Ploche ONE: obehové metylovaných XAF1 DNA Označuje zlú prognózu pre žalúdočné Cancer

abstraktné

Pozadie

methylata DNA v tekutinách môže byť vhodný biomarker pre pacientov s rakovinou. XAF1
bolo preukázané, že je často down-regulovaný u karcinómu žalúdka človeka (GC). Tu sme skúmali, či XAF1
metylácie v GC by mohol byť užitočným biomarkery.

Metódy

Real-time RT-PCR bola použitá na detekciu XAF1
expresie mRNA; imunohistochémia a western blot bol použitý na skúmanie expresie XAF1 proteínu v tkanivách GC (n = 202) a ich zodpovedajúce para-rakovinové histologické normálnych tkanív (PCHNTs). Real-time metylácie špecifický-PCR bola použitá vyšetrovať XAF1
promótor metylácie v rovnakom paneli GC tkanív, ich PCHNTs a sér.

Výsledky

Potvrdili sme časté XAF1
down-regulácia v oboch mRNA a nízka hladina bielkovín v GC tkanivách v porovnaní s normálnymi kontrolami a PCHNTs. XAF1
hypermetylace bolo doložené v 83,2% (168/202) z GC tkanív a 27,2% (55/202) z PCHNTs, zatiaľ čo žiadna metylácie bola zistená u 88 normálnych kontrol. Úroveň metylácie v GC tkanivách bola významne vyššia ako v PCHNTs ( p <
0,05). Hypermetylace zo XAF1
významne koreluje s down-reguláciu XAF1
v GC tkanív v oboch úrovní mRNA a proteín ( p Hotel < 0,001 každý). Navyše sme zistili vysokú frekvenciu XAF1
metylácie (69,8%, 141 z 202) v sére DNA z rovnakých pacientov, zatiaľ čo sera DNA z 88 kontrol nenádorových boli negatívne na XAF1
metylácie. XAF1
metylácie v oboch GC tkanivách a v sére by mohol byť dobrým biomarker pre diagnostiku GC (AUC = 0,85 pre tkanivá a AUC = 0,91 pre séra) a významne koreluje s horšou prognózou ( p Hotel <0,001). Okrem toho, pooperačné negatívne k pozitívnemu prechodu XAF1
metylácie v sére silne spojený s recidívy.

Závery

1) dysfunkcia XAF1
je častá a je regulovaný pomocou XAF1
promótor hypermetylace; 2) Detekcia cirkulujúcich methyluje XAF1
DNA v sére môže byť užitočným biomarkerov v diagnostike, hodnotenie pacienta výsledku (prognózu a opakovanie) u pacientov GC

Citácia :. Ling ZQ, Lv P , Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) obehové methylata XAF1
DNA Označuje zlú prognózu pre rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10,1371 /journal.pone.0067195

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Spojené štáty |

prijatá: 12. marca 2013; Prijaté: 16.mája 2013; Uverejnené: 27. júna 2013

Copyright: © 2013 Ling et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Tento výskum bol podporený grantom z oblasti vedy a techniky generála Project provincia Zhejiang (č. 2009C33143), a čiastočne grantom z chrbticovej Talent provincie Zhejiang lekárstva a hygieny platformy programy (č. 2011RCA009). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších typov rakoviny v Číne, s vysokým výskytom a mortality, čo predstavuje približne 10% všetkých malignít [1]. Žalúdočné vzniku nádorov je zložitý, viacstupňový proces, ktorý zahŕňa zmeny mnohých génov, [2]. Aberantne metylácie promótorom, je jedným z hlavných mechanizmov, umlčať niektoré tumor supresorové gény a gény súvisiace nádorových a hrá veľmi dôležitú úlohu v patogenéze a progresii u ľudských rakovín [3], [4] - [6], vrátane rakoviny žalúdka [7] , [8]. Medzitým sa hromadia dáta silne naznačujú, že metylácie DNA by mohol byť užitočný a výkonný biomarkerov pri hodnotení rizika rakoviny [5], [7], včasná diagnóza [7], predpovedá prognóza pacientov [7], [8], a vyhodnocovanie citlivosti chemoterapeutickej lieky [9]. Naša nedávna štúdia a ďalšie výskumy preukázali, že detekciu cirkulujúcej methylata DNA v krvi je veľmi účinný a praktický prístup pre pacientov s rakovinou [7], [10], [11].

X-viazaná inhibítor apoptózy ( XIAP
) -associated faktor 1 ( XAF1
) je nový negatívny regulátor XIAP
, ktorý obracia úlohu ochrany XIAP o nádorových bunkách [12] - [14]. Strata XAF1
výraz bude činiť nádorových buniek rezistenciu k apoptóze a podporovať prežitie nádorových buniek [14] - [17]. Dysfunkcia XAF1
bola hlásená v niekoľkých ľudských nádorov pravdepodobne cez metylácie promótorom [15] - [19], čo svedčí o jej dôležitosti vzniku nádorov. V ľudskej rakoviny žalúdka, XAF1
bolo hlásené, že je často a výrazne down-regulované, a to down-regulácia XAF1
pravdepodobne cez DNA hypermetylace konkrétnych lokalít CPG [15], [16 ], [18]. Avšak, žiadna správa je k dispozícii o XAF1
metylácie v krvi a jeho moznosti ako biomarker. V tejto štúdii sme skúmali, XAF1
metylácie promótorom v párových vzorkách tkanív a séra z veľkého panelu pacientov s karcinómom žalúdka, a vyhodnocované cirkuláciou methyluje XAF1
ako potenciálny biomarker karcinómu žalúdka .

Materiál a metódy

Prehlásenie o Ethics

De-identifikovanej vzorky ľudských tkanív a séra boli získané z provincie Zhejiang Human vzorky tkaniva Bank. Použitie vzoriek bola schválená Institutional Review Board v provincii Zhejiang nemocnice rakoviny. Písomný informovaný súhlas bol získaný od každého pacienta v súlade s požiadavkami palube našej inštitúcie etiky. 88 non-rakovinové dobrovoľníkov bol získaný písomný informovaný súhlas. Časť vzoriek bolo z provincie Zhejiang ľudovej nemocnice a prvý ľudovej nemocnice Chunan County. Institutional Review Board na lekárskej etiky z provincie Zhejiang ľudovej nemocnice a prvý ľudovej nemocnici Chunan County schválil metódu odberu vzoriek vrátane písomného informovaného súhlasu zo všetkých pacientov, resp.

vzorky tkaniva

párované nádorové a para-rakovinové histologické normálnych tkanív (PCHNT) vzorky boli odobraté v čase chirurgického zákroku z 202 pacientov s primárnym adenokarcinómom žalúdka pri provincia Zhejiang nemocnice rakoviny, provincia Zhejiang ľudovej nemocnice a prvý ľudovej nemocnici Chunan County od januára 2008 do decembra 2009. PCHNT bol hodnotený mikroskopicky na prítomnosť normálnych buniek a absencia dysplastických buniek. Žiadny z týchto prípadov bolo podrobené iné lekárske ošetrenie pred chirurgickým zákrokom. Demografické, klinické a histopatologické parametre týchto prípadov boli uvedené v tabuľke 1. model rastu nádorových buniek bola stanovená v súlade s Mingových klasifikácii [20]. Všetci prijatí pacienti boli sledovaní pravidelne do dátumu splatnosti. vzorky antrálnej sliznice biopsie od 88 nerakovinotvorných dobrovoľníkov gastroskopicky boli náhodne vybrané ako kontrol v rovnakom období, zahŕňajúce 54 mužov a 34 žien s priemerným vekom 52,9 rokov. Z týchto dobrovoľníkov, 48 pacientov s diagnózou chronickej non-atrofickej gastritídy ,. Medzitým párové vzorky séra boli odoberané pred operáciou alebo endoskopia.

Analýza Helicobacter pylori ( H. Pylori
) Infekcia

biopsie boli získané od všetkých pacientov, ktorí mali endoskopické vyšetrenie , H
. pylori
stav bol určený rýchlym testom ureázou a Giemsa farbenia metódy [21], [22]. To bolo považované za H
. pylori
infekcii, kedy oba testy boli pozitívne, a vzorky sa jediný pozitívny boli pre štatistickú analýzu [22].

Real-time RT-PCR

Výraz mRNA vylúčený zo XAF1
bola analyzovaná pomocou real-time RT-PCR [23]. Celkové RNA boli extrahované pomocou TRIzolu (Gibco). Celkom 3 ug celkovej RNA sa podrobí reverznej transkripcii za použitie M-MLV reverznej transkriptázy (Promega). Glyceraldehyd fosfát dehydrogenázy ( GAPDH
) bol vybraný ako vnútorná referencia. Sekvencia XAF1
primery boli nasledujúce: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R), 5' GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3 '. GAPDH
sekvencie primérov boli nasledovné: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. Je 2 ^{-ΔΔCt metóda bola použitá na výpočet relatívnej zmeny v génovej expresii.}

Imunohistochemické farbenie

Expresia XAF1 proteínu bola stanovená imunohistochemické analýzou s XAF1 monoklonálne protilátky (Santa Cruz Biotechnology ). Imunohistochemické farbenie na XAF1 bola vykonaná z reprezentatívneho vzoriek parafínových od pacientov GC 202. Po Deparafinizace, antigén vyhľadávanie v 0,01 M citrátovom pufri, a inaktiváciu endogénnej peroxidázy v 3% H _{2O 2 /metanol, inkubované sklíčka s protilátkou o XAF1 pri teplote 4 ° C cez noc, a imunohistochemického farbenia, nasledujúce štandardné avidinbiotin-peroxidáza komplexu techniky, sa vykonáva za použitia 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) ako chromogénu. Jadrá bola kontrastne hematoxylínom. Imunohistochemické farbenie skóre (ISS) je určená tromi nezávislými patológov kombinujúci frekvenciu a intenzitu farbenie nasledujúcim spôsobom [24], [25]: žiadne farbenie je hodnotená ako 0, 1 ~ 10% buniek z farebného hodnotený ako 1, 11 ~ 50% ako 2, 51 ~ 80% ako 3 a 81 ~ 100%, ako 4. Farbenie intenzita je hodnotená na stupnici od 0 do 3, kde 0, negatívne; 1, slabý; 2, stredné; a 3, silný. V prípade, že je multifokálne imunoreaktivita a existujú výrazné rozdiely v intenzitách farbenie medzi ložiskami, bola zaznamenaná priemerná hodnota najmenej intenzívne a najintenzívnejší farbenie. Hrubé údaje boli prevedené na ISS vynásobením frequency výsledok a ich skóre intensity zafarbenie. Teoreticky by ISS mohol pohybovať v rozmedzí od 0 do 12. ISS z 9 ~ 12 bolo považované za silnú imunoreaktivitu, 5 ~ 8 bola považovaná za mierne, 1 ~ 4 bola považovaná za slabú, a 0 sa vyhodnotí ako negatívny. Sekcia, v ktorom farbenie nemohlo byť dobre charakterizované boli považované za nepresvedčivé.}

Analýza Western Blot

Spárovaná nádorové a PCHNT vzorky 20 prípadoch boli náhodne vybrané z 202 pacientov s karcinómom žalúdka na western blot. Celkové bielkoviny bola extrahovaná a potom kvantifikovaná metódou Lowry [26]. Western blot analýza bola vykonaná za použitia anti-XAF1 monoklonálne protilátky (Santa Cruz, CA) podľa predchádzajúcej správe [6]. β-tubulínu bola slúžila ako vnútorná kontrola.

DNA Extraction, bisulfitová modifikácie a v reálnom čase metylácie Specific-PCR (MSP)

Serial 5 mm úseky, ktoré obsahovali karcinóm a nenádorových tkaniva boli umiestnené na sklenené sklíčka nepokrytých a suší sa pri teplote 37 ° C cez noc. Po Deparafinizace a farbenie hematoxylínom a eosínu (H &E), sa vybralo 5,000 jadra od 5 do 10 sériových rezov za použitia 27G ihlou. Zhromaždené jadra boli ošetrené s 40 ml 200 mg /ml proteinázy K (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) pri teplote 42 ° C, po dobu 72 hodín. Technológia paramagnetické korálik (AxyPrep Mag Blood gDNA kit, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) bol použitý na izoláciu genomickej DNA z čerstvej krvi podľa protokolu pre handsfree. Protokol sa skladá z nasledujúcich kroku: lyže, viazanie, umývanie a vymývanie. Nečistoty sú odstránené počas záväzných a premývanie. Kvalita DNA bola hodnotená A260 pomer na NanoDrop ND-1000/280 spektrofotometra (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), integrita DNA bola overená pomocou denaturačné elektroforézy na agarózovom géle.

DNA boli modifikované roztoku sodia s použitím súpravy EpiTect hydrogénsiričitanu (Qiagen Inc.) podľa inštrukcií manufactor je. Modifikované DNA boli analyzované v reálnom čase MSP na ABI7500 PCR (ABI Co.) s použitím SYBR Premix Taq ExTaq Kit (Takara Co. Ltd). XAF1
špecifické primery metylácie a unmethylation boli navrhnuté nasledujúce: XAF1
(MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'-CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1
(UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC Cacao-3' [23]. Ľudské genómovej DNA (VO) liečená SSSI metyltransferázy in vitro bol použitý ako pozitívna kontrola. Periférne krv DNA od zdravého subjektu bola použitá ako negatívna kontrola. Percento metylovaných DNA vo vzorkách boli vypočítané podľa odkazoch ako predchádzajúce opísané [27], [28]. Methylata DNA index bol hodnotený v závislosti na percente metylácie DNA; 0, < 20%; 1, 20% až 40%; 2, 40% až 60%; 3, 60% -80%; a 4, > 80%. Index skóre 0 je považovaná za DNA unmethylation a skóre 1-4 boli považované za hypermethylated, v danom poradí [7], [27]. 20% odrezať prah pre DNA hypermetylace bol založený na kontrolných vzorkách normálne a interných kontrol kvality získaných pri analýze MSP v reálnom čase.

bunkových kultúrach a drogy Liečba

ľudských bunkových línií karcinómu žalúdka (AGS a KATO-III) boli pestované v RPMI1640 médiu doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom, 100 u /ml penicilínu a 100 u /ml streptomycínu pri 37 ° C a 5% CO _{2, v danom poradí. Kultivované bunky boli ošetrené s 5-aza-2'-deoxycytidínu (5-Aza-CdR) (Sigma-Aldrich) v konečnej koncentrácii 1,0 umol /l. Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich) v konečnej koncentrácii 20 ng /ml, bol podávaný po liečbe 5-Aza alebo samotným počas 24 hodín. Bunky boli zhromaždené a podrobené DNA, RNA a čistenie proteínov a ďalších analýz.}

Štatistická analýza

SPSS 17.0 štatistický softvér bol prijatý pre analýzu dát. Počítanie porovnanie dát medzi skupín sa podrobí χ
^{2 test a Fisherov presný test. Analýza prežitia bola computered pomocou metódy Kaplan-Meier a významné úrovni boli hodnotené pomocou log-rank testu. Jednorozmerné analýze s Cox regresie modelu bola použitá pre stanovenie zistených prognostických faktorov, a multivariačný analýzy s Cox regresie modelu bola použitá pre preskúmanie kombinovaný účinok. Pri všetkých štatistických analýz, p
hodnoty. ≪ 0,05 boli považované za štatisticky významná}

Výsledky

Down-regulácia XAF1
v primárnej žalúdočnej nádory

Ak chcete skúmať XAF1
profil génovej expresie sme skúmali mRNA expresie XAF1
v 88 nerakovinotvorných dobrovoľníkov a 202 primárna rakovina žalúdka tkanív a ich zodpovedajúcich PCHNTs. Ako je znázornené na obrázku 1A, XAF1
expresie bola významne znížená u karcinómov žalúdka v porovnaní s tým, v normálnych kontrol a PCHNTs ( p <
0,001). Avšak, neexistuje žiadny významný rozdiel v XAF1
expresie v PCHNTs v porovnaní s kontrolami bez nádorového ochorenia.

Ďalej XAF1
expresie bola v pokročilých nádorov významne nižšie (fáza III /IV) ako v raných fázach nádoru (štádium i /II) ( p <
0,0001, obr S1A), a bol v zle diferencovaných nádorov, než je tomu v rovnako /mierne diferencované nádory významne nižšie ( p. <
0,0001, obr S1B)

Ak chcete skontrolovať hladinu XAF1 bielkovín v žalúdku rakovinových tkanív, sme vykonali imunohistochemické analýzu 202 rakovinou žalúdka tkanív a ich zodpovedajúcich PCHNTs. Výraz nukleárnej XAF1 bol trvalo prítomný v normálnej žalúdočnej epitel vykazujú vysoký imunoreaktívnych skóre. Expresia XAF1 proteín bol detekovaný vo vysokej úrovni v 97,5% (197/202) z PCHNTs (obrázok 1B). Avšak, vysoké expresie XAF1 proteínu bola detekovaná iba v 16,8% (34/202) žalúdočných rakovinových tkanív; Väčšina žalúdočných rakovinové tkanive boli chýba alebo je na nízkej úrovni XAF1 proteínu (obrázok 1C). K imunohistochemické nálezy sú zhrnuté v tabuľke 1. Imunohistochemické farbenie skóre v žalúdočnej rakovinové tkanive bola významne nižšia ako v PCHNTs alebo v bežných kontrolách ( p <
0,0001, obrázok 1D). Strata XAF1 proteínu významne koreluje s H. pylori
infekcie, veľkosť nádoru, histologické diferenciácie, lymfatická invázie, žilovej invázie, invazívne hĺbka, lymfatických uzlín, vzdialených metastáz a klinické štádium (tabuľka 1) (všetky p <
0,05)
.

imunohistochemické výsledky 20 žalúdočné rakovinové tkanive boli ďalej potvrdené pomocou western blot analýzy. Reprezentatívny Western blotting výsledky v oboch prípadoch bolo znázornené na obrázku 1E. Relatívne množstvo expresie XAF1 proteínu je normalizované na p-tubulínu rovnakých vzoriek. Priemerná výška XAF1 proteín v 20 žalúdočných rakovinových tkanív bola významne nižšia ako v PCHNTs ( p Hotel < 0,05). (Obr 1F)

Promoter hypermetylace zo XAF1
v primárnej nádorov žalúdku

Ak chcete skúmať molekulárne mechanizmy pre XAF1
ticho v karcinómov žalúdka, sme použili technológiu MSP v reálnom čase študovať stav DNA metylácie XAF1
promótor. Frekvencia XAF1
hypermetylace v žalúdočných rakovinových tkanivách, čo zodpovedá PCHNTs a kontrol bez nádorového ochorenia bola 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) a 5,7% (5/88), v uvedenom poradí. Hypermetylace frekvencia XAF1
u rakovín je výrazne vyššia ako v PCHNTs a kontrol nerakovinotvorných (všetci p Hotel <0,0001, obrázok 2).

Stojí za zmienku koloidný stav XAF1
významne koreluje s niektorými klinicko-patologických parametrov u rakoviny žalúdka, ako lymfatických uzlín, T-štádiu, H
. pylori
infekcie, etc (všetko p <
0,05, tabuľka 2). Žiadna významná korelácia medzi hypermetylace zo XAF1 stroje a pohlavie, vek v čase stanovenia diagnózy, tumor webu a vzdialené metastázy bolo preukázané (všetci p Hotel > 0,05). (Tabuľka 2)

XAF1
Promoter hypermetylace je spojená s jeho transkripcie Umlčanie v žalúdočnej rakovinových bunkách

Ak chcete skúmať vzťahy medzi XAF1
metylácie a XAF1
prejavu, porovnali sme XAF1
úroveň metylácie s XAF1
úrovne hladiny mRNA a proteínové určuje buď podľa imunohistochemické analýzou (obrázok 3A) alebo westernovým prenosom (obrázok 3b) podľa porovnávacej analýzy Spearman. Ako je znázornené na obr-3A, expresiu proteínu XAF1 (stanovené imunohistochemické analýzou) vo 202 GC tkanivách úzko koreluje s XAF1
hladina mRNA [lg (T /N)] (stanovené pomocou RT-PCR) ( γ
= 0,841, p <
0,0001). Ešte dôležitejšie je, XAF1
úroveň metylácie bola významne spojená s XAF1
hladiny mRNA ( y
= - 0,846, p <
0,0001) a XAF1 bielkoviny úroveň ( γ
= -0,969, p <
0,0001). Podobné výsledky boli získané pri analýze korelácie XAF1
metylácie promótorom a expresie proteínov XAF1 stanoviť analýzou Western blot (obrázok 3B). Tieto výsledky silne obžalovaných, že XAF1
expresie je regulovaná XAF1
metylácie promótorom.

5-Aza-CdR Administration Obnoví Vyjadrenia XAF1

Pre ďalšie potvrdenie epigenetické reguláciu XAF1
výraz bunky AGS a KATO-III boli liečení 5-Aza-CdR a /alebo TSA. XAF1
mRNA expresie bol aktivovaný v oboch bunkových línií karcinómu žalúdka, sprevádzané demetyláciou XAF1
promótor (obrázok 4), čo ukazuje, že XAF1
je transkripčný umlčané v týchto bunkách DNA hypermetylace. Je zaujímavé, že liečba TSA sám bol účinný pri obnove XAF1
výraz v AGS a KATO-III bez významnej zmeny XAF1
úroveň metylácie, čo naznačuje, že modifikácie histónov môžu podieľať aj na reguláciu XAF1
výraz. Avšak podávanie TSA po 5-Aza-CdR malo aditívny účinok na obnovenie génovej expresie s ďalšie zníženie hladiny metylačnej XAF1
. Tieto výsledky sú v súlade s nedávnej štúdie, ktoré naznačujú, že TSA môže mať vplyv na demetylácie spôsobom génovo špecifické [5]. Western blot analýzy s použitím AGS buniek, ako model, potvrdila up-regulácia XAF1 proteínov v nadväznosti na 5-aza-CdR a 5-Aza-CdR ošetrenie /TSA (Obrázok 4).

Detekcia cirkulujúcich XAF1
metylácie

Zistili sme vysokú frekvenciu XAF1
metylácie v primárnej rakoviny žalúdka (83,2%), čo naznačuje, že to môže byť dobrá biomarker chcete XAF1
metylácie môže byť detegovateľný v sére. Z tohto dôvodu sme sa zaoberali XAF1
metylácie v spárovaných v sére DNA od pacientov GC 202. XAF1
metylácie bola zistená u 141 (69,8%) v sére DNA od pacientov s rakovinou žalúdka 202 (obrázok 5). Na rozdiel od toho XAF1
metylácie nebol v sére DNA z kontrol nerakovinotvorných 88 detekovaný.

Next, sme potvrdili konzistenciu vo XAF1
metylácie medzi nádorového tkaniva a zodpovedajúce sérum. V 168 prípadoch, ktoré ukazovali XAF1
metylácie v nádorových tkanivách, 141 zobrazí XAF1
metylácie v ich párového séra, čo predstavuje 83,9% konzistenciu medzi nimi. A v 34 pacientov s karcinómom žalúdka bez XAF1
metylácie v ich žalúdočných rakovinových tkanív, nie metylácie bola nájdená vo všetkých sére DNA (obr S2).

XAF1
metylácie ako biomarkeru v diagnostike karcinómu žalúdka

Ak chcete zhodnotiť hodnotu XAF1
metylácie ako biomarkeru v diagnostike GC sme vynesené prijímač prevádzkové charakteristiky (ROC) krivky a vypočítava sa plochy pod krivkou (AUC), hodnoty pomocou metylácie DNA dát z oboch GC tkanív a séra. Ako ROC analýzy XAF1
metylácie v tkanivách a sére vyplynulo, že diskriminačné schopnosť (obrázok 6); AUC hodnota tkanív XAF1
metylácie bola 0,849 (95% interval spoľahlivosti, 0,806 až 0,892; p Hotel &0,0001) boli hodnoty AUC séra AXF1
metylácie bol 0,909 (95% interval spoľahlivosti, 0,875 - 0,942; p Hotel &0,0001).

Navyše, ako XAF1
stav metylácie v žalúdočných rakovinových tkanív a séra významne koreluje s lymfatických uzlín, T-fáze klinického štádia a ďalšie klinicko-patologické parametre (všetko p <
0,05, tabuľka 2)

XAF1
metylácie. koreluje s prognóza žalúdočnej pacientok s karcinómom

významné korelácie XAF1
metylácie s mnohými klinicko-patologické parametre (tabuľka 2) navrhol, že to môže spájať s prognózou pacientov s rakovinou žalúdka. Až do dňa splatnosti Follow-up, 113 168 pacientov s XAF1
hypermetylace v žalúdočných rakovinových tkanív šiel progresii ochorenia rýchly alebo zomreli. Median bez prejavu choroby prežitia (DFS) bola len 23,4 mesiaca. Naproti tomu u 34 pacientov bez XAF1
hypermetylace v ich žalúdočných rakovinových tkanív, iba 5 boli pacienti zhoršuje, a stredné DFS bol 39,6 mesiaca. Kaplan-Meierova analýza preukázala, že pacienti s XAF1
hypermetylace v ich žalúdočných rakovinových tkanív vykazovali zrejmú horšie prežitie, než, že bez XAF1
hypermetylace ( p <
0,0001) (viď obr 7A). Podobne, Kaplan-Meierova analýza ukázala, že pacienti s pozitívnym sérom XAF1
metylácie malo výrazne nižšia ako DFS, že bez séra u pacientov XAF1
metylácie ( p Hotel < 0,0001 ) (obrázok 7B), čo naznačuje, že XAF1
promotér metylácie v sére bola nepriaznivá prediktor pre pacientov s rakovinou žalúdka.

Cox regresná analýza ukázala, že XAF1
metylácie v sére je nezávislý faktor na prežívanie pacientov: pacienti s XAF1
metylácie mali horšiu prognózu ( p <
0,0001; pomer rizika 5,710; 95% CI, 3.474 ~ 9.383). Okrem toho TNM štádia a vek v čase stanovenia diagnózy by mohli byť považované za ovplyvňujúci faktor prognózou u rakoviny žalúdka, len ak účinok XAF1
metylácie bola eliminovaná. Okrem toho cirkuláciou methyluje XAF1
v krvi mal väčší dopad na prognózu ako v niekoľkých fázach TNM (tabuľka S1).

Pozitívna Prechod cirkulujúcich XAF1
metylácie Predpovedá Tumor opakovanie a zlou prognózou

Medzi 202 pacientov, ktorí boli hodnotení na predoperačné cirkulujúci XAF1
metylácie, 72 pacienti dostávali nadväzné vyšetrenie cirkulujúcich XAF1
metylácie 2 ~ 5 krát v intervaloch 1 ~ 6 mesiacov po operácii. Medzi 12 recidivujúcich pacientov, 10 pacientov zobrazená negatívne k pozitívnemu prechodu XAF1
stav metylácie v ich sére, ďalšie dva ukázal vždy pozitívne na XAF1
metylácie, čo naznačuje, že monitorovanie XAF1
metylácie v sére môže byť dobrým markerom pre predpovedanie recidíve nádoru (tabuľka 3).

Diskusia

XAF1
( XIAP
-associated faktor 1) je román XIAP
viažuci proteín, ktorý by mohol rušiť kombinovanie XIAP
s kaspázy, rušia jeho ochranu na nádorové bunky a vedie k nádorovej bunky apoptóze [12] - [ ,,,0],14]. Anti-Apoptosis funkcie XIAP
je daná pomerom expresných hladín XIAP
proti XAF1
[15]. Znížená expresia alebo Tichý XAF1
je častou udalosťou v ľudských nádoroch [16] - [19]. V tejto štúdii sme prvýkrát potvrdil, že XAF1
expresie génu bola významne down-regulovaný ako v úrovni mRNA, tak na úrovni proteínov vo veľkom paneli primárnych karcinómu žalúdka tkanív, a down-reguláciu XAF1
expresia bola významne spojená s nádorovými fázou, metastázy a tak ďalej, zapletať stratu XAF1
funkcie v progresii nádoru. To je v súlade s ďalšími výskumnými správ [17] - [19]. Ak chcete preskúmať molekulárne mechanizmy zodpovedné za XAF1
ticha sme sa zaoberali XAF1
promotér metylácie vo veľkom paneli rakovinou žalúdka tkanív ( n
= 202) a normálne kontroly ( n
= 88) pomocou MSP technológie v reálnom čase. Zistili sme vysokú frekvenciu (83,2%) DNA hypermetylace zo XAF1
rakovinou žalúdka tkanivách. DNA hypermetylace z XAF1
významnú koreláciu s down-reguláciu XAF1
ako mRNA a proteínové úrovni v žalúdočnej rakovinové tkanive (obrázok 3). Navyše liečba 5-Aza-CdR výrazne obnovený XAF1
výraz v XAF1
umlčaný rakovinou žalúdka bunkových línií (Obrázok 4). Tieto údaje silne naznačujú, že časté down-regulácia XAF1
do buniek karcinómu žalúdka je regulovaná jeho promótorom hypermetylace. Je zaujímavé, že liečba karcinómu žalúdka buniek TSA, inhibítor histondeacetylázy tiež obnoviť XAF1
expresie, samostatne alebo v kombinácii s liečbou 5-Aza-CdR, čo ukazuje, že modifikácie Histon môže byť tiež zapojený do XAF1 <. br> regulácia

metylácie DNA môžu byť použité ako potenciálny nádorové biomarkeru v rôznych ľudských rakovín [3] - [11], [23]. Prítomnosť bezbuněčného DNA cirkulujúcej v periférnej krvi bola popísaná u pacientov s malígnymi procesmi a uvoľňovanie účinnej nádorové DNA do obehu, bola označená [29] - [31]. Početné štúdie preukázali zmeny nádorovo špecifické v cirkulujúcej DNA získaných z plazmy alebo séra z pacientov s rôznymi malignitami, ktoré zodpovedajú genetické zmeny, ktoré sú v primárnych nádorov, zistenie, že má potenciál pre molekulárnu diagnózu a prognózu [29] - [32]. Značky nukleových kyselín sú opísané v cirkulujúcej DNA zahŕňajú mutácie, Oncogene mikrosatelitních zmeny, génovej preskupenie a epigenetické zmeny, ako sú aberantne promótorom hypermetylace [7], [8], [30] - [34]. Na základe týchto pozorovaní, zvlášť sme zistili vysokú frekvenciu XAF1
metylácie DNA v žalúdočných rakovinových tkanív (83,2%), sme sa rozhodli preskúmať možnosť použiť XAF1
promótor metylácie v sérum ako biomarkeru u pacientov s rakovinou žalúdka. Najprv sme preukázali veľkú konzistenciu pri odhaľovaní XAF1
metylácie medzi sér a primárnou rakovina žalúdka tkanív. Ďalšia sme analyzovali možnosť použitia s cirkuláciou methyluje XAF1
ako diagnostický marker pomocou ROC analýzy. Hodnota AUC (plocha pod krivkou) z 0,909 preukázala vysokú diagnostickú hodnotu detekčného XAF1
metylácie vo vzorkách séra. Preto sú naše údaje naznačujú, že detekcia XAF1
metylácie v cirkulujúcich DNA by mohla byť použitá ako neinvazívne biomarker pre diagnostiku rakoviny žalúdka. Navyše, naše výsledky tiež ukázali, že pozitívny XAF1
metylácie v sére bol nezávislý prognostický faktor; predpovedať zlú prognózu. Ďalšie zaujímavé je, že prechod z negatívneho na pozitívny cirkulujúcich XAF1
metylácie po operácii bolo významne spojené s recidívy. Tieto údaje ukazujú, že detekcia XAF1
metylácie v cirkulujúcich v sére DNA tiež môže byť nádor biomarker pre predpovedanie Prognóza pacientov s karcinómom žalúdka "a k sledovaniu opakovanie nádoru po liečbe chirurgii. Keďže počet pacientov podstúpilo to follow-up sérum vyšetrenie bola malá, je potreba ďalší výskum vo veľkom vzorke o veľkosti počte pacientov na potvrdenie tejto zaujímavé zistenie a optimalizovať stratégiu a protokol pre tento účel. V každom prípade, v porovnaní s tradičnými spôsobmi, ako je gastroskopia vyšetrenie pacientov s karcinómom žalúdka, najpozoruhodnejšie charakteristika cirkulujúcich methyluje XAF1
detekcie je efektívny, rýchly, nízka cena, neinvazívne, nie je ničia životné prostredie, vysoká Diagnostická prispôsobivé rýchlosť a tak ďalej, a ako taký nepreukážu významnú uplatnenie vyhliadky do budúcnosti.

Závery

dysfunkcie XAF1
je častá a je regulovaný pomocou XAF1
promotér hypermetylace u karcinómu žalúdka. Cirkuláciou methyluje XAF1
DNA bola spojená s nádorovú záťažou a malígne progresiu, ktorá môže byť cenným biomarker pre diagnostiku rakoviny žalúdka, predpovedať prognózu pacientov a sledovanie k recidíve nádoru po liečbe chirurgii.

Podpora informácie o
Obrázok S1.
jpg. A, XAF1
génovej expresie úroveň bola nižšia u pokročilého karcinómu žalúdka (stupeň III /IV) než na začiatku rakovinou žalúdka (fáza I /II). B, XAF1
génová expresia bola hladina v zle diferencovaného karcinómu žalúdka nižšie ako v dobre /mierne (i /Mod) diferencovaný karcinóm žalúdka, p <
0,05
doi :. 10,1371 /journal.pone.0067195.s001
(TIF)
Obrázok S2.
jpg. Korelačný analýza XAF1
výsledkov hypermetylace medzi GC tkanív a spárované periférnej krvi (séra)
doi: 10,1371. /Journal.pone.0067195.s002
(TIF)
Tabuľka S1.
xls. Viacrozmerná analýza prežitia klinicko-patologických údajov 202 prípadov karcinómu žalúdka.

• Ploche ONE: Nová subklasifikace PT4 karcinómov žalúdka podľa šírky o Serózna Invasion
• Ploche ONE: Janus kinázy 2 polymorfizmy sú spojené s rizikom u pacientov s karcinómom žalúdka v čínskej populácie