PLoS ONE: Kiertävä Metyloidut XAF1 DNA Osoittaa huono ennuste for Mahan Cancer

tiivistelmä

Background

Metyloidut DNA nesteet voivat olla sopiva biomarkkereiden syöpäpotilaille. XAF1
on osoitettu olevan usein alassäädetty ihmisen mahasyövän (GC). Täällä tutkimme jos XAF1
metylaation GC voisi olla hyödyllinen biomarkkereiden.

Methods

Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin havaitsemaan XAF1
mRNA ilmaisu; immunohistokemia ja western blot käytettiin tutkimaan XAF1 proteiinin ilmentymistä GC kudoksissa (n = 202) ja niiden vastaavat para-syöpä- histologinen normaalien kudosten (PCHNTs). Reaaliaikainen metylaatiospesifisen-PCR: ää käytettiin tutkimaan XAF1
promoottori metylaation samassa paneelissa GC kudosten, niiden PCHNTs ja seerumit.

Tulokset

vahvistaneet usein XAF1
alassäätöä sekä mRNA ja proteiini tasoilla GC kudoksissa verrattuna normaaleihin kontrolleihin ja PCHNTs. XAF1
hypermetylaation oli osoituksena 83,2% (168/202) GC kudosten ja 27,2% (55/202) ja PCHNTs, kun taas ei-metylaatio havaittiin 88 tavanomaista valvontaa. Metylointi taso GC kudoksissa oli merkittävästi suurempi kuin vuonna PCHNTs ( p <
0,05). Hypermetylaatiota XAF1
korreloi merkitsevästi down-regulation XAF1
GC kudoksissa sekä mRNA ja proteiini tasoilla ( p
< 0,001 jokainen). Lisäksi olemme havainneet suuri tiheys XAF1
metylaatio (69,8%, 141 ulos 202) seerumeissa DNA: t samoista potilaista, kun taas seerumeista DNA: ita 88 ei-kasvain kontrollit olivat negatiivisia XAF1
metylaatio. XAF1
metylaation sekä GC kudoksissa ja seerumissa voisi olla hyvä biomarkkeri diagnosoimiseksi GC (AUC = 0,85 pehmo- ja AUC = 0,91 varten seerumit) ja korreloi merkitsevästi huonompi ennuste ( p
< 0,001). Lisäksi jälkeen leikkauksen negatiivinen positiiviseen siirtyminen XAF1
metylaatio seerumista liittyy voimakkaasti kasvaimen uusiutumisen.

Johtopäätökset

1) toimintahäiriöstä XAF1
on usein ja säädellään XAF1
promoottori hypermetylaation; 2) havaitseminen verenkierrossa metyloitu XAF1
DNA: t seerumissa voi olla hyödyllinen biomarkkereiden diagnoosissa, arvioitaessa potilaan tulos (ennustetta ja toistumisen) GC potilaille.

Citation: Ling ZQ, Lv P Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et ai. (2013) Circulating Metyloidut XAF1
DNA Osoittaa huono ennuste mahasyövän. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10,1371 /journal.pone.0067195

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 16 toukokuu 2013; Julkaistu: 27 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Ling et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Science and Technology General Project Zhejiangin maakunnassa (no. 2009C33143), ja osittain avustusta selkäranka Talent Zhejiangin maakunnan lääketieteen ja hygienia Platform ohjelmat (no. 2011RCA009). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syövistä Kiinassa, joissa esiintyy ja kuolleisuus, noin osuus 10% kaikista pahanlaatuinen kasvain [1]. Mahalaukun tumorigeneesin on monimutkainen, usean vaiheessa, joihin muutoksia monien geenien [2]. Poikkeava promoottori metylaatio on yksi tärkeimmistä mekanismeista hiljentää joitakin kasvaimen synnyssä ja kasvaimen liittyvien geenien ja pelaa hyvin tärkeä rooli patogeneesissä ja etenemisessä ihmisen syövissä [3], [4] - [6], mukaan lukien mahasyöpä [7] , [8]. Samaan aikaan, varaamiseen tiedot erittäin suositeltavaa, että DNA: n metylaatio saattaa olla hyödyllinen ja tehokas biomarkkereiden syövän riskin arvioinnissa [5], [7], varhainen diagnoosi [7], ennustamisen potilaiden ennusteeseen [7], [8], ja arvioidaan herkkyys kemoterapeuttisten [9]. Viimeaikaiset tutkimus ja muut tutkimukset osoittivat, että havaitsemiseksi kiertävä metyloitua DNA veressä on voimakas ja käytännöllinen lähestymistapa syöpäpotilaille [7], [10], [11].

X-kromosomiin liittyvä estäjä apoptoosin ( XIAP
) -associated tekijä 1 ( XAF1
) on uusi negatiivinen säätelijä XIAP
, joka kääntää XIAP suoja rooli kasvainsoluihin [12] - [14]. Menetys XAF1
lauseke tehdä kasvainsolujen resistenssi apoptoosia ja edistävät kasvainsolun eloonjäämistä, [14] - [17]. Toimintahäiriö XAF1
on raportoitu useissa ihmisen syövissä todennäköisesti läpi promoottori metylaatio [15] - [19], mikä viittaa sen merkitystä kasvainten synnyssä. Ihmisen mahalaukun syövän, XAF1
on raporttien mukaan toistuvasti ja merkittävästi alassäädetty ja tämä alas-säätely XAF1
luultavasti kautta DNA hypermetylaatiota erityisiä CpG sivustoja [15], [16 ], [18]. Ei kuitenkaan raportti on saatavilla noin XAF1
metylaatio veressä ja sen potentiaali biomarkkerina. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme XAF1
promoottorin metylaation pariksi kudos- ja seeruminäytteistä suuri paneeli potilaita, joilla on mahalaukun syöpä, ja arvioitiin verenkierrossa metyloitu XAF1
mahdollisena biomarkkeri mahasyövän .

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

De-tunnistettu ihmisen kudosnäytteitä ja seerumit saatiin Zhejiang Human Tissue Specimen Bank. Käyttö yksilöiden hyväksyi Institutional Review Board Zhejiangin maakunnassa Cancer Hospital. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan mukaisesti vaatimusten meidän laitoksen hallituksen etiikasta. 88 ei-syöpä vapaaehtoiset kunhan kirjallinen lupa. Osa näytteistä oli peräisin Zhejiang Kansan sairaalassa ja First Kansan sairaalan Chunan County. Institutionaalinen Review Board Medical Ethics Zhejiangin maakunnassa Kansan sairaalassa ja First Kansan sairaalan Chunan County hyväksyttyjen menetelmän näytteenotosta sekä kirjallinen suostumus kaikilta potilaista.

kudosnäyte

pariksi kasvain ja para-syöpä- histologinen normaalien kudosten (PCHNT) näytteet kerättiin leikkauksen aikana 202 primaarisessa mahalaukun adenokarsinooman Zhejiangin maakunnassa Cancer Hospital, Zhejiang kansan sairaalassa ja First kansan sairaalan Chunan County tammikuusta 2008 joulukuuhun 2009. PCHNT arvioitiin mikroskooppisesti normaalien solujen ja ilman dysplastic soluja. Yksikään näistä tapauksista oli tehty muuta lääketieteellistä hoitoa ennen leikkausta. Demografiset, kliinisten ja histopatologisten parametrien näistä tapauksista on esitetty taulukossa 1. kasvun malli kasvainsolujen määritettiin Ming luokittelun [20]. Kaikki otettiin potilaita oli seurattu jaksoittain kunnes eräpäivänä. Antral limakalvon biopsia näytteet 88 syöpäsolujen vapaaehtoiset gastroskopialla arvottiin kerättiin verrokkeina saman ajan kuluessa, mukaan lukien 54 miestä ja 34 naista, joiden keski-ikä 52,9 vuotta vanha. Näistä vapaaehtoiset, 48 potilasta diagnosoitu krooninen ei-atrofinen gastriitti. Samaan aikaan pariksi seeruminäytteet kerättiin ennen leikkausta tai endoskopia.

Analyysi Helicobacter pylori ( H. Pylori
) Infection

Koepaloista saatu kaikista potilaista, joilla oli tähystys . H
. pylori
tila määritettiin nopealla ureaasi testi ja Giemsa-värjäys menetelmiä [21], [22]. Sitä pidettiin H
. pylori
infektio, kun molemmat testit olivat positiivisia, ja näytteet, joiden yksi positiivinen suljettiin tilastollista analyysia [22].

Reaaliaikainen RT-PCR

mRNA ilmaisun on XAF1
analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR [23]. Yhteensä RNA: t eristettiin käyttäen Trizol (Gibco). Yhteensä 3 ug kokonais-RNA: t saatettiin käänteistranskriptio käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega). Glyseraldehydi fosfaattidehydrogenaasin ( GAPDH
) valittiin sisäisenä vertailuna. Sekvenssit XAF1
alukkeet olivat seuraavat: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R) 5'- GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3'. GAPDH
alukesekvenssit olivat seuraavat: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. 2 ^{-ΔΔCt menetelmää käytettiin laskettaessa suhteellisia muutoksia geenien ilmentyminen.}

immunohistokemiallinen värjäys

ilmentyminen XAF1 proteiinin määritettiin immunohistokemiallisella analyysillä XAF1 monoklonaalisella vasta-aineella (Santa Cruz Biotechnology ). Immunohistokemiallinen värjäys XAF1 suoritettiin käyttäen edustavaa parafinoidut yksilöitä 202 GC potilailla. Jälkeen deparaffinization, antigeenin haku 0,01 M sitraattipuskurissa, ja inaktivointi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuuden 3% H _{2O 2 /metanoli, inkuboimme diat kanssa vasta-aineen XAF1 4 ° C: ssa yön yli, ja immunohistokemiallisella värjäyksellä, seuraavat standardi avidinbiotin-peroksidaasi-kompleksi tekniikkaa, suoritettiin käyttäen 3,3'-diaminobentsidiiniä (DAB) kromogeenina. Tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä. Immuunihistokemialliset värjäys pisteet (ISS) määritetään kolmen riippumattoman patologia Yhdistämällä värjäytymisen esiintymistiheys ja voimakkuus seuraavasti [24], [25]: ei värjäytymistä pisteytetään 0, 1~10% värjättyjen solujen pisteytetään 1, 11~50% kuten 2, 51~80% kuten 3, ja 81~100% kuten 4. värjäys voimakkuus on luokiteltu asteikolla 0-3, jossa 0, negatiivinen; 1, heikko; 2, kohtalainen; ja 3, vahva. Kun on multifokaalinen immunoreaktiivisuus ja on merkittäviä eroja värjäytymisvoimakkuuksia välillä pesäkkeitä, keskiarvo vähiten intensiivistä ja voimakkain värjäytyminen kirjattiin. Raakadata muunnettiin ISS kertomalla taajuus pisteet ja värjäyksen voimakkuuden pisteet. Teoriassa ISS voi vaihdella välillä 0 12. ISS on 9~12 pidettiin vahva immunoreaktiivisuus, 5~8 pidettiin kohtalainen, 1~4 pidettiin heikkona, ja 0 pisteytettiin negatiivisiksi. Osiot jossa värjäystä ei voitu hyvin ominaista katsottiin epäselvä.}

Western Blot analyysi

Pariksi kasvain ja PCHNT yksilöitä 20 tapausta valittiin satunnaisesti 202 mahalaukun syöpäpotilaiden western blot analyysiä. Yhteensä proteiini uutettiin ja kvantitoitiin sitten käyttäen Lowryn menetelmällä [26]. Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen anti-XAF1 monoklonaalisia vasta-aineita (Santa Cruz, CA) mukaan edellisen raportin [6]. β-tubuliinia toimi sisäisenä kontrollina.

DNA Extraction, bisulfiittimodifikaatio ja Reaaliaikainen metylaatiospesifisen-PCR (MSP) B

Serial 5 mm osissa, joka sisälsi syöpä ja ei-neoplastisia kudokset asennettu ei-päällystetyn objektilaseille ja kuivattiin 37 ° C: ssa yön yli. Jälkeen deparaffinization ja värjäys hematoksyliinillä ja eosiinilla (H &E), keräsimme 5000 ytimet 5-10 leikesarjojen käyttäen 27G neulalla. Kerätyt tumat käsiteltiin 40 ml: lla 200 mg /ml proteinaasi K: n (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) 42 ° C: ssa, 72 tuntia. Paramagneettisen helmen tekniikka (AxyPrep Mag Veri gDNA kit, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) käytettiin eristämään genominen DNA uutta verta mukaan kitin protokollan. Protokolla koostuu seuraavista vaihe: lyysi, sitova, pesu, ja eluointia. Epäpuhtaudet poistetaan aikana sitovia ja pesuvaiheet. Laatu DNA arvioitiin A260 /280-suhde on NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), DNA: n eheys tarkistettiin denaturoivalla agaroosigeelielektroforeesilla.

DNA: t muutettiin natriumbisulfiitti käyttäen EpiTect bisulfiittimodifiointi (Qiagen Inc.) seuraavasti manufactory ohjeita. Muokattu DNA: t analysoitiin reaaliaikaisella MSP on ABI7500 PCR (ABI Co.) käyttämällä SYBR Esisekoite Taq ExTaq (Takara Co. Ltd). XAF1
metylointi unmethylation alukkeet suunniteltiin seuraavasti: XAF1
(MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1
(UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. Ihmisen genomista DNA: ta (NEB) käsiteltiin SSSI metyylitransferaasin in vitro käytettiin positiivisena kontrollina. Perifeerinen veri DNA terveelle kohteelle käytettiin negatiivisena kontrollina. Prosenttiosuus metyloitua DNA: iden näytteissä laskettiin viitteet sellaisina kun edellinen on kuvattu [27], [28]. Metyloitua DNA: t indeksi pisteytettiin mukaan prosenttiosuus DNA: n metylaatio; 0, < 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; ja 4, > 80%. Indeksi pisteet 0 pidetään DNA unmethylation ja tulokset 1-4 katsottiin hypermetyloitunut vastaavasti [7], [27]. 20% katkaisi kynnystä DNA hypermetylaation perustui valvonnasta normaalin näytteistä ja sisäisen laadunvalvonnan saatu reaaliajassa MSP-analyysi.

Soluviljely ja huumeet Hoito

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat (AGS ja KATO III) viljeltiin RPMI1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa ja 5% CO _{2, vastaavasti. Viljellyt solut käsiteltiin 5-atsa-2'-deoksisytidiini (5-atsa-CDR) (Sigma-Aldrich), jonka lopullinen pitoisuus on 1,0 umol /l. Trikostatiini A (TSA) (Sigma-Aldrich), jonka lopullinen pitoisuus on 20 ng /ml ylläpitäjä seuraavat 5-atsa hoitoon tai yksin 24 tuntia. Solut kerättiin ja alistettiin DNA, RNA ja proteiinien puhdistuksessa ja myöhemmät analyysit.}

Tilastollinen analyysi

SPSS 17.0 tilasto-ohjelmalla annettiin tietojen analysointia. Counting vertailutuloksia ryhmien välillä saatettiin χ
^{2 testiä ja Fisherin testiä. Survival analyysi computered avulla Kaplan-Meier menetelmä ja merkittävää arvioitiin avulla log-rank-testi. Univariate analyysi Coxin regressiomallin käytettiin määrittämään yksilöityjen ennustetekijät, ja monimuuttuja analyysi Coxin regressiomallin käytettiin tutkimaan yhteisvaikutuksia. Kaikkien tilastolliset analyysit, p
arvojen < 0,05 pidettiin tilastollista merkittävyyttä.}

Tulokset

Down-regulation XAF1
Alkeisyhdistyksessä Mahalaukun kasvaimet

tutkimiseksi XAF1
geeniekspressioprofiili, tutkimme mRNA ilmaus XAF1
in 88 ei-syöpä vapaaehtoisia, ja 202 ensisijainen mahasyövän kudosten ja niitä vastaavat PCHNTs. Kuten kuviossa 1A, XAF1
ilmentyminen väheni merkittävästi mahasyövän näytteissä verrattuna normaalissa valvonta ja PCHNTs ( p <
0,001). Kuitenkin, ei ollut merkittävää eroa XAF1
ilmaisun PCHNTs verrattuna ei-syöpä valvontaa.

Lisäksi XAF1
ilmentyminen oli merkitsevästi alhaisempi kehittynyt kasvaimia (vaihe III /IV) kuin alkuvaiheen kasvaimissa (vaihe I /II) ( p <
0,0001, kuvio S1A), ja oli huomattavasti alhaisempi huonosti eriytetty kasvaimia kuin hyvin /kohtuullisesti erilaistunut kasvain ( p <
0,0001, kuva S1B).

tarkista XAF1 proteiinin taso mahasyövässä kudoksissa, suoritimme immunohistokemiallinen analyysi 202 mahasyövän kudosten ja niitä vastaavat PCHNTs. Nuclear XAF1 ilmentyminen oli johdonmukaisesti läsnä normaalissa mahalaukun epiteelin osoittaa korkea immunoreaktiivisia tulokset. XAF1 proteiinin ilmentyminen havaittiin korkealla tasolla 97,5% (197/202) ja PCHNTs (kuvio 1 B). Kuitenkin, korkean ilmentymisen XAF1 proteiinia havaittiin vain 16,8% (34/202) mahalaukun syövän kudosten; Suurin osa mahasyöpä kudosten olivat poissa tai alhainen XAF1-proteiinin (kuvio 1C). Immuunihistokemialliset havainnot on koottu taulukkoon 1. immunohistokemiallinen värjäytyminen pisteet mahasyövän kudoksissa oli merkittävästi pienempi kuin vuonna PCHNTs tai terveillä ( p <
0,0001, kuvio 1 D). Menetys XAF1 proteiinin korreloi merkitsevästi H. pylori
infektio, kasvaimen koon, histologiset erilaistuminen, imusuonten invaasio, laskimoiden invaasio, invasiivisia syvyys, imusolmuke etäpesäke, etäinen etäpesäke ja kliinisessä vaiheessa (taulukko 1) (kaikki p <
0,05).

Immuunihistokemialliset tulokset 20 mahasyövän kudokset varmistettiin vielä avulla western blot -analyysin. Edustaja western blotting tuloksia kaksi tapausta kuvassa 1E. Suhteellinen määrä XAF1 proteiinin ilmentymistä normalisoida β-tubuliinin samoista näytteistä. Keskimääräinen XAF1 proteiini tasolla 20 mahasyövässä kudoksiin oli merkittävästi pienempi kuin vuonna PCHNTs ( p
< 0,05) (kuvio 1 F).

Promoottori hypermetylaatiota XAF1
Alkeisyhdistyksessä mahalaukun kasvaimet

Tutkiakseen molekyylitason mekanismit XAF1
hiljaisuus syöpien, haimme reaaliaikaisen MSP tekniikka tutkia DNA metylaatiostatuksen XAF1
promoottori. Taajuus XAF1
hypermetylaation mahasyövän kudoksissa, jotka vastaavat PCHNTs ja ei-syöpä kontrollit olivat 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) ja 5,7% (5/88), tässä järjestyksessä. Hypermetylaation taajuus XAF1
syövissä on huomattavasti korkeampi kuin PCHNTs ja ei-syöpä hallintalaitteet (kaikki p
< 0,0001, kuva 2).

Huomattavaa metyloitua tila XAF1
merkittävästi korreloi jotkut kliinis-patologisten parametrit mahasyövän, kuten imusolmuke etäpesäke, T-vaihe, H
. pylori
infektio, jne (kaikki p <
0,05, taulukko 2). Mitään merkittävää korrelaatiota hypermetylaatiota XAF1
ja sukupuoli, ikä diagnoosin, kasvaimen kohdalle ja etäpesäkkeiden todistettiin (kaikki p
> 0,05) (taulukko 2).

XAF1
Promoottori hypermetylaation liittyy sen transkription hiljentäminen mahasyövän Cells

tarkastella välisten suhteiden XAF1
metylaatio ja XAF1
ilme, vertasimme XAF1
metylaatio tasolla XAF1
mRNA-tasolla ja proteiinin tasot määritetään joko immunohistokemiallinen analyysi (kuvio 3A) tai western-blottauksella (kuvio 3B) Spearman korrelaatioanalyysiin. Kuten on esitetty kuviossa 3A, XAF1 proteiinin ekspressio (määritettynä immunohistokemiallista analyysiä) 202 GC kudoksissa korreloi läheisesti XAF1
mRNA-tasolla [lg (T /N)] (määritetty RT-PCR) ( γ
= 0,841, p <
0,0001). Tärkeämpää, XAF1
metylaatio taso oli merkitsevästi yhteydessä XAF1
mRNA tasolla ( γ
= - 0,846, p <
0,0001) ja XAF1 proteiini tasolla ( γ
= -0,969, p <
0,0001). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun analysoidaan korrelaatio XAF1
promoottorin metylaation ja XAF1 proteiinin ilmentyminen määritettiin Western blot -analyysillä (kuvio 3B). Nämä tulokset vahvasti syytteeseen että XAF1
ilmentymistä säätelee XAF1
promoottori metylaatio.

5-atsa-CdR Administration Palauttaa ilmentäminen XAF1

edelleen varmistamiseksi epigeneettiset sääntelyn XAF1
ilmaisun, AGS ja KATO III soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR ja /tai TSA. XAF1
-mRNA uudelleen sekä mahalaukun syövän solulinjat, mukana demetylaation XAF1
promoottorin (kuvio 4), mikä osoittaa, että XAF1
transkriptionaalisesti vaiennetaan näissä soluissa DNA hypermetylaation. Mielenkiintoista, TSA hoito yksinään oli tehokas palauttamisessa XAF1
ilmaisun AGS ja KATO-III ilman merkittävää muutosta XAF1
metylaatio tasolla, mikä viittaa siihen, että histonimodifikaation voi myös olla mukana säätelyssä XAF1
ilme. Kuitenkin anto TSA seuraavista 5-atsa-CdR oli additiivinen vaikutus palauttamaan geeniekspression vähenemisen entisestään Metylointilaitteistoon tason XAF1
. Nämä tulokset ovat yhtä mieltä viimeaikaiset tutkimukset, jotka ehdotti, että TSA voi olla demetylaation vaikutus geeni-spesifisellä tavalla [5]. Western blot-analyysi käyttämällä AGS soluja, mallina, vahvistettiin säätely ylöspäin XAF1 proteiinien jälkeen 5-atsa-CdR ja 5-atsa-CdR /TSA hoidot (kuva 4).

Detection of Kiertävä XAF1
metylointi

Olemme havainneet tiheä XAF1
metylaation ensisijainen mahasyövässä (83,2%), mikä viittaa siihen, että se voi olla hyvä biomarkkereiden jos XAF1
metylaatio saattaa olla havaittavissa seerumissa. Siksi tutkimme XAF1
metylaation sovitetussa seerumin DNA: t alkaen 202 GC potilaille. XAF1
metylaatio havaittiin 141 (69,8%), seerumin DNA: t 202 mahasyöpäpotilaista (kuvio 5). Sen sijaan, XAF1
metylaatio ei havaittu seerumin DNA: ita 88 ei-syöpä valvontaa.

Seuraavaksi vahvisti johdonmukaisuuden XAF1
metylaation välinen kasvainkudoksissa ja vastaava seerumia. Vuonna 168 tapauksissa, jotka osoittivat XAF1
metylaatio kasvainkudoksissa, 141 näytetään XAF1
metylaatio niiden pariseeruminäytteitä, jolloin yhdenmukaisuus 83,9% välillä. Ja 34 mahasyöpäpotilaista ilman XAF1
metylaatio niiden mahasyövässä kudoksiin, ei metylaatio havaittiin kaikissa seerumin DNA: t (kuva S2).

XAF1
Metylointi biomarkkerina diagnostiikassa mahasyövän

arvioimiseksi arvoa XAF1
Metylointia biomerkkiaine diagnosoinnissa GC, me piirretään vastaanotin toimii (ROC) käyriä ja laskettu AUC (AUC) arvoja DNA: n metylaatio tietoja molemmista GC kudokset ja seerumit. Sekä ROC analyysit XAF1
metylaatio kudoksissa ja seerumit esiin huomattavia erotteleva kapasiteetti (kuva 6); AUC-arvo kudosten XAF1
metylaatio oli 0,849 (95% luottamusväli, ,806-+0,892; p
< 0,0001), AUC-arvo seerumin AXF1
metylaatio oli 0,909 (95% luottamusväli, +0,875-,942; p
< 0,0001).

lisäksi, kuten XAF1
metylaatiostatuksen mahasyövän kudokset ja seerumit korreloi merkitsevästi imusolmuke etäpesäke, T-vaihe, kliinisessä vaiheessa, ja muut kliinis-patologinen parametrit (kaikki p <
0,05, taulukko 2).

XAF1
metylointi korreloi ennuste mahasyöpäpotilaista

merkittävä korrelaatio XAF1
metylaatio monia kliinis-patologinen parametrit (taulukko 2) ehdotti, että se voi liittyä ennustetta mahalaukun syöpäpotilailla. Kunnes eräpäivä Follow-up, 113: lla 168 XAF1
hypermetylaation mahasyövän kudoksissa meni nopeasti taudin etenemistä tai kuolivat. Median taudista vapaa eloonjääminen (DFS) oli vain 23,4 kuukautta. Sen sijaan, että 34 potilasta ilman XAF1
hypermetylaation niiden mahasyövässä kudoksiin, vain 5 potilasta huononi, ja mediaani DFS oli 39,6 kuukautta. Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joilla on XAF1
hypermetylaation niiden mahasyövässä kudoksiin näytteillä ilmeinen elinajan kuin että ilman XAF1
hypermetylaation ( p <
0,0001) (Kuva 7A). Samoin Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joilla on positiivinen seerumi XAF1
metylaatio oli huomattavasti pienempi DFS kuin potilailla ilman seerumia XAF1
metylaatio ( p
< 0,0001 ) (kuvio 7B), mikä osoittaa, että XAF1
promoottorin metylaation seerumin oli epäsuotuisa ennustaja mahasyövän potilailla.

Coxin analyysi paljasti, että XAF1
metylaatio seerumeissa on itsenäinen tekijä potilaiden selviytymisen: potilaalla on XAF1
metylaatio oli huonompi ennuste ( p <
0,0001, riskisuhde 5,710; 95% CI, 3.474~9.383). Lisäksi TNM vaiheet ja ikä diagnoosin voitaisiin harkita, koska vaikuttava tekijä ennusteen mahasyövän, vasta kun vaikutus XAF1
metylaatio oli eliminoitu. Lisäksi verenkierrossa metyloiduksi XAF1
veressä oli suurempi vaikutus ennusteeseen kuin TNM vaiheissa (taulukko S1).

Positiivinen Transition kiertävän XAF1
Metylointi ennustaa Kasvain toistuminen ja huono ennuste

Niistä 202 potilaasta, jotka tutkittiin ennen leikkausta verenkierrossa XAF1
metylaatio, 72 potilasta sai seurantaa tutkimukset kiertävän XAF1
metylaatio 2~5 kertaa välein 1~6 kuukautta leikkauksen jälkeen. Niistä 12 toistuva potilaista, 10 potilaalla näkyy negatiivinen positiiviseen siirtymisen XAF1
metylaatiostatuksen niiden seerumit, kaksi muuta osoitti aina positiivinen XAF1
metylaatio, mikä viittaa siihen, että seuranta XAF1
metylaatio seerumin voi olla hyvä merkki ennustamiseen kasvaimen uusiutumisen (taulukko 3).

keskustelu

XAF1
( XIAP
-associated kerroin 1) on uusi XIAP
sitoutuva proteiini, joka voisi häiritä yhdistäminen XIAP
kanssa caspases, poistetaan sen suoja kasvainsoluihin ja johtaa tuumorisolujen apoptoosin [12] - [ ,,,0],14]. Anti-apoptoosin funktio XIAP
määritetään suhde ekspressiotasot XIAP
vastaan ​​ XAF1
[15]. Vähentynyt ilmentyminen tai hiljaisuus on XAF1
on yleinen tapahtuma ihmisen kasvaimissa [16] - [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ensimmäinen vahvisti, että XAF1
geenien ilmentyminen oli merkitsevästi alassäädetty sekä mRNA-tasolla ja proteiinin taso suuressa paneelissa ensisijainen mahasyövän kudoksiin, ja alas-säätely XAF1
ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä kasvaimen vaiheisiin, etäpesäke ja niin edelleen, syytetään menetys XAF1
toimintoa syövän etenemiseen. Tämä on sopusoinnussa muiden tutkimusraportteja [17] - [19]. Tutkia molekyylimekanismeja vastuussa XAF1
hiljaisuus, tutkimme XAF1
promoottori metylaatio suuressa paneelissa mahasyövän kudoksiin ( n
= 202) ja normaalit kontrollit ( n
= 88) käyttäen reaaliaikaista MSP tekniikkaa. Olemme havainneet korkean taajuuden (83,2%) DNA hypermetylaatiota XAF1
mahasyövän kudoksissa. DNA hypermetylaatiota XAF1
merkittävästi korreloi down-regulation XAF1
sekä mRNA ja proteiini tasoilla mahasyövän kudoksissa (kuva 3). Lisäksi, 5-atsa-CdR hoitoon merkittävästi palautettu XAF1
ilmaisun XAF1
vaiennetaan mahasyövän solulinjoissa (kuvio 4). Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että usein alas-säätely XAF1
mahasyövän soluissa säätelee sen promoottori hypermetylaation. Mielenkiintoista on, että hoito mahasyövän solujen TSA, histonideasetylaasi- inhibiittori palautti myös XAF1
ilmaisua, joko yksin tai yhdessä 5-atsa-CdR hoidon, mikä osoittaa, että histonimodifikaation voi myös olla mukana XAF1
sääntelyä.

DNA: n metylaatio voidaan käyttää mahdollisena kasvain biomarkkereiden erilaisissa ihmisen syövissä [3] - [11], [23]. Läsnäolo soluttoman DNA kiertävän ääreisverenkierrossa on kuvattu potilailla, joilla on pahanlaatuinen prosesseja, ja aktiivinen vapautuminen kasvaimen DNA verenkiertoon on raportoitu [29] - [31]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet kasvainspesifisiä muutoksia kiertävä DNA: t talteen plasmasta tai seerumista, joilla oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, jotka vastaavat geneettisiä muutoksia esiintyy ensisijainen kasvaimia, päätelmä on potentiaalia molekyylitason diagnoosin ja ennusteen [29] - [32]. Nukleiinihappo markkereita kuvattu kiertävä DNA: t sisältävät onkogeenimutaatiot, mikrosatelliitti muutokset, geeni järjestelyihin sekä epigeneettiset muutokset, kuten poikkeava promoottori hypermetylaation [7], [8], [30] - [34]. Perusteella näiden havaintojen, erityisesti havaitsimme tiheä XAF1
DNA: n metylaation mahasyövän kudoksissa (83,2%), päätimme tutkia mahdollisuutta käyttää XAF1
promoottori metylaation seerumin biomarkkerina mahalaukun syöpäpotilailla. Ensin osoitimme suurta johdonmukaisuutta havaitsemisessa XAF1
metylaatio välillä seerumit ja ensisijaisen mahasyövän kudoksiin. Seuraavaksi analysoitiin mahdollisuutta käyttää verenkierrossa metyloitu XAF1
kuten diagnostisen markkerin avulla ROC-analyysi. AUC (pinta-ala käyrän alla) on 0,909 osoitti korkeaa diagnostinen arvo havaitsemiseksi XAF1
metylaatio seeruminäytteistä. Näin ollen tietomme osoittavat, että havaitseminen XAF1
metylaation kiertävä DNA voitaisiin käyttää ei-invasiivisen biomarkkeri diagnoosi mahalaukun syövän. Lisäksi tuloksemme osoittivat myös, että positiivinen XAF1
metylaatio seerumin oli itsenäinen ennustetekijä; ennustavat huono ennuste. Enemmän kiinnostavaa, siirtyminen negatiivisesta positiiviseen verenkierrossa XAF1
metylaatio leikkauksen jälkeen oli merkitsevästi yhteydessä kasvaimen uusiutumisen. Nämä tulokset osoittavat, että havaitseminen XAF1
metylaatio kiertävän seerumin DNA voi myös olla kasvain biomarkkereiden ennustamiseksi mahasyövän potilaan ennustetta ja seurantaan uusiutunut leikkauksen jälkeen hoidon. Koska osuus potilaista tehtiin tämän seurannan seerumin tutkimus oli pieni, lisätutkimusta suuri otoskoko potilaiden määrä tarvitaan vahvistaa tämän mielenkiintoisen havainnon ja optimoida strategiaa ja protokolla tähän tarkoitukseen. Joka tapauksessa, vertaamalla perinteisillä tavoilla kuten gastroskopia-tutkimus mahalaukun syöpäpotilaille, merkittävin ominaisuus verenkierrossa metyloitu XAF1
havaitseminen on tehokas, nopea, edullinen, ei-invasiivisia, ei tuhota ympäristöä, korkea diagnostiset mukautuva korko ja niin edelleen, ja siten osoittaa tärkeä sovellus näkymiä tulevaisuudessa.

Johtopäätökset

toimintahäiriöstä XAF1
on usein ja säädellään XAF1
promoottori hypermetylaation mahasyövän. Kiertävä metyloitu XAF1
DNA liittyi kasvaintaakkaa ja pahanlaatuiset eteneminen, joka voi olla arvokas biomarkkeri diagnoosi mahasyövän ennustaminen potilaiden ennustetta ja seuranta uusiutunut leikkauksen jälkeen hoidon.

tukeminen tiedot
Kuva S1.
jpg. A, XAF1
geenin ilmentymisen taso oli alhaisempi edennyt mahasyöpä (vaihe III /IV) kuin alussa mahasyövässä (vaihe I /II). B, XAF1
geenin ilmentymisen taso oli alhaisempi huonosti eriytetty mahasyövän kuin hyvin /kohtuullisesti (no /Mod) eriytetty mahasyöpä, p <
0,05.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0067195.s001
(TIF) B Kuva S2.
jpg. Korrelaatio analyysi XAF1
hypermetylaation tulosten välillä GC kudosten ja pariksi ääreisverenkierron (seerumit).
Doi: 10,1371 /journal.pone.0067195.s002
(TIF) B Taulukko S1.
xls. Monimuuttuja selviytyminen analyysi kliinis-patologisten data 202 mahakarsinooman tapauksissa.

• PLoS ONE: uusi useampiin alaluokkiin pT4 mahasyövistä Mukaan leveys seröösisiä Invasion
• PLoS ONE: Janus-kinaasi 2 polymorfismit liittyvät riskit potilailla, joilla on mahasyövän kiinalainen Väkiluku