PLOS ONE: Circulação metilado XAF1 DNA Indica mau prognóstico para gástrica Cancer

Abstract

Fundo

DNA metilado em fluidos pode ser um biomarcador adequado para pacientes com câncer. XAF1
tem sido mostrado para ser frequentemente sub-regulada no cancro gástrico humano (CG). Aqui, nós investigamos se XAF1
metilação no GC poderia ser um biomarcador útil.

Métodos

em tempo real RT-PCR foi utilizado para detectar XAF1
expressão de mRNA; imuno-histoquímica e Western blot foram usadas para examinar a expressão de proteínas em tecidos XAF1 GC (n = 202) e as suas correspondentes tecidos normais histológicos para-canceroso (PCHNTs). Real-time metilação específicas de PCR foi utilizada para investigar XAF1
metilação do promotor no mesmo painel de tecidos GC, seus PCHNTs e soros.

Resultados

Nós confirmamos frequente XAF1
infra-regulação em ambos os mRNA e os níveis de proteína nos tecidos GC em comparação com controles normais e PCHNTs. XAF1
hipermetilação foi evidenciado em 83,2% (168/202) dos tecidos GC e 27,2% (55/202) de PCHNTs, enquanto nenhum metilação foi detectada nos 88 controlos normais. O nível de metilação em tecidos GC foi significativamente maior do que em PCHNTs ( P < 0,05
). A hipermetilação do XAF1
significativamente correlacionada com a regulação da XAF1
em tecidos GC em ambos os níveis de mRNA e proteína ( p Art < 0,001 cada). Além disso, foi detectada alta freqüência de XAF1
metilação (69,8%, 141 de 202) nos DNAs soros dos mesmos pacientes, enquanto os DNAs de soro de 88 controles não-tumorais foram negativos para XAF1
metilação. O XAF1
metilação em ambos os tecidos GC e no soro poderia ser um bom biomarcador para o diagnóstico de GC (AUC = 0,85 para o tecido e AUC = 0,91 para soros) e significativamente correlacionada com pior prognóstico ( p
< 0,001). Além disso, após a cirurgia negativo-se positiva transição de XAF1
metilação em soros fortemente associada com a recorrência do tumor.

Conclusões

1) Disfunção de XAF1
é frequente e é regulada através de XAF1
hipermetilação do promotor; 2) Detecção de circular metilado XAF1
DNAs no soro pode ser um biomarcador útil no diagnóstico, avaliação de resultados (prognóstico do paciente e reincidência) para pacientes GC

Citation:. Ling ZQ, Lv P , Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) Circulação metilado XAF1
DNA Indica mau prognóstico para o cancro gástrico. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10.1371 /journal.pone.0067195

editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 12 Março, 2013; Aceito: 16 de maio de 2013; Publicação: 27 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ling et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por uma bolsa do Projeto Ciência e Tecnologia Geral da Província de Zhejiang (no. 2009C33143), e em parte por uma concessão do Talent Backbone de Zhejiang Provincial Medicina e Programas Plataforma de higiene (no. 2011RCA009). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é um dos cancros mais comuns na China, com uma alta incidência e mortalidade, aproximadamente respondendo por 10% de todas as neoplasias [1]. tumorigénese gástrico é um complicado, processo de passos múltiplos envolvendo alterações de muitos genes [2]. Aberrante metilação do promotor é um dos principais mecanismos de silenciar alguns genes supressores de tumores e genes relacionados tumorais e desempenha um papel muito importante na patogénese e progressão de cancros humanos [3], [4] - [6], incluindo o cancro gástrico [7] , [8]. Enquanto isso, acumulando dados sugerem fortemente que a metilação do DNA poderia ser biomarcador útil e poderosa na avaliação do risco de câncer [5], [7], o diagnóstico precoce [7], predizer o prognóstico dos pacientes [7], [8], e avaliar a sensibilidade para fármacos quimioterapêuticos [9]. Nosso estudo recente e outras pesquisas demonstraram que a detecção de circulação DNA metilado no sangue é uma abordagem potente e prático para pacientes com câncer [7], [10], [11].

X-linked inibidor de apoptose ( XIAP
) -associated fator 1 ( XAF1
) é um romance regulador negativo da XIAP
, que inverte papel de proteção de XIAP em células tumorais [12] - [14]. A perda de XAF1
expressão irá tornar as células tumorais resistência à apoptose e promover a sobrevivência de células de tumor [14] - [17]. Disfunção do XAF1
tem sido relatada em vários cancros humanos provavelmente através de metilação do promotor [15] - [19], o que sugere a sua importância na tumorigênese. No cancro gástrico humano, XAF1
tem sido relatada a ser frequente e significativamente regulada para baixo e isso down-regulação da XAF1
provavelmente através de hipermetilação do DNA de locais específicos CpG [15], [16 ], [18]. No entanto, nenhum relatório disponível sobre XAF1
metilação no sangue e sua potencialidade como um biomarcador. No presente estudo, examinamos XAF1
metilação do promotor em amostras de tecido e de soro pareadas de um grande painel de pacientes com câncer gástrico, e avaliados circulante metilado XAF1
como um potencial biomarcador para o câncer gástrico .

material e Métodos

Declaração de Ética

amostras de tecido humano de-identificados e soros foram obtidos a partir província de Zhejiang Human Tissue Specimen Bank. A utilização de espécimes foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Zhejiang Hospital do Câncer Province. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente de acordo com as exigências do conselho de ética da nossa instituição. 88 voluntários não-cancerosas desde consentimento informado por escrito. Parte das amostras eram de Hospital da Província de Zhejiang Pessoas e Hospital das primeiras pessoas da Chunan County. O Conselho de Revisão Institucional de Ética Médica do Hospital da Província de Zhejiang Pessoas e Hospital das primeiras pessoas da Chunan County aprovado o método de coleta de amostra com o consentimento informado por escrito de todos os pacientes, respectivamente.

Tissue Specimen

tumorais e para-canceroso tecidos normais histológicos emparelhados espécimes (PCHNT) foram coletadas no momento da cirurgia de 202 pacientes com adenocarcinoma gástrico primário em Zhejiang Hospital do Câncer Province, Hospital de Zhejiang província de Pessoas e Hospital das primeiras pessoas da Chunan County a partir de janeiro de 2008 a dezembro 2009. a PCHNT foi avaliada microscopicamente para a presença de células normais e ausência de células displásicas. Nenhum desses casos tinham sido submetidos a qualquer tratamento médico antes da cirurgia. parâmetros demográficos, clínicos e histopatológicos destes casos foram apresentados na Tabela 1. O padrão de crescimento de células tumorais foi determinada de acordo com a classificação de Ming [20]. Todos os pacientes recrutados tinham sido acompanhados periodicamente até a data de vencimento. Antrais espécimes mucosa biópsias de 88 voluntários não-cancerosas por gastroscopia foram coletadas aleatoriamente como controles dentro do mesmo período, incluindo 54 homens e 34 mulheres, com uma idade média de 52,9 anos de idade. Entre esses voluntários, 48 ​​pacientes foram diagnosticados com gastrite não-atrófica crônica. Enquanto isso, amostras pareadas de soro foram coletadas antes da cirurgia ou a endoscopia.

Análise do Helicobacter Pylori ( H. Pylori
) Infecção

As biópsias foram obtidas de todos os pacientes que tiveram exame endoscópico . H
. Status pylori
foi determinada pelo teste rápido da urease e métodos de coloração Giemsa [21], [22]. Considerou-se como H
. pylori
quando ambos os testes foram positivos, e as amostras com único positiva foram excluídos por análise estatística [22].

em tempo real RT-PCR

A expressão de mRNA de XAF1
foi analisada por em tempo real de RT-PCR [23]. Os ARNs totais foram extraídos utilizando o Trizol (Gibco). Um total de 3 ^ g de RNAs totais foi sujeito a transcrição reversa usando M-MLV de transcriptase reversa (Promega). A desidrogenase de fosfato de gliceraldeído (
GAPDH) foi selecionado como referência interna. As sequências de XAF1
iniciadores foram como se segue: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R) 5'-GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3'. GAPDH
sequências de iniciador foram como se segue: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. O método 2 ^{-ΔΔCt foi usada para calcular as mudanças relativas na expressão do gene.}

A coloração imuno-histoquímica

A expressão de proteína XAF1 foi determinada por análise de imuno-histoquímica com o anticorpo monoclonal XAF1 (Santa Cruz Biotechnology ). coloração imuno-histoquímica para XAF1 foi realizado usando amostras representativas embebidos em parafina a partir de 202 pacientes GC. Após desparafinização, recuperação de antigénio em tampão de citrato 0,01 M, e a inactivação da actividade de peroxidase endógena em 3% H _{2O 2 /metanol, incubámos as lâminas com anticorpo para XAF1 a 4 ° C durante a noite, e coloração imuno-histoquímica, seguindo uma técnica complexa avidinbiotin-peroxidase padrão, foi realizada utilizando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) como o cromogénio. Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina. A pontuação da coloração imunohistoquímica (ISS) é determinada por três patologistas independentes que combinam a frequência e a intensidade de coloração do seguinte modo [24], [25]: sem coloração é pontuada como 0, 1~10% de células coradas pontuado como 1, 11~50% como 2, 51~80% como 3 e 4. 81~100% como a intensidade da coloração é classificado numa escala de 0 a 3, com 0, negativo; 1, fraco; 2, moderada; e 3, forte. Quando há imunorreactividade multifocal e existem diferenças significativas na intensidade de coloração entre focos, a média do menos intenso e mais intensa coloração foi gravado. Os dados brutos foram convertidos para a ISS multiplicando a pontuação frequência ea pontuação intensidade de coloração. Teoricamente, o ISS pode variar de 0 a 12. Um ISS de 9~12 forte imunorreatividade foi considerado, 5~8 foi considerada moderada, 1~4 foi considerada fraca, e 0 foi marcado como negativo. Seções em que a coloração não puderam ser bem caracterizados foram considerados equívoco.}

Análise Western Blot

tumorais emparelhados e PCHNT espécimes de 20 casos foram selecionados aleatoriamente a partir de 202 pacientes com câncer gástrico para análise de western blot. A proteína total foi extraído e depois quantificado usando o método de Lowry [26]. A análise Western blot foi efectuada utilizando anticorpos monoclonais anti-XAF1 (Santa Cruz, CA) de acordo com o relatório anterior [6]. β-tubulina foi servido como um controlo interno.

Extração de DNA, bissulfito de Reforma e em tempo real metilação específico-PCR (MSP)

As secções em série de 5 mm que continham carcinoma e não-neoplásica tecidos foram montadas em lâminas de vidro não revestido e seco a 37 ° C durante a noite. Após desparafinização e coloração com hematoxilina e eosina (H & E), foram coletadas 5.000 núcleos dos 5 aos 10 cortes seriados usando uma agulha 27G. Os núcleos recolhidos foram tratados com 40 ml de 200 mg /ml de proteinase K (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) a 42 ° C, durante 72 h. A tecnologia conta paramagnética (kit AxyPrep Mag sangue ADNg, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) foi utilizado para isolar o ADN genómico a partir de sangue fresco de acordo com o protocolo do kit. O protocolo consiste no seguinte passo: lise, ligação, lavagem e eluição. Os contaminantes são removidos durante os passos de ligação e de lavagem. A qualidade do ADN foi avaliada pela razão A260 /280 no espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), a integridade do ADN foi verificada por electroforese em gel desnaturante de agarose.

ADN foram modificados pela Bissulfito de sódio utilizando o kit EpiTect bissulfito (Qiagen Inc.) seguindo as instruções do fabris. DNAs modificados foram analisados ​​por MSP em tempo real sobre o ABI7500 PCR (ABI) utilizando o Kit de SYBR Pré-mistura de Taq ExTaq (Takara Co. Ltd). XAF1
primers específicos de metilação e unmethylation foram concebidos como segue: XAF1
(MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1
(UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. O DNA genómico humano (NEB) tratado por SSSI metiltransferase in vitro foi usado como um controlo positivo. Um DNA do sangue periférico de um indivíduo saudável foi utilizado como um controlo negativo. A percentagem de ADN metiladas nas amostras foram calculados de acordo com as referências como descritos anterior [27], [28]. índice de ADN metilado foi pontuada de acordo com a percentagem de metilação de DNA; 0, < 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; e 4, > 80%. O índice de 0 é considerado como unmethylation DNA e dezenas 1-4 foram considerados hypermethylated, respectivamente [7], [27]. O corte limiar de 20% para hipermetilação DNA foi baseado no controle normal de amostras e controlos de qualidade internos obtidos na análise MSP em tempo real.

cultura de células e Drogas Tratamento

linhas celulares de cancro gástrico humano (AGS e KATO-III) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 100 U /mL de penicilina, e 100 U /mL de estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO _{2, respectivamente. As células em cultura foram tratadas com 5-aza-2'-desoxicitidina (5-Aza-CdR) (Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 1,0 umol /L. Tricostatina A (TSA) (Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 20 ng /ml foi administrada após o tratamento 5-Aza ou sozinho durante 24 h. As células foram recolhidas e submetidas a ADN, ARN e purificação de proteínas e subsequente análise.}

Análise estatística

17,0 software estatístico SPSS foi adoptada para a análise de dados. Contando comparações de dados entre os grupos foram submetidos ao χ
^{2 e teste exato de Fisher. A análise de sobrevida foi computered por meio do método de Kaplan-Meier e níveis significativos foram avaliadas por meio do teste de log-rank. A análise univariada com o modelo de regressão de Cox foi utilizada para determinar os fatores prognósticos identificados, e análise multivariada com o modelo de regressão de Cox foi utilizado para explorar os efeitos combinados. Para todas as análises estatísticas, p
valores <. 0,05 foram considerados significância estatística}

Resultados

Down-regulação da XAF1
na Primária gástrica tumores

Para investigar XAF1
perfil de expressão gênica, examinamos a expressão do mRNA de XAF1
em 88 voluntários não-cancerosas, e 202 tecidos com cancro gástrico primários e suas PCHNTs correspondentes. Como mostrado na Figura 1A, o XAF1
expressão foi significativamente reduzida em amostras de cancro gástrico em comparação com o que em controlos normais e PCHNTs ( P < 0,001
). No entanto, não houve diferença significativa no expressão XAF1
em PCHNTs, em comparação com controles não-cancerosas.

Além disso, XAF1
expressão foi significativamente menor nos tumores avançados (estágio III /IV) do que em tumores em fase inicial (fase I /II) ( p <
0,0001, Figura S1A) e foi significativamente menor nos tumores pouco diferenciados do que no bem /tumores moderadamente diferenciados ( p <.
0,0001, Figura S1B)

Para verificar o nível de proteína XAF1 em tecidos com câncer gástrico, foi realizada análise imuno-histoquímica nos 202 tecidos de câncer gástrico e suas PCHNTs correspondentes. expressão XAF1 Nuclear foi consistentemente presentes no epitélio gástrico normal, mostrando pontuações imunoreativos elevados. A expressão da proteína foi detectada em XAF1 nível elevado em 97,5% (197/202) dos PCHNTs (Figura 1B). No entanto, de expressão elevada de proteína XAF1 foi apenas detectada em 16,8% (34/202) de tecidos de cancro gástrico; maioria dos tecidos com cancro gástrico estavam ausentes ou em um nível baixo de proteína XAF1 (Figura 1C). Os achados imuno-histoquímicos são resumidos na Tabela 1. A pontuação coloração imuno-histoquímica em tecidos de cancro gástrico foi significativamente mais baixa do que em PCHNTs ou em controlos normais ( P < 0,0001
, Figura 1D). A perda de proteína XAF1 significativamente correlacionada com H. pylori
infecção, tamanho do tumor, diferenciação histológica, invasão linfática, invasão venosa, profundidade invasiva, metástase linfonodal, metástases à distância e estágio clínico (Tabela 1) (todo o p <
0,05)
.

A imunofenotipagem de 20 tecidos de câncer gástrico foram também confirmadas por meio de análise de western blot. O representante resultados de transferência Western em dois casos foram mostrados na Figura 1E. A quantidade relativa de expressão de proteína XAF1 foi normalizado ao β-tubulina das mesmas amostras. O nível médio de proteína XAF1 em 20 tecidos de câncer gástrico foi significativamente menor do que em PCHNTs ( p Art < 0,05). (Figura 1F)

hipermetilação do promotor de XAF1
na Primária gástrica tumores

para investigar os mecanismos moleculares para a XAF1
silêncio em cancros gástricos, aplicamos uma tecnologia MSP em tempo real para estudar o estado de metilação do DNA de XAF1
promotor. A frequência de XAF1
hipermetilação em tecidos com câncer gástrico, PCHNTs correspondentes e controles não-cancerosas foram de 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) e 5,7% (5/88), respectivamente. A frequência hipermetilação do XAF1
em cânceres é significativamente maior do que em PCHNTs e controles não-cancerosas (todo o p Art < 0,0001, Figura 2).

De nota , o estado desnaturado da XAF1
significativamente correlacionada com alguns parâmetros clínico-patológicos em câncer gástrico, tais como metástases em linfonodos, T-estágio, H
. pylori
, etc (todos p <
0,05, Tabela 2). Nenhuma correlação significativa entre a hipermetilação do XAF1 Comprar e sexo, idade no momento do diagnóstico, local do tumor e metástases à distância foi evidenciado (todo o p Art > 0,05). (Tabela 2)

XAF1
hipermetilação do promotor está associada à sua transcrição silenciamento em células de câncer gástrico

Para examinar as relações entre XAF1
metilação e expressão XAF1
, comparamos o XAF1
nível de metilação com XAF1
níveis nível de proteína e mRNA determinados por análise imuno-histoquímica (Figura 3A) ou western blot (Figura 3B) pela análise de correlação de Spearman. Como mostrado na Figura 3A-, a expressão da proteína XAF1 (determinado por análise de imuno-histoquímica) em 202 tecidos GC foi estreitamente correlacionada com XAF1
nível de ARNm [LG (T /N)] (determinado por RT-PCR) ( γ
= 0,841, p <
0,0001). Mais importante, XAF1
nível de metilação foi significativamente associada com XAF1
nível de mRNA ( γ
= - 0,846, p <
0,0001) e proteína XAF1 nível ( γ
= -0,969, p <
0,0001). Foram obtidos resultados semelhantes quando se analisa a correlação de XAF1
metilação do promotor e a expressão da proteína XAF1 determinado por análise de Western blot (Figura 3B). Estes resultados fortemente indiciados que XAF1
expressão é regulada pelo XAF1
metilação do promotor.

5-Aza-CdR Administração restaura a expressão das XAF1

Para confirmar ainda mais a regulação epigenética da XAF1
expressão, células AGS e KATO-III foram tratados com 5-Aza-CdR e /ou TSA. XAF1
expressão de ARNm foi reactivada em ambas as linhas celulares de cancro gástrico, acompanhada por desmetilação de XAF1
promotor (Figura 4), indicando que XAF1
é transcricionalmente silenciados nestas células por hipermetilação do ADN. Curiosamente, o tratamento TSA só foi eficaz em restaurar expressão XAF1
em AGS e KATO-III, sem alteração significativa da XAF1
nível de metilação, sugerindo que as modificações de histonas também podem estar envolvidos na regulação da expressão XAF1
. No entanto, a administração de TSA seguinte 5-Aza-CdR teve um efeito aditivo na restauração da expressão do gene com uma diminuição adicional no nível de metilação XAF1
. Estes resultados estão de acordo com estudos recentes que sugerem que o TSA pode ter um efeito desmetilação de um modo específico do gene de [5]. A análise por Western blot utilizando células AGS, como um modelo, confirmou a regulação positiva de proteínas XAF1 sequência da 5-Aza-CdR tratamentos /TSA 5-Aza-CdR e (Figura 4).

A detecção de circulação XAF1
metilação

Detectamos alta frequência de XAF1
metilação no câncer gástrico primário (83,2%), sugerindo que pode ser um bom biomarcador se XAF1
metilação pode ser detectável no soro. Portanto, nós examinamos XAF1
metilação nos DNAs soro correspondentes em 202 pacientes do GC. XAF1
metilação foi detectada em 141 (69,8%) Os DNAs de soro de 202 pacientes com cancro gástrico (Figura 5). Em contraste, XAF1
metilação não foi detectada em DNAs de soro dos controles não-cancerosas 88.

Em seguida, confirmaram a consistência no XAF1
metilação entre os tecidos tumorais e soro correspondente. Em 168 casos que apresentaram XAF1
metilação em tecidos tumorais, 141 exibida XAF1
metilação no seu soro emparelhado, dando uma consistência de 83,9% entre eles. E nos 34 pacientes com câncer gástrico sem XAF1
metilação em seus tecidos com câncer gástrico, não metilação foi encontrado em todos os DNAs de soro (Figura S2).

XAF1
metilação como um biomarcador para o diagnóstico de câncer gástrico

Para avaliar o valor de XAF1
metilação como um biomarcador para o diagnóstico de GC, nós traçamos receiver operating characteristic (ROC) curvas e área calculada sob a curva (AUC), utilizando dados de metilação do DNA de ambos os tecidos de GC e soros. Tanto o ROC análises de XAF1
metilação em tecidos e soros revelaram capacidade discriminativa significativa (Figura 6); o valor AUC dos tecidos XAF1
metilação foi 0,849 (intervalo de confiança de 95%, 0,806-0,892; p Art < 0,0001), o valor AUC do soro metilação AXF1
foi 0,909 (intervalo de confiança de 95%, 0,875-0,942; p Art < 0,0001).

Além disso, como XAF1
estado de metilação em tecidos com câncer gástrico e os soros significativamente correlacionada com metástases em linfonodos, T-estágio, estágio clínico, e outros parâmetros clínico-patológicos (tudo p <
0,05, Tabela 2)

XAF1
metilação. correlacionada com o prognóstico de pacientes com câncer gástrico

a correlação significativa de XAF1
metilação com muitos parâmetros clínico-patológicos (Tabela 2) sugeriu que pode associar-se com o prognóstico dos pacientes com câncer gástrico. Até a data de vencimento de Acompanhamento, 113 de 168 pacientes com XAF1
hipermetilação em tecidos com câncer gástrico foi rápida progressão da doença ou morte. A sobrevida livre de doença Mediana (DFS) foi de apenas 23,4 meses. Em contraste, nos 34 pacientes sem XAF1
hipermetilação em seus tecidos com câncer gástrico, apenas 5 pacientes estavam se deteriorando, ea mediana DFS foi de 39,6 meses. A análise de Kaplan-Meier demonstrou que pacientes com XAF1
hipermetilação em seus tecidos com cancro gástrico apresentaram uma pior sobrevida óbvio do que isso, sem XAF1
hipermetilação ( p <
0,0001) (Figura 7A). Da mesma forma, a análise de Kaplan-Meier mostrou que os pacientes com soro positivo XAF1
metilação teve DFS significativamente menor do que nos pacientes sem soro XAF1
metilação ( p Art < 0,0001 ) (Figura 7B), indicando que XAF1
metilação do promotor no soro foi um preditor desfavorável para os pacientes com câncer gástrico.

a análise de regressão de Cox revelou que XAF1
metilação em soros é um fator independente na sobrevida dos pacientes: pacientes com XAF1
metilação tiveram pior prognóstico ( p <
0,0001; hazard ratio, 5,710; 95% CI, 3.474~9.383). Além disso, estágios TNM e idade no momento do diagnóstico pode ser considerado como o factor de influência do prognóstico no câncer gástrico, somente quando o efeito de XAF1
metilação foi eliminado. Além disso, circulando metilado XAF1
no sangue tiveram um impacto maior sobre o prognóstico do que em estágios TNM (Tabela S1).

Transição positiva de circulação XAF1
metilação prevê Tumor recorrência e prognóstico ruim

Entre os 202 pacientes que foram avaliadas para pré-operatória circulando XAF1
metilação, 72 pacientes receberam exames de acompanhamento de circular XAF1
metilação 2~5 vezes em intervalos de 1~6 meses após a cirurgia. Entre 12 pacientes recorrentes, 10 pacientes apresentaram negativos-se positiva transição em XAF1
estado de metilação nos seus soros, os outros dois mostraram sempre positivo para o XAF1
metilação, o que sugere que o monitoramento da XAF1
metilação no soro pode ser um bom marcador para prever a recorrência do tumor (Tabela 3).

Discussão

XAF1
( XIAP
factor de -associated 1) é um romance XIAP
proteína que poderia perturbar a combinação de ligação de XIAP
com caspases, suprime a sua protecção em células de tumor e resulta em apoptose de células de tumor [12] - [ ,,,0],14]. A função anti-apoptose de XIAP
é determinado pela relação dos níveis de XIAP
expressão contra o XAF1
[15]. expressão ou silêncio do reduzida XAF1
é um evento freqüente em tumores humanos [16] - [19]. No presente estudo, primeiro confirmou que XAF1
expressão do gene foi significativamente regulada para baixo nos dois níveis de mRNA e nível de proteína em um grande painel de tecidos de câncer gástrico primários, e a regulação da XAF1
expressão foi significativamente associada com os estágios de tumores, metástases e assim por diante, implicando perda de função XAF1
na progressão tumoral. Isto é consistente com outros relatórios de investigação [17] - [19]. Para explorar os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela XAF1
silêncio, examinamos XAF1
metilação do promotor em um grande painel tecidos de câncer gástrico ( n
= 202) e controles normais ( N
= 88) utilizando uma tecnologia de MSP em tempo real. Foi detectada uma alta frequência (83,2%) de hipermetilação DNA de XAF1
em tecidos com câncer gástrico. A hipermetilação DNA de XAF1
correlacionada significativa com a infra-regulação da XAF1
em ambos os mRNA e os níveis de proteína em tecidos de câncer gástrico (Figura 3). Além disso, o tratamento com 5-Aza-CdR significativamente restaurado expressão XAF1
em XAF1
silenciados linhas celulares de cancro gástrico (Figura 4). Estes dados sugerem fortemente que frequente down-regulação da XAF1
em células de câncer gástrico é regulada pelo seu hipermetilação do promotor. Curiosamente, o tratamento de células de cancro gástrico com TSA, um inibidor da histona desacetilase também restaurou XAF1
expressão, sozinho ou combinado com o tratamento com 5-Aza-CdR, indicando que a modificação da histona pode também ser envolvido em XAF1 <. br> regulação

metilação de ADN pode ser utilizada como um biomarcador potencial de tumor em vários cancros humanos [3] - [11], [23]. A presença de ADN isento de células em circulação no sangue periférico tem sido descrita em pacientes com processos malignos, e libertação activa de ADN do tumor para a circulação tem sido relatada [29] - [31]. Numerosos estudos demonstraram alterações específicas do tumor em ADN recuperado a partir de plasma ou soro de pacientes com várias doenças malignas que correspondem a alterações genéticas presentes em tumores primários, uma descoberta que tem potencial para diagnóstico e prognóstico molecular [29] circulante - [32]. Os marcadores de ácido nucleico descritas em ADN em circulação incluem mutações de oncogene, alterações de microssatélites, rearranjos de genes e alterações epigenética, tais como hipermetilação aberrante promotor [7], [8], [30] - [34]. Com base nestas observações, especialmente se detectou uma elevada frequência de XAF1
metilação do DNA em tecidos com câncer gástrico (83,2%), decidimos explorar a possibilidade de usar XAF1
metilação do promotor em o soro como biomarcador em doentes com cancro gástrico. Primeiro, demonstrou uma grande consistência na detecção de XAF1
metilação entre soros e tecidos de câncer gástrico primários. Em seguida, analisamos a possibilidade de utilizar circulante metilado XAF1
como marcador de diagnóstico utilizando a análise ROC. A AUC (área sob a curva) de 0,909 demonstrou um alto valor diagnóstico de detectar XAF1
metilação em amostras de soro. Por conseguinte, os nossos dados sugerem que a detecção de XAF1
metilação em ADN em circulação poderia ser utilizado como um biomarcador não invasivo para o diagnóstico de cancro gástrico. Além disso, nossos resultados também mostraram que positiva XAF1
metilação no soro foi um fator prognóstico independente; prever mau prognóstico. Mais interessante, a transição de negativo para positivo de circular XAF1
metilação após a cirurgia foi significativamente associada com recorrência do tumor. Estes dados indicam que a detecção de XAF1
metilação no DNA circulante no soro também pode ser um biomarcador tumoral para predizer o prognóstico dos pacientes com câncer gástrico e para monitorar a recorrência do tumor após o tratamento cirúrgico. Porque o número dos pacientes foram submetidos a esse exame de soro de seguimento foi pequena, mais pesquisas em uma grande amostra de número de pacientes são necessários para confirmar esse achado interessante e para otimizar a estratégia e o protocolo para o efeito. Em qualquer caso, comparando com as formas tradicionais como o exame gastroscopia para pacientes com câncer gástrico, a característica mais notável de circular metilado XAF1
detecção é eficiente, rápido, de baixo custo, não invasivo, o ambiente não destruir, de alta taxa de conformável de diagnóstico e assim por diante, e como tal demonstrar perspectivas de aplicação importantes no futuro.

Conclusões

a disfunção de XAF1
é frequente e é regulada através de XAF1
hipermetilação do promotor no câncer gástrico. Circulantes metilado XAF1
ADN foi associada com a carga tumoral e progressão maligna, o que pode ser um biomarcador importante para o diagnóstico de cancro gástrico, predizer o prognóstico dos doentes e monitorizar a recorrência do tumor após o tratamento cirúrgico.

Apoiando informações
Figura S1.
jpg. A, XAF1
nível de expressão do gene foi menor no cancro gástrico avançado (fase III /IV) do que no câncer gástrico precoce (fase I /II). B, XAF1
nível de expressão do gene foi menor no cancro gástrico pouco diferenciado do que no bem /moderadamente câncer gástrico (bem /Mod) diferenciado, p <
0,05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067195.s001
(TIF)
Figura S2.
jpg. A análise de correlação de XAF1
resultados hipermetilação entre tecidos GC e sangue emparelhado periférica (soros)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067195.s002
(TIF)
Tabela S1.
xls. A análise multivariada dos dados clínico-patológico de 202 casos de carcinoma gástrico.

• PLOS ONE: Uma Nova subclassificação do pT4 câncer gástrico acordo com a largura da serosa Invasion
• PLOS ONE: Janus quinase 2 polimorfismos estão associados com risco em pacientes com câncer gástrico em uma população chinesa