PLOS ONE: Cirkulerande Methylated XAF1 DNA Anger dålig prognos för Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

metylerat DNA i vätskor kan vara en lämplig biomarkör för cancerpatienter. XAF1
har visats vara frekvent nedreglerade i human magcancer (GC). Här undersökte vi om XAF1
metylering i GC kan vara en användbar biomarkör.

Metoder

i realtid RT-PCR användes för att detektera XAF1
mRNA-expression; immunohistokemi och Western blöt användes för att undersöka XAF1 proteinuttryck i GC vävnader (n = 202) och deras motsvarande para-cancerös histologiska normala vävnader (PCHNTs). Realtid metylering specifik PCR användes för att undersöka XAF1
promotor metylering i samma panel av GC vävnader, deras PCHNTs och sera.

Resultat

Vi bekräftade täta XAF1
nedreglering i både mRNA och proteinnivåer i GC vävnader jämfört med normala kontroller och PCHNTs. XAF1
hypermethylation bevisades i 83,2% (168/202) av GC vävnader och 27,2% (55/202) av PCHNTs, medan ingen metylering upptäcktes i 88 normala kontroller. Metyleringen nivån i GC vävnader var signifikant högre än den i PCHNTs ( p <
0,05). Den hypermetylering av XAF1
signifikant korrelerad med nedreglering av XAF1
i GC vävnader i både mRNA och proteinnivåer ( p Hotel < 0,001 vardera). Dessutom upptäckte vi hög frekvens av XAF1
metylering (69,8%, 141 av 202) i serum-DNA från samma patienter, medan sera DNA från 88 icke-tumör kontrollerna var negativa för XAF1
metylering. XAF1
metylering i både GC vävnader och i serum kan vara en bra biomarkör för diagnos av GC (AUC = 0,85 för vävnad och AUC = 0,91 för sera) och signifikant korrelerad med sämre prognos ( p Hotel < 0,001). Dessutom, efter operation negativ till positiv övergång av XAF1
metylering i sera starkt förknippat med tumörrecidiv.

Slutsatser

1) dysfunktion XAF1
är frekvent och regleras genom XAF1
promotor hypermethylation; 2) Upptäckt av cirkulerande denaturerad XAF1
DNA i serumet kan vara en användbar biomarkör vid diagnos, utvärdering av patientens utfall (prognos och återfall) för GC patienter

Citation. Ling ZQ, Lv P Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) Cirkulerande Methylated XAF1
DNA Anger dålig prognos för magcancer. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10.1371 /journal.pone.0067195

Redaktör: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA

emottagen: 12 mars, 2013; Accepteras: 16 maj 2013; Publicerad: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Ling et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Denna forskning stöddes av ett bidrag från Science and Technology General Project i Zhejiang-provinsen (nr. 2009C33143), och dels av ett bidrag från ryggraden Talent Zhejiang Provincial medicin och hygien Platform program (nr. 2011RCA009). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är en av de vanligaste cancerformerna i Kina, med en hög förekomst och dödlighet, ungefär står för 10% av alla maligniteter [1]. Gastrisk tumörgenes är en komplicerad, flerstegsprocess som involverar förändringar av många gener [2]. Avvikande promotor metylering är en av de viktigaste mekanismer för att tysta vissa tumörsuppressorgener och tumörrelaterade gener och spelar mycket viktiga roller i patogenesen och progression i humana cancrar [3], [4] - [6], inklusive magcancer [7] [8]. Samtidigt ackumulera data antyder starkt att DNA-metylering skulle kunna vara användbar och kraftfull biomarkör i cancerrisk utvärdering [5], [7], tidig diagnos [7], förutsäga patientens prognos [7], [8], och utvärdera känsligheten för kemoterapeutiska läkemedel [9]. Vår senaste undersökning och andra undersökningar visade att detektera cirkulerande metylerat DNA i blod är en potent och praktisk metod för patienter [7] cancer, [10], [11].

X-bunden inhibitor av apoptos ( XIAP
) -associated faktor 1 ( XAF1
) är en ny negativ regulator av XIAP
, som vänder XIAP skydd roll på tumörceller [12] - [14]. Förlusten av XAF1
uttryck kommer att göra tumörceller resistens mot apoptos och främja tumörcellöverlevnad [14] - [17]. Dysfunktion av XAF1
har rapporterats i flera humana cancer sannolikt genom promotor metylering [15] - [19], vilket tyder på dess betydelse i tumörbildning. I human magcancer, XAF1
har rapporterats vara ofta och betydligt nedregleras och denna nedreglering av XAF1
förmodligen genom DNA hypermethylation specifika CpG platser [15], [16 ], [18]. Men finns om ingen rapport XAF1
metylering i blodet och dess potential som biomarkör. I den aktuella studien undersökte vi XAF1
promotor metylering i parade vävnads- och serumprover från en stor panel av patienter med magcancer, och utvärderas cirkulerande denaturerad XAF1
som en potentiell biomarkör för magcancer .

Material och metoder

Etik Statement

De identifierade humana vävnadsprover och sera erhölls från Zhejiang-provinsen Human vävnadsprov Bank. Användningen av prover godkändes av Institutional Review Board vid Zhejiang-provinsen cancersjukhus. Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje patient i enlighet med de krav som vår institutions styrelse etik. 88 icke-cancer frivilliga förutsatt skriftligt informerat samtycke. En del av proverna från Zhejiang-provinsen folk sjukhus och de första människorna sjukhus i Chunan County. Institutional Review Board medicinsk etik i provinsen Zhejiang folkets sjukhus och de första människorna sjukhus i Chunan County godkänt metoden för provtagning inbegripet skriftligt informerat samtycke från alla patienterna.

vävnadsprov

parade tumör och para-cancer histologiska normala vävnader (PCHNT) prover samlades in i samband med kirurgi från 202 patienter med primär adenocarcinom i ventrikeln vid Zhejiang-provinsen cancersjukhus, Zhejiang-provinsen folksjukhus och de första människorna sjukhus i Chunan County från januari 2008 till december 2009. PCHNT bedömdes mikroskopiskt med avseende på närvaron av normala celler och frånvaro av dysplastiska celler. Inget av dessa fall hade genomgått någon medicinsk behandling före operation. Demografiska, kliniska och histopatologiska parametrar för dessa fall visades i Tabell 1. tillväxtmönster av tumörceller bestämdes enligt Ming klassificering [20]. Alla rekryterade patienter hade följts upp med jämna mellanrum fram till förfallodagen. Antral mucosa biopsiprover från 88 icke-cancer volontärer från gastroskopi randomiserades samlas som kontroller inom samma period, inklusive 54 män och 34 kvinnor, med en medelålder på 52,9 år. Bland dessa frivilliga fick 48 patienter diagnostiserade med kronisk icke-atrofisk gastrit. Samtidigt har parade serumprover före kirurgi eller endoskopi.

Analys av Helicobacter Pylori ( H. Pylori
) Infektion

Biopsier erhölls från alla patienter som hade endoskopisk undersökning . H
. pylori
status bestämdes genom snabb ureastest och Giemsa färgningsmetoder [21], [22]. Det ansågs som H
. pylori
infektion när båda testerna var positiva, och proverna med enda positiva uteslöts för statistisk analys [22].

Realtids RT-PCR

mRNA uttryck av XAF1
analyserades genom realtids-RT-PCR [23]. Totalt RNA extraherades med användning av Trizol (Gibco). Totalt 3 | ig totalt RNA utsattes för omvänd transkription med användning av M-MLV omvänt transkriptas (Promega). Glyceraldehyd fosfatdehydrogenas ( GAPDH
) valdes som intern referens. Sekvenserna av XAF1
primrar var enligt följande: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R) 5'GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3'. GAPDH
primersekvenser var följande: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. Den 2 ^{-ΔΔCt metod användes för att beräkna relativa förändringar i genuttryck.}

immunhistokemisk färgning

Expressionen av XAF1 protein bestämdes genom immunohistokemisk analys med XAF1 monoklonal antikropp (Santa Cruz Biotechnology ). Immunohistokemisk färgning för XAF1 genomfördes med användning av representativa paraffininbäddade prover från GC patienter 202. Efter avparaffinering, antigenåtervinning i 0,01 M citratbuffert, och inaktivering av endogen peroxidasaktivitet i 3% H _{2O 2 /metanol, inkuberades vi objektglasen med antikropp för XAF1 vid 4 ° C över natten, och immunhistokemisk färgning, efter en standard avidinbiotinreaktion-peroxidas komplex teknik, utfördes med användning av 3,3'-diaminobensidin (DAB) som kromogen. Kärnor motfärgades med hematoxylin. Den immunhistokemisk färgning poäng (ISS) bestäms av tre oberoende patologer kombinerar färgning frekvens och intensitet som följer [24], [25]: ingen färgning räknas som 0, 1~10% av celler färgade gjorde som en, 11~50% som två, 51~80% som 3, och 81~100% som 4. färgningsintensitet har fått betyget på en skala från 0-3, där 0, negativ; 1, svag; 2, måttlig; och 3, stark. När det finns multifokal immunreaktivitet och det finns betydande skillnader i färgningsintensitet mellan fokus, var medelvärdet av minst intensiva och mest intensiva färgning registreras. Rådata omvandlades till ISS genom att multiplicera frekvensen poäng och färgningsintensitetspoäng. Teoretiskt ISS kan variera från 0 till 12. En ISS av 9~12 ansågs stark immunoreaktivitet var 5~8 anses måttlig, 1~4 ansågs svag, och 0 bedömdes som negativt. Avsnitt som färgningen inte kunde väl karakteriserade ansågs tvetydiga.}

Western blot-analys

Paired tumör och PCHNT exemplar av 20 fall var slumpmässigt utvalda från 202 gastric patienter för Western blot-analys cancer. Totalt protein extraherades och kvantifierades sedan med användning av Lowry-metoden [26]. Western blot-analys utfördes med användning av anti-XAF1 monoklonala antikroppar (Santa Cruz, CA) enligt tidigare rapport [6]. β-tubulin serverades som en intern kontroll.

DNA-extraktion, bisulfit Modifiering och realtid metylering specifik PCR (MSP) Review

Serial 5 mm sektioner som innehöll cancer och icke-neoplastiska vävnader monterades på icke-belagda glasskivor och torkades vid 37 ° C över natten. Efter avparaffinering och färgning med hematoxylin och eosin (H & E), samlade vi 5000 kärnor från 5 till 10 seriella sektioner med hjälp av en 27G nål. De uppsamlade kärnorna behandlades med 40 ml av 200 mg /ml proteinas K (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) vid 42 ° C, under 72 timmar. Den paramagnetiska pärlan teknik (AxyPrep Mag Blood gDNA kit, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) användes för att isolera genomiskt DNA från färskt blod enligt satsens protokoll. Protokollet består av följande steg: lysering, bindning, tvättning och eluering. Föroreningar avlägsnas under de bindande och tvättstegen. Kvaliteten av DNA bedömdes av A260 /280-förhållandet vid Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), DNA-integriteten kontrollerades genom denaturerande agarosgelelektrofores.

DNA modifierades genom natriumbisulfit använda EpiTect bisulfit kit (Qiagen Inc.) efter Manu instruktioner. Modifierade DNA: n analyserades genom realtids-MSP på ABI7500 PCR (ABI Co.) med användning av SYBR Premix Taq ExTaq Kit (Takara Co. Ltd). XAF1
metylering och unmethylation specifika primrar utformades på följande sätt: XAF1
(MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1
(UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. Humant genomiskt DNA (NEB) behandlas genom SSSI metyltransferas in vitro användes som en positiv kontroll. Ett perifert blod-DNA från en frisk försöksperson användes som en negativ kontroll. Den procentuella andelen metylerade DNA i proverna beräknades enligt referenserna som tidigare beskrivits [27], [28]. Metylerat DNA index bedömdes enligt den procentsats av DNA-metylering; 0 < 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; och 4 > 80%. Den indexvärde av 0 anses som DNA unmethylation och poängen 1-4 ansågs hypermethylated respektive [7], [27]. 20% avskurna tröskeln för DNA hypermethylation baserades på kontroll normala prover och interna kvalitetskontroller som erhållits i MSP analys i realtid.

cellodling och droger behandling

Mänskliga gastric cancercellinjer (AGS och KATO-III) odlades i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 100 U /ml penicillin och 100 U /ml streptomycin vid 37 ° C och 5% CO _{2, respektive. Odlade celler behandlades med 5-aza-2'-deoxicytidin (5-aza-CdR) (Sigma-Aldrich) vid en slutlig koncentration av 1,0 | imol /l. Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich) vid en slutkoncentration av 20 ng /ml administrerades efter 5-aza behandling eller enbart under 24 h. Celler samlades och utsattes för DNA, RNA och proteinrening och efterföljande analyser.}

Statistisk analys

SPSS 17,0 statistisk programvara antogs för dataanalys. Räkna jämförelser av uppgifter mellan grupper utsattes för χ
^{2 test och Fishers exakta test. Överlevnadsanalys var computered med hjälp av Kaplan-Meier-metoden och betydande nivåer bedömdes med hjälp av log-rank test. En univariat analys med Cox regressionsmodell användes för att bestämma identifierade prognostiska faktorer, och multivariat analys med Cox regressionsmodell användes för att undersöka kombinerade effekterna. För alla statistiska analyser, p
värden. ≪ 0,05 ansågs vara statistisk signifikans}

Resultat

nedreglering av XAF1
i Primär Gastric tumörer

för att undersöka XAF1
genuttryck profil, undersökte vi mRNA-uttryck av XAF1
i 88 icke-cancer frivilliga och 202 primära magcancer vävnader och deras motsvarande PCHNTs. Som visas i figur 1A, XAF1
uttryck reducerades signifikant i magcancer prover jämfört med det i normala kontroller och PCHNTs ( p <
0,001). Det fanns dock ingen signifikant skillnad i XAF1
uttryck i PCHNTs jämfört med kontroller icke-cancer.

Dessutom XAF1
uttryck var signifikant lägre i avancerade tumörer (steg III /IV) än i tumörer tidigt stadium (stadium i /II) ( p <
0,0001, figur S1A), och var signifikant lägre i dåligt differentierade tumörer än i väl /måttligt differentierade tumörer ( p. <
0,0001 figur S1B) katalog

för att kontrollera XAF1 proteinnivå i magcancer vävnader, utförde vi immunohistokemisk analys i 202 magcancer vävnader och deras motsvarande PCHNTs. Kärn XAF1 uttryck var genomgående närvarande i det normala gastric epitel visar höga immunoreaktiva poäng. Den XAF1 protein uttryck detekterades i hög nivå i 97,5% (197/202) av PCHNTs (Figur 1B). Men högt uttryck av XAF1 protein endast detekterades i 16,8% (34/202) av magcancer vävnader; majoriteten av gastriska cancervävnader var frånvarande eller vid en låg nivå av XAF1 protein (Figur 1C). De immunohistokemiska Resultaten sammanfattas i Tabell 1. immunhistokemisk färgning poäng i magcancer vävnader var betydligt lägre än i PCHNTs eller i normala kontroller ( p <
0,0001, figur 1D). Förlusten av XAF1 protein signifikant korrelerade med H. pylori
infektion, tumörstorlek, histologiska differentiering, lymfatiska invasion, venös invasion, invasiv djup, lymfkörtel metastas, fjärrmetastaser och kliniska stadiet (tabell 1) (alla p <
0,05) katalog.

De immunohistokemiska resultat av 20 magcancer vävnader bekräftades ytterligare genom Western blot-analys. De representativa Western blotting resultat i två fall visades i figur 1E. Den relativa kvantiteten av XAF1 proteinexpression normaliserades till den β-tubulin av samma prover. Den genomsnittliga XAF1 proteinnivå i 20 gastriska cancervävnader var betydligt lägre än i PCHNTs ( p Hotel < 0,05). (Figur 1F) Review

Promoter Hypermetylering av XAF1
i Primär Gastric tumörer

för att undersöka de molekylära mekanismerna för XAF1
tystnad i gastric cancer, tillämpade vi en realtids MSP-teknik för att studera DNA-metylering status XAF1
promotor. Frekvensen av XAF1
hypermethylation i magcancer vävnader, motsvarande PCHNTs och kontroller icke-cancer var 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) och 5,7% (5/88), respektive. Den hypermetylering frekvensen av XAF1
i cancer är betydligt högre än i PCHNTs och kontroller icke-cancer (alla p Hotel < 0,0001, Figur 2).

Notera , den metylerade status XAF1
signifikant korrelerad med några klinisk-patologiska parametrar i magcancer, såsom lymfkörtel metastas, T-stadiet, H
. pylori
infektion, etc (alla p <
0,05, tabell 2). Ingen signifikant korrelation mellan hypermetylering av XAF1 Mössor och kön, ålder vid diagnos, tumörstället och fjärrmetastaser bevisades (alla p Hotel > 0,05). (Tabell 2) Review

XAF1
Promoter Hypermetylering förknippas med dess transkriptions Tysta i Gastric cancerceller

för att undersöka förhållandet mellan XAF1
metylering och XAF1
uttryck, jämförde vi XAF1
metylering nivå med XAF1
mRNA-nivå och proteinnivåer bestäms antingen genom immunhistokemisk analys (figur 3A) eller western blotting (figur 3B) genom korrelationsanalys av Spearman. Som visas i figur-3A, XAF1 proteinuttryck (bestämd genom immunhistokemisk analys) i 202 GC vävnader nära korrelerad med XAF1
mRNA-nivå [lg (T /N)] (bestäms av RT-PCR) ( γ
= 0,

• PLOS ONE: En ny underindelning av PT4 magcancer Enligt bredd serosala Invasion
• PLOS ONE: januskinas 2 Polymorphisms är förknippade med risk hos patienter med magcancer i en kinesiska befolkningen