PLoS ONE: Cirkulerende Methyleret XAF1 DNA Indikerer dårlig prognose for mavekræft

Abstrakt

Baggrund

Methyleret DNA i væsker kan være en egnet biomarkør for kræftpatienter. XAF1
har vist sig at være hyppigt nedreguleret i human gastrisk cancer (GC). Her har vi undersøgt, om XAF1
methylering i GC kunne være en nyttig biomarkør.

Metoder

Real-time RT-PCR blev anvendt til at påvise XAF1
mRNA udtryk; immunhistokemi og western blot blev anvendt til at undersøge XAF1 proteinekspression i GC væv (n = 202) og deres tilsvarende para-kræft histologiske normale væv (PCHNTs). Real-time methylering specifik-PCR blev anvendt til at undersøge XAF1
promotor methylering i samme panel af GC væv, deres PCHNTs og sera.

Resultater

Vi bekræftede hyppige XAF1
nedregulering i både mRNA og protein niveauer i GC væv sammenlignet med normale kontroller og PCHNTs. XAF1
hypermethylering blev dokumenteret i 83,2% (168/202) af GC væv og 27,2% (55/202) af PCHNTs, mens ingen methylering blev påvist i de 88 normale kontroller. Den methylering niveau i GC væv var signifikant højere end i PCHNTs ( s <
0,05). Den hypermethylering af XAF1
signifikant korreleret med nedregulering af XAF1
i GC væv i både mRNA og protein niveauer ( s
< 0,001 hver). Desuden har vi påvist høj frekvens af XAF1
methylering (69,8%, 141 ud af 202) i sera DNA'er fra de samme patienter, mens seraene DNA'er fra 88 ikke-tumor kontroller var negative for XAF1
methylering. XAF1
methylering i både GC væv og i sera kunne være en god biomarkør til diagnosticering af GC (AUC = 0,85 for væv og AUC = 0,91 for sera) og signifikant korreleret med dårligere prognose ( s
< 0,001). Hertil kommer, efter-kirurgi negativ-til-positive overgang XAF1
methylering i sera stærkt forbundet med tumor tilbagefald.

Konklusioner

1) Dysfunktion af XAF1
er hyppig og reguleres gennem XAF1
promotor hypermethylering; 2) Påvisning af cirkulerende methyleres XAF1
DNA i serum kan være en nyttig biomarkør i diagnose, vurdere patientens udfald (prognose og recidiv) for GC patienter

Henvisning:. Ling ZQ, Lv P Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) cirkulerende Methyleret XAF1
DNA Indikerer dårlig prognose for mavekræft. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10,1371 /journal.pone.0067195

Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: Marts 12, 2013; Accepteret: 16 maj 2013; Udgivet: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Ling et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Science and Technology General Project i Zhejiang-provinsen (nr. 2009C33143), og dels af en bevilling fra Backbone Talent Zhejiang Provincial Medicin og Hygiejne Platform programmer (nr. 2011RCA009). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige cancertyper i Kina, med en høj forekomst og dødelighed, ca. tegner sig for 10% af alle malignanser [1]. Gastrisk tumorigenese er en kompliceret, flertrinsproces, der involverer ændringer af mange gener [2]. Aberrant promotor methylering er en af ​​de vigtigste mekanismer til at lukke munden nogle tumorsuppressorgener og tumor gener og spiller meget vigtige roller i patogenesen og progression i humane cancere [3], [4] - [6], herunder mavecancer [7] , [8]. I mellemtiden, akkumulere data kraftigt antydet, at DNA-methylering kunne være nyttigt og kraftfuld biomarkør i evaluering kræftrisiko [5], [7], tidlig diagnosticering [7], at forudsige patienternes prognose [7], [8], og evaluering af følsomhed over for kemoterapeutiske lægemidler [9]. Vores seneste undersøgelse og andre undersøgelser viste, at påvisning af cirkulerende methyleret DNA i blodet er en potent og praktisk tilgang til kræftpatienter [7], [10], [11].

X-bundet inhibitor af apoptose ( XIAP
) associeret faktor 1 ( XAF1
) er en ny negativ regulator af XIAP
, der vender XIAP rolle beskyttelse på tumorceller [12] - [14]. Tabet af XAF1
ekspression vil gøre tumorceller resistens over for apoptose og fremme tumorcelleoverlevelse [14] - [17]. Dysfunktion af XAF1
er blevet rapporteret i flere humane kræftformer sandsynligvis gennem promotor methylering [15] - [19], hvilket tyder på dens betydning i tumorigenese. I human mavekræft, XAF1
er blevet rapporteret til at være ofte og markant ned-reguleret, og denne nedregulering af XAF1
sandsynligvis gennem DNA hypermethylering af specifikke CpG sites [15], [16 ], [18]. Men ingen Rapporten er tilgængelig om XAF1
methylering i blodet og dets potentialitet som biomarkør. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi XAF1
promotor-methylering i parrede væv og serumprøver fra et stort panel af patienter med mavekræft, og evalueres cirkulerende methyleres XAF1
som en potentiel biomarkør for mavekræft .

Materiale og metoder

Etik Statement

De-identificerede humane prøver og sera væv blev opnået fra Zhejiang-provinsen Menneskelig vævsprøve Bank. Brugen af ​​eksemplarer blev godkendt af Institutional Review Board på Zhejiang-provinsen Cancer Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient i overensstemmelse med kravene i vores institutions bestyrelse etik. 88 ikke-kræft frivillige forudsat skriftligt informeret samtykke. En del af prøverne var fra Zhejiang-provinsen Folkeparti Hospital og de første Folkets Hospital of Chunan County. Den Institutional Review Board om medicinsk etik i Zhejiang-provinsen Folkets Hospital og de første Folkets Hospital of Chunan County godkendt metoden til prøveudtagning, herunder skriftligt informeret samtykke fra alle patienter.

vævsprøve

Forbundne tumor og para-kræft histologiske normale væv (PCHNT) prøver blev indsamlet på tidspunktet for kirurgi fra 202 patienter med primær gastrisk adenocarcinom på Zhejiang-provinsen Cancer Hospital, Zhejiang-provinsen Folkeparti Hospital og de første Folkets Hospital of Chunan County fra januar 2008 og til december 2009. PCHNT blev vurderet mikroskopisk for tilstedeværelsen af ​​normale celler og fravær af dysplastiske celler. Ingen af ​​disse sager havde gennemgået nogen medicinsk behandling før operation. Demografiske, kliniske og histopatologiske parametre for disse sager blev vist i tabel 1. vækstmønster af tumorceller blev bestemt i henhold til Ming klassificering [20]. Alle rekrutterede patienter var blevet fulgt op med jævne mellemrum, indtil forfaldsdatoen. Antral slimhinde biopsi prøver fra 88 ikke-kræft frivillige ved gastroskopi blev tilfældigt indsamlet som kontrol inden for den samme periode, herunder 54 mænd og 34 kvinder, med en gennemsnitsalder på 52,9 år. Blandt disse frivillige, blev 48 patienter diagnosticeret med kronisk ikke-atrofisk gastritis. I mellemtiden blev parrede serumprøver indsamlet før operation eller endoskopi.

Analyse af Helicobacter Pylori ( H. Pylori
) Infektion

Biopsier blev opnået fra alle patienter, som havde endoskopisk undersøgelse . H
. pylori
status blev bestemt ved hurtig Urease test og Giemsa farvning metoder [21], [22]. Det blev betragtet som H
. pylori
infektion, når begge tests var positive, og prøverne med enkelt positivt blev udelukket til statistisk analyse [22].

Real-time RT-PCR

mRNA-ekspression af XAF1
blev analyseret ved real-time RT-PCR [23]. Totale RNA'er blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Gibco). I alt 3 ug totale RNA'er blev underkastet revers transkription ved hjælp af M-MLV revers transkriptase (Promega). Glyceraldehyd phosphat dehydrogenase ( GAPDH
) blev valgt som den interne reference. Sekvenserne af XAF1
primere var som følger: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R) 5'GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3'. GAPDH
primersekvenser var som følger: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. De 2 ^{-ΔΔCt metode blev anvendt til at beregne relative ændringer i genekspression.}

immunhistokemisk farvning

Ekspressionen af ​​XAF1 protein blev bestemt ved immunohistokemisk analyse med XAF1 monoklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology ). Immunohistokemisk farvning for XAF1 blev udført ved anvendelse af repræsentative paraffinindlejrede prøver fra de 202 GC patienter. Efter afparaffinering, antigen-genvinding i 0,01 M citratpuffer, og inaktivering af endogen peroxidaseaktivitet i 3% H _{2O 2 /methanol, inkuberede vi objektglassene med antistof i XAF1 ved 4 ° C natten over, og immunhistokemisk farvning, efter en standard avidinbiotin-peroxidase-kompleks teknik, blev udført under anvendelse 3,3'-diaminobenzidin (DAB) som kromogen. Kerner blev modfarvet med hematoxylin. Den immunhistokemisk farvning score (ISS) er bestemt af tre uafhængige patologer kombinerer farvning hyppigheden og intensiteten som følger [24], [25]: ingen farvning er scoret som 0, 1~10% af cellerne farvet scoret som en, 11~50% som 2, 51~80% som 3, og 81~100% som 4. farvningsintensitet er vurderet på en skala fra 0 til 3, hvor 0, negativ; 1, svag; 2, moderat; og 3, stærk. Når der er multifokal immunoreaktivitet og der er betydelige forskelle i farvning intensiteter mellem foci blev gennemsnittet af de mindst intense og mest intense farvning registreret. De rå data blev omdannet til ISS ved at multiplicere frekvensen score og farvningsintensitet score. Teoretisk set kunne ISS går fra 0 til 12. En ISS af 9~12 blev anset stærk immunreaktivitet, 5~8 blev anset moderat, 1~4 blev anset svag, og 0 blev scoret som negativ. Sektioner, hvor farvningen ikke kunne godt karakteriseret blev anset tvetydig.}

Western blot analyse

Parret tumor og PCHNT eksemplarer af 20 sager blev tilfældigt udvalgt fra 202 mavecancerpatienter til western blot analyse. Totalt protein blev ekstraheret og derefter kvantificeret ved anvendelse af Lowry-metoden [26]. Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af anti-XAF1 monoklonale antistoffer (Santa Cruz, CA) i overensstemmelse foregående rapport [6]. β-tubulin blev serveret som en intern kontrol.

DNA Extraction, Bisulfite Ændring og Real-time Methylering Specific-PCR (MSP)

Serial 5 mm sektioner, der indeholdt karcinom og ikke-neoplastiske væv blev monteret på ikke-coatede objektglas og tørret ved 37 ° C natten over. Efter afparaffinering og farvning med hæmatoxylin og eosin (H &E), vi indsamlet 5.000 kerner fra 5 til 10 serielle snit under anvendelse af en 27G nål. De opsamlede kerner blev behandlet med 40 ml 200 mg /ml proteinase K (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) ved 42 ° C, i 72 timer. Den paramagnetiske kugle teknologi (AxyPrep Mag Blood gDNA kit, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) blev anvendt til at isolere genomisk DNA fra frisk blod ifølge kit protokol. Protokollen består af følgende trin: lysis, binding, vask og eluering. Forurenende stoffer fjernes under de bindende og vasketrin. Kvaliteten af ​​DNA'et blev vurderet af A260 /280-forhold på NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), DNA integritet blev kontrolleret ved denaturerende agarosegelelektroforese.

DNA'er blev modificeret ved natriumbisulfit hjælp af EpiTect Bisulfite (Qiagen Inc.) efter Fabrik instruktioner. Modificerede DNA'er blev analyseret ved realtid MSP på ABI7500 PCR (ABI Co.) under anvendelse af SYBR Premix Taq ExTaq (Takara Co. Ltd). XAF1
methylering og unmethylation specifikke primere blev udformet som følger: XAF1 Hotel (MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1
(UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. Humant genomisk DNA (NEB) behandles ved SSSI methyltransferase in vitro blev anvendt som en positiv kontrol. En perifert blod DNA fra en rask person blev anvendt som en negativ kontrol. Procentdelen af ​​denatureret DNA i prøverne blev beregnet i henhold til de referencer som tidligere beskrevet [27], [28]. Methyleret DNA-indekset blev scoret efter den procentdel af DNA methylering; 0, < 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; og 4, > 80%. Indekset score på 0 betragtes som DNA unmethylation og scores 1-4 blev anset hypermethyleret henholdsvis [7], [27]. De 20% afskåret tærskel for DNA hypermethylering var baseret på kontrol normale prøver og intern kvalitetskontrol opnået i realtid MSP analyse.

Cell Kultur og narkotika behandling

Humane gastriske kræft cellelinjer (AGS og KATO-III) blev dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO _{2. Dyrkede celler blev behandlet med 5-aza-2'-deoxycytidin (5-aza-CdR) (Sigma-Aldrich) i en endelig koncentration på 1,0 pmol /l. Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich) i en endelig koncentration på 20 ng /ml blev administreret efter 5-aza behandling eller alene i 24 timer. Celler blev indsamlet og udsat for DNA, RNA og protein oprensning og efterfølgende analyser.}

Statistisk analyse

SPSS 17.0 statistisk software blev vedtaget til dataanalyse. Counting data sammenligninger mellem grupper blev udsat for χ
^{2 test og Fishers eksakte test. Overlevelse analyse blev computered ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og væsentlige niveauer blev vurderet ved hjælp af log-rank test. En univariate analyse med Cox regression model blev anvendt til at bestemme identificerede prognostiske faktorer, og multivariat analyse med Cox regression model blev anvendt til at udforske kombinerede virkninger. For alle statistiske analyser, s
værdier. ≪ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans}

Resultater

Nedregulering af XAF1
i Primary Gastric Tumorer

for at undersøge XAF1
genekspression profil, vi undersøgte mRNA udtryk for XAF1
i 88 ikke-kræft frivillige og 202 primære mavekræft væv og deres tilsvarende PCHNTs. Som vist i figur 1A, XAF1
udtryk blev signifikant reduceret i gastrisk kræft prøver i forhold til, at der i normale kontroller og PCHNTs ( s <
0,001). Men der var ingen signifikant forskel i XAF1
udtryk i PCHNTs sammenlignet med kontroller ikke-kræft.

Desuden XAF1
udtryk var signifikant lavere i fremskredne tumorer (fase III /IV) end i fase tumorer tidligt (fase i /II) ( s <
0,0001, Figur S1A), og var signifikant lavere i dårligt differentierede tumorer end i godt /moderat differentierede tumorer ( s. <
0,0001, Figur S1B)

for at kontrollere XAF1 proteinniveauet i gastrisk kræft væv, vi udførte immunhistokemisk analyse i de 202 mavekræft væv og deres tilsvarende PCHNTs. Nuklear XAF1 udtryk var konstant til stede i den normale gastriske epitel viser høje immunoreaktive scores. Den XAF1 proteinekspression blev påvist i højt niveau i 97,5% (197/202) af PCHNTs (figur 1B). Imidlertid blev høj ekspression af XAF1 protein kun fundet i 16,8% (34/202) af gastrisk cancer væv; flertal af gastrisk cancer væv var fraværende eller ved et lavt niveau af XAF1 protein (figur 1C). De immunhistokemiske resultater opsummeres i tabel 1. Den immunhistokemisk farvning score i mavekræft væv var signifikant lavere end i PCHNTs eller normale kontroller ( s <
0,0001, Figur 1D). Tabet af XAF1 protein signifikant korreleret med H. pylori
infektion, tumorstørrelse, histologisk differentiering, lymfe invasion, venøs invasion, invasiv dybde, lymfeknudemetastase, fjernmetastaser og klinisk fase (tabel 1) (alle s <
0,05)
.

De immunhistokemiske resultater af 20 mavekræft væv blev yderligere bekræftet ved hjælp af western blot analyse. De repræsentative Western blotting resultater i to tilfælde blev vist i figur 1E. Den relative mængde XAF1 proteinekspression blev normaliseret til β-tubulin af de samme prøver. Det gennemsnitlige XAF1 proteinniveau i 20 mavekræft væv var signifikant lavere end i PCHNTs ( s
< 0,05). (Figur 1F)

Promoter Hypermethylering af XAF1
i Primary Gastric tumorer

for at undersøge de molekylære mekanismer for XAF1
tavshed i gastrisk kræft, vi anvendt en real-time MSP-teknologi til at studere status DNA methylering af XAF1
promotoren. Hyppigheden af ​​ XAF1
hypermethylering i gastrisk kræft væv, svarende PCHNTs og ikke-kræft kontroller var 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) og 5,7% (5/88), hhv. Den hypermethylering hyppigheden af ​​ XAF1
i kræft er betydeligt højere end i PCHNTs og ikke-kræft kontroller (alle s
< 0,0001, Figur 2).

Af note , den methylerede status XAF1
signifikant korreleret med nogle klinisk-patologiske parametre i mavekræft, såsom lymfeknude metastaser, T-scenen, H
. pylori
infektion, osv (alle s <
0,05, tabel 2). Ingen signifikant sammenhæng mellem hypermethylering af XAF1
og køn, alder ved diagnose, tumor websted og fjernmetastaser blev dokumenteret (alle s
> 0,05). (Tabel 2)

XAF1
Promotor Hypermethylering er forbundet med dets Transcriptional Silencing i Gastric Cancer Cells

for at undersøge forholdet mellem XAF1
methylering og XAF1
udtryk, vi sammenlignede XAF1
methylering niveau med XAF1
mRNA niveau og protein niveauer bestemmes enten ved immunhistokemisk analyse (figur 3A) eller western blotting (figur 3B) af Spearman korrelationsanalyse. Som vist i figur 3A-, XAF1 proteinekspression (bestemt ved immunhistokemisk analyse) i 202 GC væv var nært korreleret med XAF1
mRNA-niveau [lg (T /N)] (bestemt ved RT-PCR) ( γ
= 0,841, s <
0,0001). Mere vigtigt, XAF1
methylering niveau var signifikant associeret med XAF1
mRNA-niveau ( γ
= - 0,846, s <
0,0001) og XAF1 protein niveau ( γ
= -0,969, s <
0,0001). Lignende resultater blev opnået, når der analyseres korrelationen af ​​ XAF1
promotor methylering og XAF1 proteinekspression bestemt ved western blot-analyse (figur 3B). Disse resultater stærkt tiltalt som XAF1
udtryk reguleres af XAF1
promotor methylering.

5-Aza-CdR Administration Gendanner Angivelse af XAF1

for yderligere at bekræfte den epigenetiske regulering af XAF1
udtryk, AGS og KATO-III celler blev behandlet med 5-Aza-CdR og /eller TSA. XAF1
mRNA ekspression blev reaktiveret i begge gastrisk cancer cellelinjer, ledsaget af demethylering af XAF1
promotor (figur 4), hvilket indikerer, at XAF1
er transkriptionelt til tavshed i disse celler ved DNA hypermethylering. Interessant, TSA behandling alene var effektiv til at genskabe XAF1
udtryk i AGS og KATO-III uden væsentlig ændring af XAF1
methylering niveau, hvilket antyder, at histon modifikationer kan også være involveret i regulering XAF1
udtryk. Indgift af TSA følgende 5-Aza-CdR havde en additiv effekt i at genoprette genekspression med et yderligere fald i methylering på XAF1
. Disse resultater er i overensstemmelse med de seneste undersøgelser, der foreslog, at TSA kan have en demethylering effekt i et gen-specifik måde [5]. Western blot analyse under anvendelse af AGS celler, som en model, bekræftede opreguleringen af ​​XAF1 proteiner efter 5-aza-CdR og 5-aza-CdR /TSA behandlinger (figur 4).

Påvisning af cirkulerende XAF1
methylering

Vi har registreret høj frekvens af XAF1
methylering i primær gastrisk cancer (83,2%), hvilket tyder på, at det kan være en god biomarkør hvis XAF1
methylering kan være påviselige i serum. Derfor undersøgte vi XAF1
methylering i de matchede serum DNA fra 202 GC patienterne. XAF1
methylering blev påvist i 141 (69,8%) serum DNA fra 202 mavecancerpatienter (figur 5). I modsætning hertil XAF1
methylering blev ikke påvist i serum DNA fra de 88 kontroller ikke-kræft.

Dernæst bekræftede vi sammenhæng i XAF1
methylering mellem tumorvæv og tilsvarende serum. I 168 sager, der viste XAF1
methylering i tumorvæv, 141 vises XAF1
methylering i deres parrede serum, der giver en sammenhæng i 83,9% mellem dem. Og i 34 gastrisk kræftpatienter de uden XAF1
methylering i deres mavekræft væv, blev der ikke methylering findes i alle serum DNA (Figur S2).

XAF1
Methylering som biomarkør til diagnosticering af mavekræft

for at vurdere værdien af ​​ XAF1
methylering som biomarkør i at diagnosticere GC, vi plottet receiver opererer karakteristik (ROC) kurver og beregnet areal under kurven (AUC) værdier ved hjælp af DNA-methylering data fra både GC væv og sera. Både ROC-analyser af XAF1
methylering i væv og sera viste betydelig diskriminerende kapacitet (figur 6); AUC værdi af væv XAF1
methylering var 0,849 (95% konfidensinterval, 0,806-0,892; s
< 0,0001), AUC værdi af serum AXF1
methylering var 0,909 (95% konfidensinterval, ,875-,942; s
< 0,0001).

Desuden ligesom XAF1
status methylering i mavekræft væv og sera signifikant korreleret med lymfeknude metastaser, T-stadie, klinisk fase, og andre klinisk-patologiske parametre (alle s <
0,05, tabel 2)

XAF1
Methylering. korreleret med prognose for mavekræft patienter

den betydelige korrelation af XAF1
methylering med mange klinisk-patologiske parametre (tabel 2) foreslog, at det kan associere med prognosen af ​​gastrisk kræftpatienter. Indtil datoen for opfølgning grund, 113 af 168 patienter med XAF1
hypermethylering i mavekræft væv gik hurtig sygdomsprogression eller død. Den Median sygdomsfri overlevelse (DFS) var kun 23,4 måneder. I modsætning hertil de 34 patienter uden XAF1
hypermethylering i deres mavekræft væv, kun 5 patienter begyndte at se sort, og Median DFS var 39,6 måneder. Kaplan-Meier analyse viste, at patienter med XAF1
hypermethylering i deres gastric cancer væv udviste en oplagt dårligere overlevelse end at uden XAF1
hypermethylering ( s <
0,0001) (Figur 7A). Tilsvarende Kaplan-Meier analyse viste, at patienter med positiv serum XAF1
methylering havde væsentligt lavere DFS end i patienter uden serum XAF1
methylering ( s
< 0,0001 ) (Figur 7B), hvilket indikerer, at XAF1
promotor methylering i serum var en ugunstig prædiktor for mavecancerpatienter.

Cox regressionsanalyse viste, at XAF1
methylering i sera er en uafhængig faktor på patienternes overlevelse: patienter med XAF1
methylering havde dårligere prognose ( s <
0,0001, Hazard ratio, 5,710; 95% CI, 3.474~9.383). Desuden kunne TNM etaper og alder ved diagnosen betragtes som den indvirkende faktor af prognosen hos gastrisk kræft, når effekten af ​​ XAF1
methylering blev elimineret. Desuden cirkulerende methylerede XAF1
i blodet havde en større indvirkning på prognosen end i TNM etaper (tabel S1).

Positiv Overgang af Cirkulerende XAF1
Methylering forudsiger Tumor Gentagelse og dårlig prognose

Blandt de 202 patienter, der blev evalueret for præoperativ cirkulerer XAF1
methylering, 72 patienter modtaget opfølgende undersøgelser af cirkulerende XAF1
methylering 2~5 gange med intervaller på 1~6 måneder efter operationen. Blandt 12 tilbagevendende patienter, 10 patienter viste negativ-til-positive overgang i XAF1
methylering status i deres sera, de to andre viste altid positiv for XAF1
methylering, tyder på, at overvågningen af ​​ XAF1
methylering i serum kan være en god markør for at forudsige tumor tilbagefald (tabel 3).

diskussion

XAF1 Hotel ( XIAP
associeret faktor 1) er en roman XIAP
bindende protein, som kunne forstyrre kombination af XIAP
med caspaser, ophæver beskyttelsen på tumorceller og resultater i tumorceller apoptose [12] - [ ,,,0],14]. Den anti-apoptose funktion af XIAP
bestemmes ved forholdet mellem ekspressionsniveauer af XIAP
mod XAF1
[15]. Reduceret udtryk eller stilhed XAF1
er en hyppig begivenhed i humane tumorer [16] - [19]. I den foreliggende undersøgelse, vi først bekræftet, at XAF1
genekspression var signifikant nedreguleret i både mRNA-niveau og protein niveau i et stort panel af primære mavekræft væv, og nedregulering af XAF1
udtryk var signifikant associeret med tumor stadier, metastaser og så videre, implicerer tab af XAF1
funktion i tumor progression. Dette er i overensstemmelse med andre forskningsrapporter [17] - [19]. At udforske de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for XAF1
stilhed, vi undersøgte XAF1
promotor methylering i et stort panel mavekræft væv ( n
= 202) og normale kontroller ( n
= 88) ved hjælp af en real-time MSP-teknologi. Vi har registreret en høj frekvens (83,2%) af DNA hypermethylering af XAF1
i mavekræft væv. DNA hypermethylering af XAF1
betydelig korreleret med nedregulering af XAF1
i både mRNA og protein niveauer i gastrisk kræft væv (Figur 3). Desuden 5-Aza-CdR behandling signifikant restaureret XAF1
til udtryk i XAF1
tavshed gastrisk cancer cellelinjer (figur 4). Disse data tyder på, at hyppig nedregulering af XAF1
i gastriske kræftceller reguleres af sin promotor hypermethylering. Interessant, behandling af gastriske kræftceller med TSA, et histondeacetylaseinhibitor også restaureret XAF1
udtryk, alene eller kombineret med 5-Aza-CdR behandling, hvilket indikerer, at histon modifikation også kan være involveret i XAF1 <. br> regulering

DNA-methylering, kan anvendes som en potentiel tumor biomarkør i forskellige humane cancere [3] - [11], [23]. Tilstedeværelsen af ​​cellefrie DNA cirkulerer i perifert blod er blevet beskrevet hos patienter med maligne processer og aktiv frigivelse af tumor-DNA i kredsløbet er blevet rapporteret [29] - [31]. Talrige undersøgelser har vist, tumor-specifikke ændringer i cirkulerende DNA udvundet fra plasma eller serum af patienter med forskellige maligne sygdomme, der matcher genetiske ændringer til stede i primære tumorer, en konstatering, der har potentiale for molekylær diagnostik og prognose [29] - [32]. Nukleinsyre-markører beskrevet i cirkulerende DNA'er indbefatter onkogene mutationer, mikrosatellitændringer, gen omlejringer og epigenetiske ændringer, såsom afvigende promotor hypermethylering [7], [8], [30] - [34]. På grundlag af disse observationer, især vi registreret en høj frekvens af XAF1
DNA methylering i mavekræft væv (83,2%), besluttede vi at undersøge muligheden for at bruge XAF1
promotor methylering i serummet som biomarkør i mavecancerpatienter. Først viste vi en stor konsekvens at opdage XAF1
methylering mellem sera og primære mavekræft væv. Næste vi analyseret muligheden for at anvende cirkulerende methyleres XAF1
som en diagnostisk markør ved hjælp ROC-analyse. AUC (areal under kurven) af 0,909 viste en høj diagnostisk værdi detektere XAF1
methylering i serumprøver. Derfor tyder vore data, at detektion af XAF1
methylering i cirkulerende DNA kunne anvendes som en ikke-invasiv biomarkør til diagnosticering af gastrisk cancer. Derudover vores resultater viste også, at positive XAF1
methylering i serum var en uafhængig prognostisk faktor; forudsige dårlig prognose. Mere interessant, overgang fra negativ til positiv af cirkulerende XAF1
methylering efter operationen var signifikant associeret med tumor tilbagefald. Disse data indikerer, at detektion af XAF1
methylering i cirkulerende serum-DNA også kan være en tumor biomarkør for at forudse mavekræft patienternes prognose og til overvågning af tumortilbagevenden efter kirurgi behandling. Da antallet af patienterne gennemgik denne opfølgende serum undersøgelse var lille, er der behov for yderligere forskning i en stor stikprøve af patienternes nummer for at bekræfte dette interessante fund og optimere strategien og protokollen til dette formål. Under alle omstændigheder, sammenligning med de traditionelle måder såsom gastroskopi undersøgelse for mavecancerpatienter, det mest bemærkelsesværdige egenskab af cirkulerende methyleret XAF1
detektion er effektiv, hurtig, billig, ikke-invasiv, ikke ødelægger miljøet, høj diagnostisk komfortabel hastighed og så videre, og som sådan demonstrerer vigtige anvendelse udsigter i fremtiden.

konklusioner

dysfunktion af XAF1
er hyppig og reguleres gennem XAF1
promotor hypermethylering i mavekræft. Cirkulerende methylerede XAF1
DNA var forbundet med tumor byrde og ondartet progression, som kan være en værdifuld biomarkør til diagnosticering af mavekræft, forudsige patienternes prognose og overvågning tumor tilbagefald efter operation behandling.

Støtte Information
figur S1.
jpg. A, XAF1
genekspression niveau var lavere i fremskreden mavekræft (Stage III /IV) end i begyndelsen af ​​gastrisk cancer (fase I /II). B, XAF1
genekspression niveau var lavere i dårligt differentieret gastrisk kræft end at i godt /moderat (godt /Moderator) differentierede gastrisk kræft, s <
0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067195.s001
(TIF)
Figur S2.
jpg. Korrelation analyse af XAF1
hypermethyleringsassocierede resultater mellem GC væv og parret perifert blod (sera)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067195.s002
(TIF)
tabel S1.
xls. Multivariat overlevelse analyse af klinisk-patologiske data fra 202 gastrisk karcinom sager.

• PLoS ONE: En ny underklassificering af pt4 Gastric Cancer Ifølge Bredde på serosa Invasion
• PLoS ONE: Janus-kinase 2 Polymorfier er forbundet med risiko hos patienter med mavekræft i en kinesisk Population