PLoS ONE: De doorgeven Brandspiritus XAF1 DNA Geeft Poor Prognose voor maagkanker

De abstracte

Achtergrond

gemethyleerde DNA in vloeistoffen kunnen een geschikte biomarker voor kankerpatiënten. XAF1
is aangetoond dat ligt vaak neerwaarts gereguleerd in menselijke maagkanker (GC). Hier hebben we onderzocht of XAF1
methylatie in GC kan een nuttige biomarker zijn.

Methods

Real-time RT-PCR werd gebruikt voor het detecteren XAF1
mRNA expressie; immunohistochemie en Western blot gebruikt om XAF1 eiwitexpressie in weefsels GC onderzocht (n = 202) en de bijbehorende para-kankerachtige histologisch normale weefsels (PCHNTs). Real-time methylatie specifieke PCR werd gebruikt om te onderzoeken XAF1
promoter methylering in hetzelfde panel van GC weefsels, hun PCHNTs en sera.

Resultaten

We bevestigd frequent XAF1
neerwaartse regulatie van zowel mRNA en eiwitniveaus in GC weefsels in vergelijking met normale controles en PCHNTs. XAF1
hypermethylatie werd bewezen in 83,2% (168/202) van de GC weefsels en 27,2% (55/202) van PCHNTs, terwijl er geen methylatie in de 88 normale controles werd ontdekt. De methylatie niveau GC weefsels was significant hoger dan in PCHNTs ( p <
0,05). De hypermethylatie van XAF1
significant gecorreleerd met de down-regulatie van XAF1
in GC weefsels in zowel mRNA en eiwit niveaus ( p Restaurant < 0,001 per stuk). Bovendien hebben we ontdekt hoge frequentie van XAF1
methylatie (69,8%, 141 van de 202) in de sera DNA van dezelfde patiënten, terwijl de sera DNA van 88 niet-tumor controles waren negatief voor XAF1
methylatie. De XAF1
methylatie in zowel GC weefsels en in de sera zou een goede biomarker voor de diagnose van GC (AUC = 0,85 voor weefselherstel en AUC = 0,91 voor sera) en significant gecorreleerd met een slechtere prognose ( p Restaurant < 0,001). Bovendien, na de operatie negatief-to-positieve overgang van de XAF1
methylatie in sera sterk geassocieerd met tumor recidief.

Conclusies

1) Dysfunction van XAF1
is frequent en wordt gereguleerd door de XAF1
promoter hypermethylatie; 2) Detectie van circulerende gemethyleerd XAF1
DNA in het serum kan een nuttig biomarker in de diagnose, het evalueren van de patiënt uitkomst (prognose en herhaling) voor GC patiënten

Visum:. Ling ZQ, Lv P , Lu XX, Yu JL, Han J, LS Ying et al. (2013) De doorgeven Brandspiritus XAF1
DNA Geeft Poor Prognose voor maagkanker. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10.1371 /journal.pone.0067195

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 12 maart 2013; Geaccepteerd: 16 mei 2013; Gepubliceerd: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Ling et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie ​​van het Science and Technology General Project van de provincie Zhejiang (nr. 2009C33143), en deels door een subsidie ​​van de Backbone Talent van de provincie Zhejiang Medicine and Hygiene Platform Programs (no. 2011RCA009). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de meest voorkomende kankers in China met een hoge incidentie en mortaliteit ongeveer goed voor 10% van alle maligniteiten [1]. Maag tumorgenese is een ingewikkelde, verschillende stappen waarbij veranderingen van vele genen [2]. Afwijkende promotor-methylering is een van de belangrijkste mechanismen enkele tumorsuppressorgenen en tumor gerelateerde genen te stoppen en speelt zeer belangrijke rol in de pathogenese en progressie in menselijke kankers [3], [4] - [6], zoals maagkanker [7] [8]. Ondertussen, de opslag van gegevens sterk gesuggereerd dat DNA methylatie nuttige en krachtige biomarker in kankerrisico evaluatie [5], [7], vroege diagnose zou kunnen zijn [7], het voorspellen van de prognose van patiënten [7], [8], en het evalueren van de gevoeligheid voor chemotherapeutica [9]. Onze recente studie en andere onderzoeken aangetoond dat het opsporen van circulerend gemethyleerd DNA in het bloed is een krachtige en praktische aanpak voor kankerpatiënten [7], [10], [11].

X-gebonden remmer van apoptose ( XIAP
) geassocieerde factor 1 ( XAF1
) is een nieuwe negatieve regulator van de XIAP
, die XIAP de bescherming rol keert op tumorcellen [12] - [14]. Het verlies van XAF1
expressie render tumorcellen resistentie tegen apoptose en bevorderen overleving van tumorcellen [14] - [17]. Disfunctie van XAF1
is gemeld bij verschillende menselijke kankers waarschijnlijk door middel van promoter methylering [15] - [19], hetgeen duidt op het belang ervan in het ontstaan ​​van tumoren. In menselijke maagkanker, XAF1
is gemeld herhaaldelijk, significant worden neerwaarts gereguleerd en deze neerwaartse regulatie van XAF1
waarschijnlijk door middel van DNA hypermethylatie van specifieke CpG [15], [16 ], [18]. Er zijn echter geen verslag is beschikbaar over XAF1
methylatie in het bloed en zijn potentieel als biomarker. In de huidige studie onderzochten we XAF1
promoter methylering in gepaarde weefsel en serum monsters uit een groot paneel van de patiënten met maagkanker en geëvalueerd circuleren gemethyleerd XAF1
als een potentiële biomarker voor maagkanker .

Materiaal en methoden

Ethics Verklaring

De geïdentificeerde menselijke weefselmonsters en sera werden verkregen van de provincie Zhejiang Human tissue Specimen Bank. Het gebruik van specimens werd goedgekeurd door de Institutional Review Board in de provincie Zhejiang kanker ziekenhuis. Schriftelijke toestemming werd verkregen van elke patiënt in overeenstemming met de eisen van de raad van bestuur van de ethiek van onze instelling. 88 niet-kanker vrijwilligers mits schriftelijke informed consent. Een deel van de monsters waren afkomstig uit de provincie Zhejiang People's Hospital en de Eerste People's Hospital van Chunan County. De Institutional Review Board voor de medische ethiek van de provincie Zhejiang People's Hospital en de Eerste People's Hospital van Chunan County ingestemd met de methode van het monster collectie met inbegrip van schriftelijke geïnformeerde toestemming van alle patiënten, respectievelijk.

Tissue Specimen

gepaarde tumor en para-kankercellen histologische normale weefsels (PCHNT) monsters werden verzameld op het moment van de operatie van 202 patiënten met primaire adenocarcinoom van de maag in de provincie Zhejiang kanker ziekenhuis, de provincie Zhejiang People's Hospital en de eerste People's Hospital van Chunan County vanaf januari 2008 tot december 2009. de PCHNT werd microscopisch onderzocht op de aanwezigheid van normale cellen en de afwezigheid van dysplastische cellen. Geen van deze gevallen had een medische behandeling voor de operatie ondergaan. Demografische, klinische en histopathologische parameters van deze gevallen werden in tabel 1 getoond De groeipatroon van tumorcellen werd volgens classificatie Ming's [20]. Alle aangeworven patiënten waren opgevolgd periodiek tot de vervaldag. Antrale slijmvlies biopsie monsters van 88 niet-kanker vrijwilligers door gastroscopie werden willekeurig verzameld als controles binnen dezelfde termijn, met inbegrip van 54 mannen en 34 vrouwen, met een gemiddelde leeftijd van 52,9 jaar oud. Onder deze vrijwilligers werden 48 patiënten met chronische niet-atrofische gastritis. Ondertussen werden de paren serummonsters verzameld voor de operatie of endoscopie.

Analyse van Helicobacter pylori ( H. Pylori
) Infectie

werden verkregen van alle patiënten die endoscopisch onderzoek had . H
. pylori
status werd bepaald door een snelle urease test- en Giemsa kleuring methoden [21], [22]. Het werd beschouwd als H
. pylori
infectie wanneer beide tests waren positief, en de monsters met interne positief werden uitgesloten voor statistische analyse [22].

Real-time RT-PCR

Het mRNA expressie van XAF1
werd geanalyseerd door real-time RT-PCR [23]. Totale RNA's werden geëxtraheerd met de Trizol (Gibco). Een totaal van 3 ug totaal RNA werd onderworpen aan omgekeerde transcriptie met behulp van M-MLV reverse transcriptase (Promega). De glyceraldehyde fosfaat dehydrogenase ( GAPDH
) werd geselecteerd als de interne referentie. De sequenties van XAF1
primers waren als volgt: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R) 5'GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3'. GAPDH
primersequenties waren als volgt: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. De 2 ^{-ΔΔCt werd gebruikt om relatieve veranderingen in genexpressie te berekenen.}

immunohistochemische kleuring

De expressie van XAF1 eiwit werd bepaald door immunohistochemische analyse met XAF1 monoklonaal antilichaam (Santa Cruz Biotechnology ). Immunohistochemische kleuring voor XAF1 werd uitgevoerd met representatieve paraffine ingebedde monsters van 202 patiënten GC. Na deparaffineren, antigeenterugtrekking in 0,01 M citraatbuffer, en inactiveren van endogene peroxidase activiteit in 3% H _{2O 2 /methanol, we geïncubeerd dia met antilichaam voor XAF1 bij 4 ° C overnacht en immunohistochemische kleuring na een standaard avidinbiotin-peroxidasecomplex techniek werd uitgevoerd met 3,3'-diaminobenzidine (DAB) als het chromogeen. Kernen werden tegengekleurd met hematoxyline. De immunohistochemische kleuring score (ISS) wordt bepaald door drie onafhankelijke pathologen combineren kleuring frequentie en intensiteit als volgt [24], [25]: geen kleuring wordt gescoord als 0, 1~10% van de cellen gekleurd gescoord als 1, 11~50% zoals 2, 51~80% als 3 en 4. 81~100% als kleurintensiteit wordt beoordeeld op een schaal van 0 tot 3, met 0, negatief; 1, zwak; 2, matig; en 3, sterk. Wanneer er multifocale immunoreactiviteit en er zijn significante verschillen in kleuring intensiteit tussen foci, werd het gemiddelde van de minst en meest intense intense kleuring geregistreerd. De ruwe gegevens werden omgezet naar het ISS door de frequentie score en de kleurintensiteit score te vermenigvuldigen. Theoretisch, het ISS kan variëren van 0 tot 12. ISS van 9~12 werd beschouwd als een sterke immunoreactiviteit werd 5~8 gematigd beschouwd, 1~4 werd zwak beschouwd, en 0 werd gescoord als negatief. Sectie waarin de kleuring niet goed kon worden gekarakteriseerd werden als twijfelachtig.}

Western blotanalyse

gepaarde tumor en PCHNT specimens van 20 gevallen werden willekeurig geselecteerd uit 202 maagkankerpatienten voor western blot analyse. Totaal eiwit werd geëxtraheerd en gekwantificeerd met behulp van de Lowry methode [26]. Western blot analyse werd uitgevoerd met behulp van anti-XAF1 monoklonale antilichamen (Santa Cruz, CA) volgens eerdere rapport [6]. β-tubuline werd diende als een interne controle.

DNA Extraction, bisulfiet Wijziging en real-time Methylering Specifieke PCR (MSP)

Serial 5 mm secties vervat carcinoma en niet-neoplastische weefsels werden gemonteerd op niet-beklede glasplaatjes en gedroogd bij 37 ° C overnacht. Na deparaffineren en kleuring met hematoxyline en eosine (H &E), verzamelden we 5000 kernen 5-10 opeenvolgende coupes met een 27G naald. De verzamelde nuclei werden behandeld met 40 ml van 200 mg /ml proteinase K (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) bij 42 ° C gedurende 72 uur. De paramagnetische pareltechnologie (AxyPrep Mag Blood kit gDNA, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) werd gebruikt om genomisch DNA te isoleren uit vers bloed volgens het protocol van de kit. Het protocol bestaat uit de volgende stappen: lysis, binding, wassen en elutie. Verontreinigende stoffen worden verwijderd tijdens de binding en het wassen stappen. De kwaliteit van DNA werd bepaald door de A260 /280 ratio NanoDrop ND-1000 spectrofotometer (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), DNA-integriteit werd gecontroleerd door denaturerende agarosegel elektroforese.

DNA's werden gewijzigd door natrium bisulfiet met de EpiTect bisulfiet kit (Qiagen Inc.) volgens de instructies van de fabriek. Gemodificeerde DNA's werden geanalyseerd door real-time MSP op de ABI7500 PCR (ABI Co.) met de SYBR Premix Taq ExTaq Kit (TaKaRa Co. Ltd). XAF1
methylatie en unmethylation specifieke primers werden als volgt ontworpen: XAF1
(MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1
(UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. Humaan genomisch DNA (NEB) behandeld met SSSI methyltransferase in vitro werd als een positieve controle. Een perifeer bloed DNA van een gezonde persoon werd gebruikt als een negatieve controle. Het percentage gemethyleerd DNA in de monsters werden berekend volgens de voorgaande referenties beschreven [27], [28]. Gemethyleerd DNA index werd gescoord volgens het percentage DNA methylatie; 0, < 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; en 4, > 80%. De index score van 0 wordt beschouwd als DNA unmethylation en scoort 1-4 werden respectievelijk hypermethylated beschouwd, [7], [27]. De 20% afgesneden drempel voor DNA Hypermethylering was gebaseerd op controle normale monsters en interne controles kwaliteit verkregen in de real-time MSP analyse.

Cell Culture and Drugs Behandeling

Human maagkanker cellijnen (AGS en KATO-III) werden gekweekt in RPMI1640-medium aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 100 U /ml penicilline en 100 U /ml streptomycine bij 37 ° C en 5% CO _{2, respectievelijk. Gekweekte cellen werden behandeld met 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-CdR) (Sigma-Aldrich) in een uiteindelijke concentratie van 1,0 pmol /L. Trichostatine A (TSA) (Sigma-Aldrich) bij een eindconcentratie van 20 ng /ml werd toegediend na 5-Aza alleen behandeling of gedurende 24 uur. Cellen werden verzameld en onderworpen aan DNA, RNA en eiwit zuivering en vervolgens geanalyseerd.}

Statistische analyse

SPSS 17.0 statistische software goedgekeurd voor gegevensanalyse. Het tellen van de vergelijking tussen groepen werden onderworpen aan de χ
^{2-test en Fisher's exact test. Overlevingsanalyse werd computered door de Kaplan-Meier-methode en significante niveaus werden beoordeeld door middel van de log-rank test. Een univariate analyse met de Cox regressie model werd gebruikt om vastgestelde prognostische factoren bepalen, en multivariate analyse met de Cox regressie model werd gebruikt om de gecombineerde effecten te verkennen. Voor alle statistische analyses, p
waarden. ≪ 0,05 werden beschouwd als statistisch significant te zijn}

Resultaten

stads regulering van XAF1
in het jeugdwerk Gastric tumoren

Om te onderzoeken XAF1
genexpressieprofiel, we mRNA expressie van de onderzochte XAF1
in 88 niet-kanker vrijwilligers en 202 primaire maagkanker weefsels en de bijbehorende PCHNTs. Zoals getoond in figuur 1A, de XAF1
expressie was significant verlaagd bij maagkanker monsters in vergelijking met die van normale controles en PCHNTs ( p <
0,001). Er was echter geen significant verschil in XAF1
expressie in PCHNTs in vergelijking met controles zonder kanker.

Verder XAF1
expressie was significant lager bij gevorderde tumoren (stadium III /IV) dan vroeg stadium tumoren (fase I /II) ( p <
0,0001 figuur S1A) en was significant lager bij slecht gedifferentieerde tumoren dan die goed /matig gedifferentieerde tumoren ( p <.
0,0001, figuur S1B)

Om XAF1 eiwit te controleren bij maagkanker weefsels, voerden we immunohistochemische analyse in de 202 maagkanker weefsels en de bijbehorende PCHNTs. Nuclear XAF1 uitdrukking was altijd aanwezig in de normale maag epitheel toont hoge immunoreactief scores. De XAF1 eiwit expressie werd gedetecteerd in hoog niveau in 97,5% (197/202) van PCHNTs (Figuur 1B). Echter, hoge expressie van XAF1 eiwit alleen gedetecteerd in 16,8% (34/202) van maagkanker weefsels; meerderheid van maagkanker weefsels afwezig of bij een lage XAF1 eiwit (Figuur 1C). De immunohistochemische bevindingen worden samengevat in tabel 1. De immunohistochemische kleuring score bij maagkanker weefsels was significant lager dan in PCHNTs of normale controles ( p <
0,0001, figuur 1D). Het verlies van XAF1 eiwit significant gecorreleerd met H.
pylori infectie, tumorgrootte, histologische differentiatie, lymfatische invasie, veneuze invasie, invasieve diepte, lymfeknoop metastase metastasen en klinisch stadium (tabel 1) (alle p <
0,05)
.

De resultaten van immunohistochemische 20 maagkanker weefsels werden verder bevestigd door middel van Western blot analyse. De representatieve Western blot resultaten in twee zaken figuur 1E. De relatieve hoeveelheid XAF1 eiwitexpressie werd genormaliseerd naar de β-tubuline van dezelfde monsters. De gemiddelde XAF1 eiwitgehalte in 20 maagkanker weefsels was significant lager dan die in PCHNTs ( p Restaurant < 0,05). (Figuur 1F)

Promotor Hypermethylering van XAF1
in het jeugdwerk maag tumoren

om de moleculaire mechanismen voor het onderzoeken van de XAF1
stilte in maagkanker, pasten we een real-time MSP technologie om de DNA-methylatie status van de XAF1
promoter. De frequentie van de XAF1
hypermethylatie bij maagkanker weefsels, wat overeenkomt PCHNTs en controles niet-kanker waren 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) en 5,7% (5/88) respectievelijk. De hypermethylatie frequentie van XAF1
in kanker is significant hoger dan die in PCHNTs en controles niet-kanker (alle p Restaurant < 0,0001, figuur 2).

Van de nota de gemethyleerde status van XAF1
significant gecorreleerd met enige klinische en pathologische parameters bij maagkanker, zoals lymfeknoop metastase, T-fase H
. pylori
infectie, etc (alle p <
0,05, tabel 2). Geen significante correlatie tussen de hypermethylering van XAF1
en geslacht, leeftijd bij diagnose, tumor en metastasen op afstand werd bewezen (alle p Restaurant > 0,05). (Tabel 2)

XAF1
Promotor Hypermethylering wordt in verband gebracht met zijn Transcriptionele silencing bij maagkanker Cellen

Om de relaties tussen de XAF1
methylatie en XAF1
expressie te onderzoeken, vergeleken we de XAF1
methylatie niveau met XAF1
mRNA-niveau en eiwit niveaus bepalen, hetzij door immunohistochemische analyse (figuur 3A) of western blotting (Figuur 3B) van de Spearman correlatie analyse. Zoals getoond in figuur 3A, XAF1 eiwitexpressie (bepaald door immunohistochemische analyse) in 202 GC weefsels was nauw gecorreleerd met XAF1
mRNA [lg (T /N)] (bepaald met RT-PCR) ( γ
= 0,841, p <
0,0001). Belangrijker, XAF1
methylatie niveau was significant geassocieerd met XAF1
mRNA-niveau ( γ
= - 0.846, p <
0,0001) en XAF1 eiwit level ( γ
= -0,969, p <
0,0001). Vergelijkbare resultaten werden verkregen bij het analyseren van de correlatie van XAF1
promoter methylatie en XAF1 eiwitexpressie bepaald door western blot analyse (figuur 3B). Deze resultaten sterk aangeklaagd dat XAF1
expressie wordt gereguleerd door XAF1
promoter methylering.

5-Aza-CDR Administration Herstelt de expressie van XAF1

Om verder de epigenetische regulatie van de XAF1
meningsuiting, AGS en KATO-III-cellen werden behandeld met 5-Aza-CDR en /of TSA bevestigen. XAF1
mRNA expressie werd gereactiveerd in beide maagkanker cellijnen, begeleid door demethylering van XAF1
promotor (figuur 4), wat aangeeft dat XAF1
wordt transcriptioneel tot zwijgen gebracht in deze cellen door DNA hypermethylering. Interessant is dat TSA behandeling alleen effectief was in het herstellen van XAF1
meningsuiting in AGS en KATO-III zonder noemenswaardige verandering van de XAF1
methylatie niveau, wat suggereert dat histon modificaties kunnen ook worden betrokken bij het reguleren van XAF1
expressie. Echter, toediening van TSA volgende 5-Aza-CDR had een additief effect in het herstellen van genexpressie met een verdere daling van de methylatie niveau van de XAF1
. Deze resultaten zijn in overeenstemming met recente studies gesuggereerd dat TSA een demethylering effect in een gen-specifieke wijze [5] kan hebben. De Western blot analyse met behulp AGS cellen, als voorbeeld, bevestigde de up-regulatie van XAF1 eiwitten na de 5-aza-CdR en 5-aza-CdR /TSA behandelingen (figuur 4).

Detectie van circulerende XAF1
methylering

We hebben geconstateerd hoge frequentie van XAF1
methylatie in primaire maagkanker (83,2%), wat suggereert dat het een goede biomarker kan zijn als XAF1
methylatie kan detecteerbaar zijn in serum. Daarom onderzochten we XAF1
methylatie in de afgedekte serum DNA's uit de 202 GC patiënten. XAF1
methylering werd gedetecteerd in 141 (69,8%) serum DNA's van de 202 maagkanker patiënten (Figuur 5). In tegenstelling, XAF1
methylatie werd niet gedetecteerd in serum DNA's uit de 88 controles niet-kanker.

Vervolgens hebben we bevestigde de consistentie in de XAF1
methylatie tussen tumor weefsels en overeenkomstige serum. In 168 gevallen bleek XAF1
methylatie in tumorweefsels, 141 weergegeven XAF1
methylatie in hun gepaarde serum, het geven van een consistentie van 83,9% tussen hen. En in de 34 maagkanker patiënten zonder XAF1
methylatie in hun maagkanker weefsels, geen methylatie werd gevonden in alle serum DNA's (figuur S2).

XAF1
Methylering als biomarker bij de diagnose van maagkanker

Om de waarde van XAF1
methylering als een biomarker in de diagnose van GC, we uitgezet receiver operating characteristic (ROC) curves en berekende gebied onder de curve te evalueren (AUC) waarden met behulp van DNA-methylatie gegevens van zowel GC weefsels en sera. Zowel de ROC-analyses van XAF1
methylatie in weefsels en sera bleek significant onderscheidend vermogen (figuur 6); de AUC-waarde van weefsels XAF1
methylering was 0,849 (95% betrouwbaarheidsinterval, 0,806-0,892; p Restaurant < 0,0001), de AUC-waarde van serum AXF1
methylatie was 0,909 (95% betrouwbaarheidsinterval, 0,875-0,942; p Restaurant < 0,0001).

Bovendien, zoals XAF1
methylatie status van maagkanker weefsels en de sera significant gecorreleerd met lymfeklier metastase, T-stadium, klinische fase en andere clinico-pathologische parameters (alle p <
0,05, tabel 2)

XAF1
Methylering. gecorreleerd met de prognose van patiënten met maagkanker

de significante correlatie van XAF1
methylering met veel clinico-pathologische parameters (tabel 2) suggereerde dat het kan associëren met de prognose van maagkanker patiënten. Tot aan de vervaldatum van de follow-up, 113 van de 168 patiënten met XAF1
hypermethylatie bij maagkanker weefsels ging een snelle progressie van de ziekte of overleden. De mediane ziektevrije overleving (DFS) was slechts 23,4 maanden. In tegenstelling tot in de 34 patiënten zonder XAF1
hypermethylatie in hun maagkanker weefsel, op slechts 5 patiënten er niet goed uit, en de mediane DFS was 39,6 maanden. Kaplan-Meier-analyse toonde aan dat patiënten met een XAF1
hypermethylatie in hun maagkanker weefsel vertoonde een duidelijk slechtere overleving dan die zonder XAF1
hypermethylering ( p <
0,0001) (zie figuur 7A). Ook Kaplan-Meier-analyse bleek dat patiënten met een positieve serum XAF1
methylatie hadden significant lagere DFS dan die van de patiënten zonder serum XAF1
methylatie ( p Restaurant < 0,0001 ) (Figuur 7B), wat aangeeft dat XAF1
promotor-methylering in serum ongunstig voorspeller voor maagkankerpatiënten.

Cox regressie analyse toonde aan dat XAF1
methylatie in sera is een onafhankelijke factor op de overleving van patiënten: patiënten met een XAF1
methylatie hadden slechtere prognose ( p <
0,0001; Hazard ratio, 5,710; 95% CI, 3.474~9.383). Daarnaast kunnen TNM stadia en leeftijd bij diagnose worden beschouwd als beïnvloedende factor prognose bij maagkanker Alleen als het effect van XAF1
methylatie werd uitgeschakeld. Bovendien circuleren gemethyleerd XAF1
in het bloed had een grotere impact op de prognose dan die in TNM stadia (tabel S1).

Positieve Overgang van circulerende XAF1
Methylering voorspelt Tumor herhaling en slechte prognose

van de 202 patiënten die werden geëvalueerd voor preoperatieve circuleren XAF1
methylatie, kregen 72 patiënten follow-up onderzoek van circulerende XAF1
methylatie 2~5 tijden met tussenpozen van 1~6 maanden na de operatie. Onder 12 recidiverende patiënten, weergegeven 10 patiënten negatief-to-positieve transitie in XAF1
methylatie status van hun sera, de andere twee vertoonden altijd positief voor XAF1
methylatie, wat erop wijst dat het toezicht van de XAF1
methylatie in serum kan een goede marker voor het voorspellen van de tumor recidief (tabel 3)

Discussie

XAF1
( XIAP
zijn. -geassocieerde factor 1) is een nieuw XIAP
bindingseiwit die kunnen verstoren de combinatie van XIAP hotels met caspases, schaft de bescherming ervan op tumorcellen en resulteert in tumorcelapoptose [12] - [ ,,,0],14]. De anti-apoptose functie van de XIAP
wordt bepaald door de verhouding van de expressie niveaus van XIAP
tegen XAF1
[15]. Verminderde expressie of stilte van de XAF1
is een veel voorkomende gebeurtenis in de menselijke tumoren [16] - [19]. In de huidige studie, hebben we eerst bevestigd dat XAF1
genexpressie was significant down-gereguleerd in zowel de mRNA-niveau en eiwit niveau in een groot paneel van de primaire maagkanker weefsels, en de down-regulatie van XAF1
expressie was significant geassocieerd met tumorstadia, metastase enzovoort, wat impliceert verlies van XAF1
functie tumorprogressie. Dit komt overeen met andere onderzoeksrapporten [17] - [19]. Om de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de XAF1
stilte verkennen, onderzochten we XAF1
promoter methylering in een groot paneel maagkanker weefsels ( n
= 202) en de normale controles ( n
= 88) met behulp van een real-time MSP-technologie. We ontdekte een hoge frequentie (83,2%) van de DNA hypermethylatie van XAF1
bij maagkanker weefsels. Het DNA hypermethylatie van XAF1
significant gecorreleerd met de down-regulatie van XAF1
in zowel mRNA en eiwit niveaus bij maagkanker weefsels (figuur 3). Bovendien 5-Aza-CDR behandeling aanzienlijk hersteld XAF1
meningsuiting in XAF1
zwijgen opgelegd maagkanker cellijnen (figuur 4). Deze gegevens suggereren sterk dat veelvuldig down-regulatie van de XAF1
bij maagkanker cellen wordt gereguleerd door de promotor hypermethylering. Interessant behandeling van maagkanker cellen met TSA, een histondeacetylaseremmer herstelde ook XAF1
expressie, alleen of in combinatie met 5-aza-CdR behandeling, wat aangeeft dat histon modificatie ook betrokken kan zijn bij XAF1 <. br> verordening

DNA methylering kan worden gebruikt als een potentiële tumor biomarker in verschillende menselijke kankers [3] - [11], [23]. De aanwezigheid van celvrij circulerend DNA in perifeer bloed is beschreven in patiënten met kwaadaardige processen en actieve vrijgave van tumor DNA in de circulatie is gemeld [29] - [31]. Talrijke studies hebben tumorspecifieke veranderingen aangetoond in circulerend DNA teruggewonnen uit plasma of serum van patiënten met verschillende tumoren die met genetische veranderingen die in primaire tumoren, een bevinding die potentieel moleculaire diagnose en prognose [29] heeft - [32]. De nucleïnezuurmarkers circulerende DNAs beschreven onder oncogene mutaties microsatelliet veranderingen, genherschikkingen en epigenetische veranderingen, zoals afwijkende promotor hypermethylatie [7], [8], [30] - [34]. Op basis van deze waarnemingen, vooral gedetecteerd we een hoge frequentie van XAF1
DNA-methylatie bij maagkanker weefsels (83,2%), hebben we besloten om de mogelijkheid te verkennen te gebruiken XAF1
promoter methylering in het serum als biomarker bij maagkankerpatiënten. Ten eerste hebben we aangetoond een grote consistentie in het opsporen van XAF1
methylatie tussen sera en primaire maagkanker weefsels. Volgende analyseerden we de mogelijkheid van het gebruik circuleren gemethyleerd XAF1
als een diagnostische marker met behulp van ROC-analyse. De AUC (gebied onder curve) van 0,909 toonde een hoge diagnostische waarde van het opsporen van XAF1
methylatie in serummonsters. Daarom onze gegevens suggereren dat de detectie van XAF1
methylatie in circulerend DNA kan worden gebruikt als een niet-invasieve biomarker voor de diagnose van maagkanker. Bovendien, onze resultaten toonden ook aan dat positieve XAF1
methylatie in het serum was een onafhankelijke prognostische factor; het voorspellen van een slechte prognose. Interessanter is de overgang van negatief naar positief van circulerende XAF1
methylering na de operatie was significant geassocieerd met tumor recidief. Deze gegevens aan dat detectie van XAF1
methylatie circulerende serum DNA ook een tumor biomarker voor het voorspellen van de prognose maagkanker patiënten en de controle op de tumor recidief na chirurgische behandeling. Aangezien het aantal patiënten ondergingen deze follow-up onderzoek serum was klein, verder onderzoek in een grote steekproef van het aantal patiënten nodig om deze interessante bevinding te bevestigen en de strategie en protocol hiervoor optimaliseren. In elk geval, te vergelijken met de traditionele manieren zoals gastroscopie opsporing van maagkanker patiënten, de meest opmerkelijke eigenschap van circulerende gemethyleerde XAF1
detectie efficiënte, snelle, goedkope, niet-invasieve, niet destructief milieu, high diagnostische conformable rate en ga zo maar door, en als zodanig aan te tonen belangrijke toepassing vooruitzichten in de toekomst.

Conclusies

Dysfunction van XAF1
is frequent en wordt gereguleerd door de XAF1
promoter hypermethylering bij maagkanker. Circuleren gemethyleerd XAF1
DNA werd geassocieerd met tumorlast en maligne progressie, die een waardevolle biomarker voor de diagnose van maagkanker kan zijn, het voorspellen van de prognose van patiënten en het toezicht op de tumor recidief na chirurgie behandeling.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
jpg. A, XAF1
genexpressie niveau was lager in gevorderde maagkanker (stadium III /IV) dan die in het begin van maagkanker (Fase I /II). B, XAF1
genexpressie niveau was lager in slecht gedifferentieerde maagkanker dan die in goed /matig (nou ja /Mod) gedifferentieerde maagkanker, p <
0.05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067195.s001
(TIF)
Figuur S2.
jpg. Correlatie analyse van de XAF1
hypermethylering resultaten tussen GC weefsels en gepaarde perifere bloed (sera)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067195.s002
(TIF)
Tabel S1.
xls. Multivariate survival analyse van clinico-pathologische gegevens van 202 maagcarcinoom gevallen.

• PLoS ONE: Een nieuwe onderverdeling van pT4 maagkanker Volgens de breedte van serosale Invasion
• PLoS ONE: Janus Kinase 2 polymorfismen geassocieerd met het risico bij patiënten met maagkanker in een Chinees Population