2013; Publicado: 27 Junio ​​2013

Derechos de Autor © 2013 Ling et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación fue apoyado por una subvención del proyecto de la ciencia y la tecnología general de la provincia de Zhejiang (n. ° 2009C33143), y en parte por una subvención del Talento Backbone de Medicina Provincial de Zhejiang y programas de higiene de la plataforma (n. ° 2011RCA009). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es uno de los cánceres más comunes en china, con una alta incidencia y mortalidad, aproximadamente representa el 10% de todos los tumores malignos [1]. tumorigénesis gástrico es un proceso complicado, de múltiples etapas que implica alteraciones de muchos genes [2]. Metilación aberrante promotor es uno de los principales mecanismos para silenciar algunos genes supresores de tumores y genes relacionados con el tumor y juega un papel muy importante en la patogénesis y la progresión de los cánceres humanos [3], [4] - [6], incluyendo el cáncer gástrico [7] , [8]. Mientras tanto, los datos de la acumulación sugiere fuertemente que la metilación del ADN podría ser biomarcador útil y de gran alcance en la evaluación de riesgo de cáncer [5], [7], el diagnóstico precoz [7], predecir el pronóstico de los pacientes [7], [8], y la evaluación de la sensibilidad a la fármacos quimioterapéuticos [9]. Nuestro estudio reciente y otras investigaciones demostraron que la detección de ADN metilado que circula en la sangre es un enfoque potente y práctica para pacientes con cáncer [7], [10], [11].

ligada al X inhibidor de la apoptosis ( XIAP
) -asociado el factor 1 ( XAF1
) es un regulador negativo de la novela XIAP
, que invierte la función de protección de XIAP en células tumorales [12] - [14]. La pérdida de XAF1
expresión será hacer que las células tumorales resistencia a la apoptosis y promover la supervivencia de las células tumorales [14] - [17]. La disfunción de XAF1
ha sido reportado en varios cánceres humanos probablemente a través de la metilación del promotor [15] - [19], lo que sugiere su importancia en la tumorigénesis. En el cáncer gástrico humano, XAF1
se ha informado de que con frecuencia y significativamente las reguladas y esto baja regulación de XAF1
probablemente a través de la hipermetilación del ADN de los sitios específicos CpG [15], [16 ], [18]. Sin embargo, ningún informe está disponible de XAF1
metilación en sangre y su potencialidad como un biomarcador. En el presente estudio se analizaron XAF1
promotor de la metilación en muestras de tejido y pareadas de suero de un gran grupo de pacientes con cáncer gástrico, y se evaluaron circulante metilado XAF1
como un biomarcador potencial para el cáncer gástrico .

material y Métodos

Declaración de Ética

muestras de tejidos humanos identificados-dE y los sueros se obtuvieron de la provincia de Zhejiang Banco de tejidos humanos de muestras. El uso de las muestras fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Cáncer de la provincia de Zhejiang. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente de acuerdo con los requisitos del Consejo de Ética de nuestra institución. 88 voluntarios no cancerosas escrito el consentimiento informado. Parte de las muestras eran de Hospital Popular de la provincia de Zhejiang y el Hospital de las primeras personas de Chunan Condado. La Junta de Revisión Institucional de Ética Médica del Hospital Popular de la provincia de Zhejiang y el Hospital de las primeras personas de Chunan Condado aprobó el método de obtención de la muestra incluyendo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes, respectivamente.

Tejido de muestras

tejidos normales histológicos de tumores y para-cancerosos pareadas (PCHNT) muestras se recogieron en el momento de la cirugía de 202 pacientes con adenocarcinoma gástrico primario en el hospital de la provincia de Zhejiang cáncer, hospital de Zhejiang Popular de la provincia y el hospital de las primeras personas de Chunan Condado a partir de enero de 2008 a diciembre 2009. el PCHNT se evaluó microscópicamente la presencia de células normales y la ausencia de las células displásicas. Ninguno de estos casos había sido sometido a ningún tratamiento médico antes de la cirugía. Los parámetros demográficos, clínicos e histopatológicos de estos casos se muestran en la Tabla 1. El patrón de crecimiento de las células tumorales se determinó de acuerdo con la clasificación de Ming [20]. Todos los pacientes reclutados habían sido objeto de seguimiento periódicamente hasta la fecha de vencimiento. muestras de biopsia de la mucosa del antro de 88 voluntarios que no tienen cáncer de gastroscopia fueron recogidos al azar como controles en el mismo plazo, incluyendo 54 hombres y 34 mujeres, con una edad media de 52,9 años de edad. Entre estos voluntarios, 48 ​​pacientes fueron diagnosticados con la gastritis no atrófica crónica. Mientras tanto, se recogieron muestras pareadas de suero antes de la cirugía o endoscopia.

Análisis de Helicobacter Pylori ( H. Pylori
) Infección

Las biopsias se obtuvieron de todos los pacientes que tuvieron un examen endoscópico . H
. Estado pylori
se determinó mediante la prueba de ureasa rápida y métodos de tinción Giemsa [21], [22]. Se consideró como H
. pylori
cuando ambas pruebas fueron positivos, y se excluyeron las muestras con un solo positivo para el análisis estadístico [22].

Real-time RT-PCR

La expresión del ARNm de XAF1
se analizó por tiempo real de RT-PCR [23]. ARN totales se extrajeron mediante el Trizol (Gibco). Un total de 3 g ARN totales se sometió a transcripción inversa utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Promega). El gliceraldehído fosfato deshidrogenasa ( GAPDH
) fue seleccionada como la referencia interna. Las secuencias de XAF1
cebadores fueron los siguientes: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R) 5' GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3 '. GAPDH
secuencias de los cebadores fueron los siguientes: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. El 2 Se utilizó el método ^{-ΔΔCt para calcular cambios relativos en la expresión génica.}

tinción inmunohistoquímica

La expresión de la proteína XAF1 se determinó mediante análisis inmunohistoquímico con anticuerpo monoclonal XAF1 (Santa Cruz Biotechnology ). La tinción inmunohistoquímica para XAF1 se llevó a cabo utilizando muestras representativas incluidas en parafina a partir de los 202 pacientes con cáncer gástrico. Después de desparafinación, recuperación de antígeno en tampón de citrato 0,01 M, y la inactivación de la actividad de peroxidasa endógena en 3% H _{2O 2 /metanol, se incubaron los portaobjetos con anticuerpos para XAF1 a 4 ° C durante la noche, y la tinción inmunohistoquímica, siguiendo una técnica compleja avidinbiotin-peroxidasa estándar, se llevó a cabo usando 3,3'-diaminobencidina (DAB) como cromógeno. Los núcleos se counterstained con hematoxilina. La puntuación de tinción inmunohistoquímica (ISS) se determina por tres patólogos independientes que combinan la frecuencia y la intensidad de tinción de la siguiente manera [24], [25]: no tinción se puntuó como 0, 1~10% de células teñidas anotó como 1, 11~50% como 2, 51~80% como 3, y 81~100% como 4. intensidad de la tinción se califica en una escala de 0 a 3, con 0, negativo; 1, débil; 2, moderado; y 3, fuerte. Cuando hay inmunorreactividad multifocal y hay diferencias significativas en la intensidad de la tinción entre focos, se registró el promedio de la menos intensa y más intensa tinción. Los datos brutos se convirtieron a la ISS multiplicando la puntuación de frecuencia y la puntuación de la intensidad de la tinción. En teoría, la ISS podría variar de 0 a 12. Un ISS de 9~12 inmunoreactividad fuerte fue considerado, 5~8 se consideró moderada, 1~4 se consideró débil y 0 fue marcado como negativo. Las secciones en las que la tinción no podía estar bien caracterizadas fueron considerados equívoca.}

juegos de análisis Western Blot

En combinación tumorales y PCHNT de 20 casos fueron seleccionados al azar de 202 pacientes con cáncer gástrico para el análisis de Western blot. La proteína total se extrajo y se cuantifica luego utilizando el método de Lowry [26]. Western blot se realizó utilizando anticuerpos monoclonales anti-XAF1 (Santa Cruz, CA) de acuerdo con el informe anterior [6]. β-tubulina se sirve como un control interno.

Extracción de ADN, bisulfito de modificación y la metilación en tiempo real específica-PCR (MSP)

Las secciones seriadas 5 mm que contenían carcinoma y no neoplásico los tejidos se montaron en portaobjetos de vidrio no recubiertos y se secaron a 37 ° C durante la noche. Después de deparaffinization y tinción con hematoxilina y eosina (H & E), se recogieron 5.000 núcleos de 5 a 10 secciones en serie utilizando una aguja 27G. Los núcleos recogidos fueron tratados con 40 ml de 200 mg /ml de proteinasa K (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) a 42 ° C, durante 72 hr. La tecnología de perlas paramagnéticas (kit AxyPrep Mag Blood gDNA, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) se utilizó para aislar el ADN genómico a partir de sangre fresca de acuerdo con el protocolo del kit. El protocolo consiste en la siguiente etapa: la lisis, la unión, lavado y elución. Los contaminantes se eliminan durante las etapas de unión y de lavado. La calidad del ADN se evaluó por la relación A260 /280 en espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), la integridad del ADN se comprobó mediante electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa.

ADN fueron modificados por bisulfito de sodio utilizando el kit EpiTect bisulfito (Qiagen Inc.) siguiendo las instrucciones de manufactura. Los ADN modificados se analizaron mediante MSP-tiempo real en el ABI7500 PCR (ABI Co.) usando el kit de SYBR Premix Taq ExTaq (Takara Co. Ltd). XAF1
metilación y no metilación primers específicos fueron diseñadas de la siguiente manera: XAF1 gratis (MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'-CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1 gratis (UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. Se utilizó el ADN genómico humano (NEB) tratado por LICE metiltransferasa in vitro como un control positivo. Se utilizó un ADN de sangre periférica de un sujeto sano como control negativo. El porcentaje de ADN metilado en las muestras se calcula de acuerdo con las referencias anteriores como se describe [27], [28]. índice metilado ADN se obtuvo de acuerdo con el porcentaje de metilación del ADN; 0, < 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; y 4, > 80%. El resultado del índice de 0 se considera como no metilación del ADN y anota 1-4 se consideraron hypermethylated, respectivamente [7], [27]. El corte umbral del 20% para la hipermetilación del ADN se basa en muestras de control normales y controles internos de calidad obtenidos en el análisis de MSP en tiempo real.

Cultivo de células y medicamentos para el tratamiento

líneas celulares de cáncer gástrico Humanos (AGS y KATO-III) se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U /ml de penicilina, y 100 U /ml de estreptomicina a 37 ° C y 5% de CO _{2, respectivamente. Las células cultivadas se trataron con 5-aza-2 'desoxicitidina (5-Aza-CdR) (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 1,0 mol /L. La tricostatina A (TSA) (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 20 ng /ml se administró después del tratamiento 5-Aza o solo durante 24 h. Las células se recogieron y se sometieron a ADN, ARN y la purificación de proteínas y análisis posteriores.}

Análisis estadístico

SPSS 17,0 software estadístico se adoptó para el análisis de datos. Contando las comparaciones de datos entre los grupos fueron sometidos a la χ
^{2 y el test exacto de Fisher. El análisis de supervivencia se computadorizada mediante el método de Kaplan-Meier y niveles significativos fueron evaluados mediante la prueba de log-rank. Se utilizó un análisis univariante con el modelo de regresión de Cox para determinar los factores pronósticos identificados, y se utilizó el análisis multivariado con el modelo de regresión de Cox para explorar los efectos combinados. Para todos los análisis estadísticos, p
valores. ≪ 0,05 se consideraron significación estadística}

Resultados

El descenso de regulación de Hoteles en XAF1 gástrico primario los tumores

Para investigar XAF1
perfil de expresión génica, se analizó la expresión del ARNm de XAF1
en 88 voluntarios que no tienen cáncer, y 202 cáncer gástrico tejidos primarios y sus correspondientes PCHNTs. Como se muestra en la Figura 1A, el XAF1
expresión se redujo significativamente en las muestras de cáncer gástrico en comparación con la de los controles y PCHNTs normales ( p < 0,001
). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en XAF1
expresión en PCHNTs en comparación con los controles sin cáncer.

Además, XAF1
expresión fue significativamente menor en los tumores avanzados (estadio III /IV) que en los tumores en fase inicial (fase I /II) ( p <
0,0001, Figura S1 a), y fue significativamente menor en los tumores poco diferenciados de aquel en el pozo /tumores moderadamente diferenciados ( p <.
0,0001, Figura S1 B)

Para comprobar el nivel de proteína XAF1 en tejidos de cáncer gástrico, se realizó un análisis inmunohistoquímico de los 202 tejidos de cáncer gástrico y sus PCHNTs correspondientes. XAF1 expresión nuclear era constantemente presente en el epitelio gástrico normal con puntajes altos inmunorreactivas. La expresión de la proteína se detectó en XAF1 alto nivel en 97,5% (197/202) de PCHNTs (Figura 1B). Sin embargo, la alta expresión de la proteína XAF1 sólo se detectó en el 16,8% (34/202) de los tejidos de cáncer gástrico; mayoría de los tejidos de cáncer gástrico fueron ausente o a un nivel bajo de proteína XAF1 (Figura 1C). Los hallazgos inmunohistoquímicos se resumen en la Tabla 1. La puntuación de tinción inmunohistoquímico en tejidos de cáncer gástrico fue significativamente menor que en PCHNTs o en los controles normales ( p < 0,0001
, la Figura 1D). La pérdida de proteínas XAF1 correlacionó significativamente con H. pylori
infección, el tamaño del tumor, la diferenciación histológica, la invasión linfática, invasión venosa, la profundidad invasiva, metástasis ganglionares, metástasis a distancia y el estadio clínico (Tabla 1) (todos los p < 0,05
)
.

Los resultados inmunohistoquímicos de 20 tejidos de cáncer gástrico se confirmaron adicionalmente por medio de análisis de transferencia Western. Los resultados de transferencia de Western representativas en dos casos se muestran en la Figura 1E. La cantidad relativa de expresión de la proteína XAF1 se normalizó a la β-tubulina de las mismas muestras. El nivel promedio de proteína XAF1 en 20 tejidos de cáncer gástrico fue significativamente menor que en PCHNTs ( p Hotel < 0,05). (Figura 1F)

hipermetilación del promotor de XAF1
en gástrico primario tumores

para investigar los mecanismos moleculares de la XAF1
silencio en los cánceres gástricos, se aplicó una tecnología MSP en tiempo real para estudiar el estado de metilación del ADN de XAF1
promotor. La frecuencia de XAF1
hipermetilación en los tejidos de cáncer gástrico, PCHNTs correspondientes y los controles no cancerosas fueron 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) y 5,7% (5/88), respectivamente. La frecuencia de hipermetilación de XAF1
en los cánceres es significativamente más alta que en PCHNTs y controles sin cáncer (todo el p Hotel < 0,0001, Figura 2).

Es de destacar , el estado metilado de XAF1
correlacionó significativamente con algunos parámetros clínico-patológica en el cáncer gástrico, tales como la metástasis de los ganglios linfáticos, la T-etapa, H
. pylori
, etc (todo el p < 0,05
, Tabla 2). No hay correlación significativa entre la hipermetilación de XAF1
y el género, la edad al momento del diagnóstico, se evidenció sitio del tumor y la metástasis distante (todo el p Hotel > 0,05). (Tabla 2)

XAF1
hipermetilación del promotor está asociado con su silenciamiento transcripcional en las células del cáncer gástrico

Para examinar las relaciones entre los XAF1
metilación y XAF1
expresión, se comparó la XAF1
nivel de metilación con XAF1
nivel niveles de ARNm y proteínas determinarán bien mediante análisis inmunohistoquímico (Figura 3A) o Western Blot (Figura 3B) por el análisis de correlación de Spearman. Como se muestra en la figura-3A, la expresión de proteínas XAF1 (determinado por análisis inmunohistoquímico) en 202 tejidos GC se correlacionó estrechamente con XAF1
nivel de ARNm [lg (T /N)] (determinado por RT-PCR) ( γ
= 0,841, p < 0,0001
). Más importante, XAF1
nivel de metilación se asoció significativamente con XAF1
nivel de ARNm ( γ
= - 0,846, p < 0,0001
) y la proteína XAF1 nivel ( γ
= -0.969, p < 0,0001
). Se obtuvieron resultados similares cuando se analiza la correlación de XAF1
la metilación del promotor y de la expresión de la proteína XAF1 determinada por Western blot (Figura 3B). Estos resultados fuertemente acusadas que XAF1
expresión está regulada por el promotor de XAF1
metilación.

5-Aza-CdR Administración Restaura la expresión de XAF1

Para confirmar aún más la regulación epigenética de XAF1
expresión, células AGS y Kato-III fueron tratados con 5-Aza-CdR y /o TSA. XAF1
expresión de ARNm se reactivó en ambas líneas celulares de cáncer gástrico, acompañado por desmetilación de XAF1
promotor (Figura 4), lo que indica que XAF1
es silenciado transcripcionalmente en estas células por hipermetilación del ADN. Curiosamente, el tratamiento TSA solo fue eficaz en la restauración de XAF1
expresión en AGS y Kato-III, sin cambio significativo de XAF1
nivel de metilación, lo que sugiere que las modificaciones de las histonas también puede estar implicada en la regulación de XAF1
expresión. Sin embargo, la administración de TSA tras 5-aza-CDR tuvo un efecto aditivo en la restauración de la expresión de genes con una mayor disminución en el nivel de metilación de XAF1
. Estos resultados están de acuerdo con estudios recientes que sugieren que la TSA puede tener un efecto desmetilación de un modo específico del gen [5]. El análisis de transferencia Western utilizando células AGS, como modelo, confirmó la sobre regulación de las proteínas siguientes XAF1 el 5-Aza-CdR tratamientos /TSA 5-aza-CDR y (Figura 4).

Detección de circulante XAF1
metilación

Hemos detectado alta frecuencia de XAF1
metilación en cáncer gástrico primario (83,2%), lo que sugiere que puede ser un buen marcador biológico si XAF1
metilación podría ser detectable en el suero. Por lo tanto, hemos examinado XAF1
metilación en los ADN de suero coincidentes de los 202 pacientes con cáncer gástrico. XAF1
metilación se detectó en 141 (69,8%) los ADN de suero de los 202 pacientes con cáncer gástrico (Figura 5). Por el contrario, XAF1
metilación no se detectó ADN en suero de los 88 controles sin cáncer.

A continuación, se confirmó la consistencia en el XAF1
metilación entre los tejidos tumorales y suero correspondiente. En 168 casos que mostraron XAF1
metilación en los tejidos tumorales, 141 visualiza XAF1
metilación en su suero emparejado, dando una consistencia de 83,9% entre ellos. Y en los 34 pacientes con cáncer gástrico sin XAF1
metilación en sus tejidos con cáncer gástrico, sin metilación se encontró en todos los ADN de suero (Figura S2).

XAF1
metilación como un biomarcador para el diagnóstico del cáncer gástrico

Para evaluar el valor de XAF1
metilación como un biomarcador para el diagnóstico de GC, que trazan características operativas del receptor (ROC) curvas y el área bajo la curva calculada (AUC) valores utilizando datos de la metilación del ADN de ambos tejidos GC y sueros. Tanto los análisis de la ROC de XAF1
metilación en tejidos y sueros reveló la capacidad discriminativa significativa (Figura 6); el valor AUC de tejidos XAF1
metilación fue 0,849 (intervalo de confianza del 95%, 0,806 a 0,892; p Hotel < 0,0001), el valor AUC de suero AXF1
metilación fue 0,909 (intervalo de confianza del 95%, 0,875 hasta 0,942; p Hotel < 0,0001).

Además, como XAF1
estado de metilación en tejidos de cáncer gástrico y los sueros correlacionó significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos, la T-etapa, estadio clínico, y otros parámetros clínico-patológicas (todos los p < 0,05
, Tabla 2)

XAF1
metilación. correlacionado con el pronóstico de pacientes con cáncer gástrico

la correlación significativa de XAF1
metilación con muchos parámetros clínico-patológicas (Tabla 2), sugirió que se puede asociar con el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico. Hasta la fecha de vencimiento de seguimiento, 113 de 168 pacientes con XAF1
hipermetilación en tejidos de cáncer gástrico fue la progresión rápida de la enfermedad o murieron. La enfermedad La mediana de supervivencia libre (DFS) fue de sólo 23,4 meses. Por el contrario, en los 34 pacientes sin XAF1
hipermetilación en sus tejidos con cáncer gástrico, sólo 5 pacientes se ponían cuesta arriba, y la mediana de SSE fue de 39,6 meses. El análisis de Kaplan-Meier demostró que los pacientes con XAF1
hipermetilación en sus tejidos con cáncer gástrico mostraron un evidente la supervivencia peor que la que sin XAF1
hipermetilación ( p < 0,0001
) (Figura 7A). Del mismo modo, el análisis de Kaplan-Meier demostró que los pacientes con suero positivo XAF1
metilación tenían DFS significativamente más bajo que en los pacientes sin suero XAF1
metilación ( p
< 0,0001 ) (Figura 7B), lo que indica que XAF1
promotor de la metilación en el suero era un predictor desfavorable para los pacientes con cáncer gástrico.

el análisis de regresión de Cox reveló que XAF1
metilación en el suero es un factor independiente en la supervivencia de los pacientes: pacientes con XAF1
metilación tenían peor pronóstico ( p < 0,0001
; cociente de riesgos, 5.710; IC del 95%, 3.474~9.383). Además, estadios TNM y la edad al momento del diagnóstico podrían considerarse como el factor que influye en el pronóstico del cáncer gástrico, sólo cuando el efecto de XAF1
metilación fue eliminado. Por otra parte, circulando metilado XAF1 Hoteles en sangre tenía un mayor impacto en el pronóstico de aquel en estadios TNM (Tabla S1).

Detectar flanco positivo de circulación XAF1
metilación Predice tumor recurrencia y de mal pronóstico

Entre los 202 pacientes que fueron evaluados para preoperatoria circulantes XAF1
metilación, 72 pacientes recibieron exámenes de seguimiento de circular XAF1
metilación 2~5 veces a intervalos de 1~6 meses después de la cirugía. Entre 12 pacientes recurrentes, 10 pacientes muestran negativo a positivo de transición en XAF1
estado de metilación en sus sueros, los otros dos mostraron siempre positivo para XAF1
metilación, lo que sugiere que el seguimiento de XAF1
metilación en el suero puede ser un buen marcador para predecir la recurrencia del tumor (Tabla 3).

Discusión

XAF1 gratis ( XIAP
factor de -asociado 1) es una novela XIAP
proteína que podría interferir en la combinación de unión XIAP
con las caspasas, suprime su protección en las células tumorales y los resultados en la apoptosis de las células tumorales [12] - [ ,,,0],14]. La función de anti-apoptosis de XIAP
se determina por la relación de los niveles de expresión de XIAP
contra XAF1
[15]. expresión o silencio de Reducción XAF1
es un evento frecuente en los tumores humanos [16] - [19]. En el presente estudio, se confirmó que la primera XAF1
la expresión de genes fue significativamente las reguladas tanto en el nivel de ARNm y el nivel de proteína en un gran panel de tejidos de cáncer gástrico primario, y la baja regulación de XAF1
expresión se asoció significativamente con las fases del tumor, metástasis y así sucesivamente, lo que implica la pérdida de XAF1
función en la progresión tumoral. Esto es consistente con otros informes de investigación [17] - [19]. Para explorar los mecanismos moleculares responsables de la XAF1
silencio, hemos examinado XAF1
la metilación del promotor en un gran panel tejidos de cáncer gástrico ( n
= 202) y los controles normales ( n
= 88) utilizando una tecnología MSP en tiempo real. Se detectó una frecuencia alta (83,2%) de la hipermetilación del ADN de XAF1
en tejidos de cáncer gástrico. La hipermetilación del ADN de XAF1
significativa correlación con la baja regulación de XAF1
tanto en mRNA y los niveles de proteína en los tejidos de cáncer gástrico (Figura 3). Además, el tratamiento 5-Aza-CdR restauró significativamente XAF1
expresión en XAF1
ha silenciado líneas celulares de cáncer gástrico (Figura 4). Estos datos sugieren fuertemente que la frecuente baja regulación de XAF1 Hoteles en células de cáncer gástrico está regulada por su promotor hipermetilación. Curiosamente, el tratamiento de células de cáncer gástrico con TSA, un inhibidor de histona desacetilasa también restauró XAF1
expresión, solo o combinado con tratamiento con 5-Aza-CdR, lo que indica que la modificación de histonas también puede estar implicado en XAF1 <. br> regulación

metilación del ADN puede utilizarse como un biomarcador potencial tumor en varios cánceres humanos [3] - [11], [23]. La presencia de ADN libre de células que circulan en la sangre periférica se ha descrito en pacientes con procesos malignos, y la liberación activa de ADN tumoral en la circulación se ha informado [29] - [31]. Numerosos estudios han demostrado alteraciones específicas de tumor en los ADN recuperados a partir de plasma o suero de pacientes con diversos tumores malignos que responden a cambios genéticos presentes en los tumores primarios, un hallazgo que tiene un gran potencial para el diagnóstico molecular y pronóstico [29] circulantes - [32]. Los marcadores de ácido nucleico descritas en ADN circulante incluyen mutaciones de oncogenes, alteraciones de microsatélites, reordenamientos del gen, y las alteraciones epigenéticas, como aberrante promotor hipermetilación [7], [8], [30] - [34]. Sobre la base de estas observaciones, sobre todo hemos detectado una alta frecuencia de XAF1
la metilación del ADN en tejidos de cáncer gástrico (83,2%), decidimos explorar la posibilidad de utilizar XAF1
metilación en el promotor el suero como un biomarcador en pacientes con cáncer gástrico. En primer lugar hemos demostrado una gran consistencia en la detección de XAF1
metilación entre sueros y tejidos de cáncer gástrico primario. A continuación analizamos la posibilidad de utilizar circulante metilado XAF1
como marcador diagnóstico mediante análisis ROC. El AUC (área bajo la curva) de 0.909 demostró un alto valor diagnóstico de la detección de XAF1
metilación en muestras de suero. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la detección de XAF1
metilación en el ADN circulante podría ser utilizado como un biomarcador no invasivo para el diagnóstico de cáncer gástrico. Además, nuestros resultados también mostraron que positiva XAF1
metilación en el suero era un factor pronóstico independiente; la predicción de mal pronóstico. Más interesante aún, la transición de negativo a positivo de hacer circular XAF1
metilación después de la cirugía se asoció significativamente con la recidiva tumoral. Estos datos indican que la detección de XAF1
metilación de ADN circulante en suero también puede ser un marcador biológico del tumor para predecir el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico 'y para el seguimiento de la recurrencia del tumor después del tratamiento de la cirugía. Debido a que el número de los pacientes fueron sometidos a este examen de suero de seguimiento fue pequeño, se necesita más investigación en una muestra de gran tamaño del número de pacientes para confirmar este hallazgo interesante y para optimizar la estrategia y el protocolo para este fin. En cualquier caso, la comparación con las formas tradicionales tales como el examen gastroscopia para los pacientes con cáncer gástrico, la característica más notable de hacer circular metilado XAF1
detección es eficiente, rápido, de bajo costo, no invasiva, sin destruir el medio ambiente, de alta tasa conformables de diagnóstico y así sucesivamente, y como tal demuestran importantes perspectivas de aplicación en el futuro.

Conclusiones

la disfunción de XAF1
es frecuente y se regula a través de XAF1
promotor hipermetilación en el cáncer gástrico. Circulante metilado XAF1
ADN se asoció con la carga tumoral y la progresión maligna, que puede ser un biomarcador útil para el diagnóstico de cáncer gástrico, predecir el pronóstico de los pacientes y el seguimiento de la recurrencia del tumor después del tratamiento de la cirugía.

Apoyo información
figura S1.
jpg. A, XAF1
nivel de expresión de genes fue menor en el cáncer gástrico avanzado (estadio III /IV) que en el cáncer gástrico temprano (estadio I /II). B, XAF1
nivel de expresión de genes fue menor en el cáncer gástrico pobremente diferenciado de aquel en el pozo /moderadamente cáncer gástrico (bueno /Mod) diferenciada, p < 0,05

doi:. 10.1371 /journal.pone.0067195.s001 gratis (TIF)
figura S2.
jpg. El análisis de correlación de XAF1
resultados hipermetilación entre los tejidos GC y pares de sangre periférica (sueros)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067195.s002 gratis (TIF)
Tabla S1.
xls. El análisis multivariado de la supervivencia de los datos clínico-patológicas de 202 casos de carcinoma gástrico.

• PLoS One: un nuevo Subclasificación de pT4 cánceres gástricos en función del ancho de Serosal Invasión
• PLOS ONE: Janus quinasa 2 polimorfismos están asociados con riesgo de los pacientes con cáncer gástrico en una población china